一种交叉引物恒温技术检测MRSA肠毒素的引物、试剂盒及方法与流程

一种交叉引物恒温技术检测mrsa肠毒素的引物、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种交叉引物恒温技术检测mrsa肠毒素的引物、试剂盒及方法。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，是一种引起人类和动物化脓性感染的重要致病菌，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一。随着抗菌药物的滥用，金葡菌对抗菌药物的耐药性日趋严重，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，mrsa)的出现，使临床抗菌药物的选择面临更大压力。金葡菌可分泌对热稳定的肠毒素，常引起食物中毒，造成肠道外感染，甚至对全身各器官组织产生损伤作用，最后发展到多个器官功能障碍，危及患者生命。金葡菌肠毒素a(sea)被认为是引起食物中毒的最主要致病因子，90％以上的食物中毒菌株都携带肠毒素sea基因。与大部分肠毒素不同，sea不受群体感应系统调控，在细菌数目较低时也能产生，而且94ng的sea就能导致食物中毒。在允许食品中较低数目金葡菌存在的同时，有必要对食品中肠毒素sea基因进行检测，来评估食品中污染sea的风险。
3.核酸扩增是核酸分子诊断的关键技术。根据温度变化要求，可以将核酸扩增技术分为pcr技术和恒温扩增技术两大类。pcr技术是指通过精密而复杂的仪器(pcr仪)控制温度的循环变化来实现模板变性、引物杂交和dna合成三个步骤的dna扩增。而恒温扩增技术全过程在同一温度下进行，这一特点使得它对扩增所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，因而具有巨大的应用价值，成为分子诊断行业发展中的热点。目前恒温扩增技术主要有滚环扩增技术(rca)、转录酶扩增技术(tma)、依赖核酸序列扩增技术(nasba)、链置换扩增技术(sda)、环介导的等温扩增技术(lamp)、解链酶扩增技术(hda)等，但上述各种核酸扩增技术均由国外公司所拥有，一定程度上限制了在我国的转化应用。
4.交叉引物恒温扩增(crossing priming amplification,cpa)技术是是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术。反应时间快，检测周期约1小时，使试剂盒可用于检验检疫、突发性传染病的检测与监控现场检测或医院的床边诊断；同时，检测成本低，只需要离心机和一台简单的恒温装置，如普通的水浴锅、金属浴，即可进行扩增；另外，操作简单，对操作人员的技能要求不高，为核酸检测的广泛应用创造了条件。该反应的关键是需要在有限的产物长度中设计出五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此适配度高的引物设计是研发的关键。
5.综上，开发一种高效、便捷、灵敏的能够快速检测mrsa肠毒素sea的试剂盒和方法具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于设计一种mrsa肠毒素sea的cpa检测引物，其灵敏度达到了
300fg/μl，能够解决现有pcr技术灵敏度较低的问题。
7.本发明的另一目的在于提供一种mrsa肠毒素sea的cpa检测试剂盒。
8.本发明的再一目的在于提供一种mrsa肠毒素sea的cpa检测方法。该方法具有反应速度快、检测成本低、操作简便、灵敏度高、特异性强、适合监控现场检测或床边诊断等特点。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：
10.一种mrsa肠毒素sea的cpa检测引物，是针对肠毒素sea设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：
11.肠毒素sea检测引物：
12.靶点剥离引物4s：5
’‑
gcttgtatgtatggtggt
‑3’
(seq id no.1)；
13.靶点剥离引物5a：5
’‑
ctgtaaataacgtcttgc
‑3’
(seq id no.2)；
14.靶点交叉引物2a1s：5
’‑
gaagatccaactcctgaaggctagacggtaaacaaa
‑3’
(seq id no.3)；
15.靶点特异引物2a：5
’‑
gaagatccaactcctgaa
‑3’
(seq id no.4)；
16.靶点特异引物3a：5
’‑
ttcgttttaaccgtttcc
‑3’
(seq id no.5)。
17.一种mrsa肠毒素sea的cpa检测试剂盒，包括上述mrsa肠毒素sea的cpa检测引物。
18.所述试剂盒中，各cpa检测引物的浓度优选10μm；
19.所述的试剂盒还包括如下组分：
20.a、2
×
反应缓冲液：40.0mm的tris
‑
hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；
21.b、bst dna聚合酶；
22.c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；
23.组分b中所述的bst dna聚合酶优选浓度为8u/μl的bst dna聚合酶水溶液。
24.组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：
25.(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mm的氯化锰水溶液；
26.(ii)取25μl、50μm的钙黄绿素溶液与10μl、1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
27.一种mrsa肠毒素sea的cpa检测方法，包括如下步骤：
28.(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od
260
/od
280
值为1.8～2.0；
29.(2)建立检测sea毒素的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应；
30.其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μl，10μm的剥离引物4s和10μm的剥离引物5a各1.5μl，10μm的交叉引物2a1s 2.5μl，10μm的特异引物2a和10μm的特异引物3a各1.25μl，dna模板1.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，加去核酸水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；
31.(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应，然后用肉眼观察颜色变化，如显色为黄色，说明待检样品中不含有mrsa肠毒素sea；如显色为绿色，说明待检样品中含
有mrsa肠毒素sea。
32.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
33.(1)本发明通过选择目标菌株肠毒素sea的特异性序列的保守区域，设计了具有高特异性的一对剥离引物、交叉引物和特异引物，建立了交叉引物恒温扩增反应体系。该技术不需要特殊、昂贵的仪器和试剂，扩增产物不需要凝胶电泳，操作便捷，检测成本低，有效实现对mrsa肠毒素sea的检测。
34.(2)相较于普通pcr，本发明可以降低出现假阳性结果的概率，且在灵敏度方面具有显著优势，检测限可达fg/μl水平，满足对mrsa肠毒素sea致病风险的检测。
35.(3)本发明在恒温条件下进行扩增，反应速度快，1小时左右就可通过荧光染料显色用肉眼直观的对结果进行判断。这对检验检疫、突发性传染病的检测与监控现场检测或医院的床边诊断具有重要意义。
附图说明
36.图1为交叉引物恒温扩增反应技术检测mrsa肠毒素sea的凝胶电泳结果及显色结果图；其中，图a为交叉引物恒温扩增检测mrsa肠毒素sea的凝胶电泳结果(泳道1为mrsa 0613120003，泳道2为mrsa 132963，泳道3为mrsa 0214010085，泳道4为mrsa 0315040330，泳道5为mrsa 0314020129，ng为空白对照)；图b为交叉引物恒温扩增反应技术检测mrsa肠毒素sea的显色结果(1为mrsa 0613120003，2为mrsa 132963，3为mrsa 0214010085，4为大mrsa 0315040330，5为mrsa 0314020129，ng为空白对照)。
37.图2为检测mrsa肠毒素sea特异性的实验结果图；其中，泳道1:mrsa 0613120003，泳道2:mrsa 132963，泳道3:mrsa 0214010085，泳道4:mrsa 0315040330，泳道5:mrsa 0314020129；泳道6：沙门氏菌atcc29629；泳道7：沙门氏菌atcc19585；泳道8：沙门氏菌atcc14028；泳道9：沙门氏菌atcc29629；泳道10：单增李斯特菌atcc19116；泳道11：单增李斯特菌atcc19114，泳道12：单增李斯特菌atcc19115；泳道13：单增李斯特菌atcc15313；泳道14：单增李斯特菌atcc19113；泳道15：铜绿假单胞菌atcc27853；泳道16：大肠杆菌atcc43895；泳道17：大肠杆菌e019；泳道18：大肠杆菌e20；泳道19：大肠杆菌e43；泳道20：大肠杆菌e44；泳道21：副溶血性弧菌atcc17802；泳道22：副溶血性弧菌atcc27969；泳道23：干酪乳杆菌bm
‑
lc14617；泳道24：阴性对照。
38.图3为检测mrsa肠毒素sea灵敏度实验结果图；其中，图a为交叉恒温扩增反应检测mrsa肠毒素sea的灵敏度试验的结果图，泳道1为3.0ng/μl，泳道2为300pg/μl，泳道3为30pg/μl，泳道4为3pg/μl，泳道5为300fg/μl，泳道6为30fg/μl，泳道7为3fg/μl，泳道8为300ag/μl，ng
‑
阴性对照。
具体实施方式
39.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
40.实施例1
41.基于交叉引物恒温扩增技术检测mrsa肠毒素sea的方法，包括以下步骤：
42.1、基于交叉引物恒温扩增技术检测病原微生物的方法，本实施例以mrsa菌为例，
其使用试剂如下：
43.a.浓度各为10μm的剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如前文seq id no.1
‑
seq id no.5所示；
44.b.2
×
反应储液：由浓度为40.0mm的tris
‑
hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)组成；
45.c.浓度为8u/μl的bst dna聚合酶(大片段，neb公司)水溶液；
46.d.钙黄绿素和氯化锰的混合溶液：先配制浓度为50μm的钙黄绿素溶液(二甲基亚砜溶解)；然后取25μl、50μm的钙黄绿素溶液，与10μl、1mm的氯化锰水溶液混合均匀(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。
47.2、使用上述试剂利用交叉引物恒温扩增技术检测mrsa肠毒素sea，包括如下步骤：
48.(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna：
49.本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中mrsa肠毒素sea实验组为mrsa 0613120003，mrsa 132963，mrsa 0214010085，mrsa 0315040330，mrsa 0314020129，所有菌株均可由公开途径获得；
50.采用dna提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司)提取各组细菌dna，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od
260
/od
280
的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。
51.(2)建立检测肠毒素的交叉引物恒温扩增反应：
52.在反应管中配制总体积为26μl的交叉引物恒温扩增反应体系：加入2
×
反应储液12.5μl，4s与5a等体积混合引物混合液3.0μl，交叉引物2a1s 2.5μl，特异引物2a与3a等体积混合液2.5μl，bst dna聚合酶1μl，dna模板1.0μl，用去核酸水补充体积至25μl，最后加入上述浓度的钙黄绿素及氯化锰混合液水溶液1μl，混匀即可。此时各物质浓度为：tris
‑
hcl 20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bst dna聚合酶8u，剥离引物4s、5a各0.6μm，交叉引物2a1s 1.0μm，特异引物2a及3a各0.5μm。将反应管置于63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。
53.(3)显色检测：
54.待反应结束后，用肉眼观察颜色变化。
55.结果如图1所示：空白对照组的颜色为黄色，说明不含有mrsa肠毒素sea；实验组的颜色变为绿色，说明含有mrsa肠毒素sea，随后对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，阳性组呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
56.实施例2
57.交叉恒温扩增反应检测mrsa肠毒素的特异性试验，包括以下步骤：
58.将mrsa肠毒素与非mrsa肠毒素基因组dna按照实施例1中的反应体系和条件建立交叉恒温扩增反应检测方法，进行特异性试验；
59.其中，非mrsa肠毒素为：沙门氏菌atcc29629；沙门氏菌atcc19585；沙门氏菌atcc14028；沙门氏菌atcc29629；单增李斯特菌atcc19116；单增李斯特菌atcc19114，单增李斯特菌atcc19115；单增李斯特菌atcc15313；单增李斯特菌atcc19113；铜绿假单胞菌atcc27853；大肠杆菌atcc43895；大肠杆菌e019；大肠杆菌e20；大肠杆菌e43；大肠杆菌e44；
副溶血性弧菌atcc17802；副溶血性弧菌atcc27969；干酪乳杆菌bm
‑
lc14617。
60.设置mrsa肠毒素sea基因组为阳性对照，去核酸水为阴性对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，加入mrsa肠毒素sea基因组的反应体系呈现梯形条带，阴性组无扩增条带，与预期结果一致。
61.如此表明，基于交叉引物恒温扩增反应检测mrsa肠毒素sea的引物具有较高的特异性。
62.实施例3
63.交叉恒温扩增反应检测mrsa肠毒素sea的灵敏度对比试验，包括以下步骤：
64.交叉恒温扩增反应检测mrsa肠毒素sea的灵敏度试验：
65.将mrsa肠毒素sea的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为3.0ng/μl，300pg/μl，30pg/μl，3pg/μl，300fg/μl，30fg/μl，3fg/μl，300ag/μl，同时设置去核酸水的阴性对照，按照实施例1中的方法构建交叉恒温扩增体系并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定检测方法的灵敏度。
66.结果如图3所示，图a为交叉恒温扩增反应检测mrsa肠毒素sea的灵敏度试验的结果图。从图a中可以看出，样品中dna的浓度高于300fg/μl的均出现了梯形条带，呈现阳性结果。
67.结果表明：建立的mrsa肠毒素sea交叉恒温扩增反应体系可检测样品中300fg/μl的mrsa肠毒素sea。
68.结论：从上述实验结果可以看出，交叉恒温扩增反应扩增方法与常规pcr和荧光pcr具有如下优点：
69.反应时间快：常规pcr和荧光定量pcr的检测在2～4个小时才能出结果，本发明所提供的检测方法1小时就可出现阳性结果，可用于检验检疫、突发性传染病的检测与监控现场检测或医院的床边诊断。
70.检测成本低：无需昂贵精密的仪器，只需要离心机和一台简单的恒温装置，如普通的水浴锅，然后用荧光染料显色直接观测结果，省去了传统的电泳检测步骤。
71.操作简单：对操作人员的技能要求不高，绝大多数人通过简单培训或自学都可掌握，为核酸检测试剂的广泛应用创造了条件。
72.特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，完成了细菌的定性检测。
73.灵敏度高：该技术针对mrsa肠毒素sea的检测限为300fg/μl，灵敏度比常规pcr技术高10～1000倍。
74.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。