枯草芽孢杆菌在生物发酵中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物发酵工程领域，尤其涉及枯草芽孢杆菌在生物发酵中的应用。


背景技术：

2.随着化肥在农业应用中的逐步推广，虽然带来了增产增收等有利作用，也带来了很多环境问题，如土壤板结、土地酸化和土壤肥力下降等，化肥中含有的重金属和激素对人体健康也造成了极大威胁，因此化肥的使用受到越来越多的限制。有机肥是一种环保肥料，可以提高作物产量，改善作物品质，同时施用有机肥可以避免土壤板结、酸化情况。因此有机肥需求量日益增大，有机肥生产规模也日益庞大。然而，如何提高有机肥的肥力，特别是在提高肥力的同时还能抑制病虫害的发生，是本领域亟待解决的技术问题。
3.本发明申请人的在先授权专利cn111732483b公开了一种浒苔生物肥的发酵方法；包括步骤：水解多糖，接种发酵和生物肥的制备；本发明采用一种负载型杂多酸水解助剂在双氧水和无机盐存在的条件下，将浒苔细胞表面浒苔多糖溶解，解离被包裹的藻体纤维素和蛋白等物质，有效释放浒苔内部的营养元素，能够有效地促进作物的生长和品质的提高；该授权发明以来源广泛，生物资源量巨大的大型绿潮藻浒苔固体为主要原料，采用发酵的方法制备一种生物肥，具有产物转化率高，适宜规模化制备的特点；发酵的方法具有生物安全性好，对环境不存在潜在危害，产物的活性成分含量高以及快速高效专一的特点。然而，上述授权专利所采用的微生物为细菌粉末、真菌粉末、放线菌粉末按照质量比0.8
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1.5:0.6
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1.1:1配制，存在成本高、发酵时间长等缺点。而且，其发酵所产生的浒苔生物肥虽然对农田内丝瓜的主根平均长度和瓜蔓平均长度有较高的促进作用，但是，其对于提高丝瓜产量以及提高丝瓜单重仍然有进一步改进的空间。
4.芽孢杆菌作为土壤和植物微生态区系的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。许多性状优良的分离菌株已经成功应用于植物病害生物防治领域。枯草芽孢杆菌通过定殖到植物根际、体表或体内，与病原菌竞争养分，并分泌抗菌物质来抑制病原菌生长；同时诱导植物的防御系统来抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。
5.本发明申请人的在先专利申请cn111733119a公开了一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵方法，该方法具体步骤包括：枯草芽孢杆菌摇瓶培养，接种到一级种子罐，温度30
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35℃，转速160～200rpm/min，ph为6.7～7.9条件下发酵培养18h，作为二级培养种子液接种到二级种子罐温度30～35℃，转速160～200rpm/min，ph为6.7～7.9条件下发酵培养36h，作为发酵种子液接种到发酵罐，温度30～35℃，转速160～200rpm/min，ph为6.7～7.9条件下发酵培养48h，得到枯草芽孢杆菌高密度发酵液。
6.本发明的发明人在后期研究过程中发现，以高密度枯草芽孢杆菌作为浒苔的发酵微生物，能够进一步提高浒苔生物肥的肥力，特别是有助于提高丝瓜产量，同时提高丝瓜单重。


技术实现要素：

7.本发明是为了解决上述不足，提供了一种枯草芽孢杆菌在生物发酵中的应用，通过使用枯草芽孢杆菌，有助于提高浒苔生物肥的肥力。本发明采用如下技术方案：本发明涉及一种枯草芽孢杆菌在生物发酵中的应用，所述枯草芽孢杆菌以浒苔为原料发酵制备浒苔生物肥，其包括如下步骤：步骤一、浒苔通过如下步骤进行预处理：水解多糖，选取100
‑
200份的浒苔，初步切碎后放入到水解釜中，加入20
‑
50份的水，0.1
‑
0.5份的无机盐，2
‑
8份的双氧水和0.1
‑
0.6份的负载型杂多酸水解助剂，混合搅拌均匀后，在50℃
‑
80℃下反应2
‑
6小时，反应结束后降温到室温；所述负载型杂多酸水解助剂采用11
‑
溴十一基三甲氧基硅烷对钛硅分子筛进行表面处理；所述负载型杂多酸水解助剂，其制备方法如下：按照质量份数，将100
‑
150份的钛硅分子筛浸渍在200
‑
400份的质量份数为3.5%
‑
7%的盐酸溶液中，控温40℃
‑
60℃处理10
‑
15h，洗涤后分散到600
‑
1000份的去离子水中，加入15
‑
20份的二水合钨酸钠，1
‑
4份的11
‑
溴十一基三甲氧基硅烷，搅拌混合20
‑
30min；调节溶液ph值为6
‑
8，继续搅拌60
‑
120min，转入高压反应釜中在120℃
‑
150℃下反应5
‑
10h，完成后冷却至室温，用0.1
‑
0.5mol/l的磷酸调节体系ph值为2
‑
3，搅拌3
‑
7h，过滤，烘干，得到负载型杂多酸水解助剂；步骤二、生物发酵：接种发酵，降温到室温的浒苔中加入100
‑
200份的水，2
‑
6份的氮磷钾肥，10
‑
15份的豆粕，6
‑
12份的硅藻土，0.5
‑
3份的腐植酸，0.1
‑
0.5份的黄腐酸钾和5
‑
18份的石秸秆，混合均匀后接种0.8%
‑
3%体积的高密度枯草芽孢杆菌，控制发酵温度为30
‑
35℃，发酵4
‑
6天；所述高密度枯草芽孢杆菌是指活菌数为1.0
‑
2.0
×
10
10
cfu/ml的枯草芽孢杆菌；步骤三、将得到的发酵物进行固液分离，得到的滤液部分即是所述的浒苔生物肥。
8.本发明还涉及根据上述应用制得的一种浒苔生物肥。
9.本发明还涉及上述浒苔生物肥在提高丝瓜产量和/或丝瓜单重中的应用。
10.有益效果：本发明通过使用高密度枯草芽孢杆菌发酵制备浒苔生物肥，有助于提高浒苔生物肥的肥力，由此所生产的浒苔生物肥能够有效促进丝瓜生长，有助于提高丝瓜产量和丝瓜单重，具有重要的经济价值。
具体实施方式
11.为了进一步理解本发明，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
12.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
13.实施例1：（1）参照cn111733119a所公开的实施例，培养48h后得到活菌数为1.7
×
10
10
cfu/ml，成孢率为90%的高密度枯草芽孢杆菌。
14.（2）水解多糖，选取100g浒苔，初步切碎后放入到水解釜中，加入20g水，0.1g无机
盐，2g双氧水和0.1g负载型杂多酸水解助剂，混合搅拌均匀后，于50℃反应2小时，反应结束后降温到室温；（3）接种发酵，降温到室温的浒苔中加入100g水，2g氮磷钾肥，10g豆粕，6g硅藻土，0.5g腐植酸，0.1g黄腐酸钾和5g石秸秆，混合均匀后接种0.8%体积的高密度枯草芽孢杆菌，控制发酵温度为32℃，发酵5天；（4）生物肥的制备，将得到的发酵物进行固液分离，得到的滤液部分即是所述的浒苔生物肥。
15.所述的一种负载型杂多酸水解助剂，其制备方法如下：将100g的钛硅分子筛浸渍在200g的质量百分比浓度为3.5%的盐酸溶液中，控温40℃处理10h，洗涤后分散到600g的去离子水中，加入15g的二水合钨酸钠，1g的11
‑
溴十一基三甲氧基硅烷，搅拌混合20min；调节溶液ph值为6，继续搅拌60min，转入高压反应釜中在120℃下反应5h，完成后冷却至室温，用0.1mol/l的磷酸调节体系ph值为2，搅拌3h，过滤，烘干，得到负载型杂多酸水解助剂。
16.所述的无机盐为硫酸锌。
17.所述的双氧水质量百分比浓度为10%。
18.所述的固液分离采用板框式过滤器过滤。
19.实施例2（1）参照cn111733119a所公开的实施例，培养48h后得到活菌数为1.7
×
10
10
cfu/ml，成孢率为90%的高密度枯草芽孢杆菌。
20.（2）水解多糖，选取100g浒苔，初步切碎后放入到水解釜中，加入20g水，0.1g无机盐，2g双氧水和0.1g负载型杂多酸水解助剂，混合搅拌均匀后，于50℃反应2小时，反应结束后降温到室温；（3）、接种发酵，降温到室温的浒苔中加入100g水，2g氮磷钾肥，10g豆粕，6g硅藻土，0.5g腐植酸，0.1g黄腐酸钾和5g石秸秆，混合均匀后接种1.2%体积的高密度枯草芽孢杆菌，控制发酵温度为32℃，发酵5天；（4）生物肥的制备，将得到的发酵物进行固液分离，得到的滤液部分即是所述的浒苔生物肥。
21.实施例3：将丝瓜种植区分为等面积的12个区域，每个区域100株，将12个区域随机分成3组；各使用由实施例与对照组（cn111732483b实施例1）所制备的浒苔生物肥，施用量为每棵植物5g肥料，每7天施用一次，60天后检测农田内丝瓜的具体生长情况，180天内收获丝瓜，以此来表征浒苔生物肥的肥效性能好坏，实验结果如下表所示。
22.表1 生物肥对于丝瓜的影响
ꢀꢀꢀꢀꢀ
组别n（实验重复次数）主根平均长度（cm）瓜蔓平均长度（cm）亩产量（kg）丝瓜单重（g） 实施例1
ꢀꢀ
438.9
±
12.5197.6
±
36.83219
±
123410.3
±
108.3 实施例2
ꢀꢀ
439.2
±
11.8200.3
±
42.93259
±
129416.8
±
113.4
ꢀꢀꢀ
对照组
ꢀꢀ
431.8
±
12.8185.6
±
38.43102
±
153380.3
±
123.8
从上述实验结果可以看出，与对照组相比，本发明的浒苔生物肥能够有效促进丝瓜生长，有助于提高丝瓜产量和丝瓜单重，具有重要的经济价值。
23.以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。