水溶性线粒体靶向乙氧基溴丙基咪唑轴向取代硅酞菁及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于配合物领域，尤其属于水溶性线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁及其制备方法和应用，该配合物作为抗癌光敏剂。该配合物作为光敏剂应用于线粒体靶向标记和荧光成像引导光动力治疗。


背景技术：

2.光动力疗法（photodynamic therapy，pdt）是一种治疗癌症，hiv和湿性黄斑变性类疾病的新方法。光动力治疗的关键是光敏剂。酞菁配合物因单线态氧量子产率高、结构稳定易于修饰、最大吸收波长位于670 nm左右、易透过人体组织的红光区域且易制得纯品等优点，被认为是一类很有应用潜力的光敏剂。然而由于酞菁的水溶性差，在生理环境中容易聚集影响其单线态氧的生成速率，从而影响其光动力治疗的效果，限制了其在光动力疗法中的应用。酞菁的另一个缺点是对肿瘤细胞的靶向富集能力有限。由于酞菁对肿瘤细胞的靶向富集能力有限，从而减少肿瘤细胞对酞菁的摄取，并对正常组织产生毒副作用，极大地限制了其在光动力疗法的应用。
3.针对酞菁分子易聚集和水溶性差问题，本发明拟在酞菁的轴向位置引入带正电荷的1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑基，轴向庞大的空间位阻和正电荷取代基之间的排斥作用赋予酞菁水溶性以及减少酞菁在水溶液中的聚集行为；另一方面，亲脂性阳离子咪唑基可以与负电荷线粒体膜结合，实现线粒体靶向。目前国内外还没有有关水溶性线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁配合物的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种水溶性线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁及其制备方法。
5.本发明还提出一种二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁作为线粒体靶向标记和荧光成像引导光动力治疗光敏剂的应用。
6.本发明的目的是这样实现的，本发明所述的一种二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁，为下述结构的化合物：
7.本发明所述的水溶性线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁配合物：是将带正电荷的1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑基引入到硅酞菁的轴向位置，合成一种新型水溶性二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁配合物。一方面，将带正电荷的1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑基引入硅酞菁的轴向位置，可以赋予酞菁水溶性和增大酞菁的空间位阻，同时利用其正电荷取代基之间排斥作用，在一定程度上抑制酞菁的聚集行为；另一方面，将亲脂性阳离子咪唑基引入酞菁轴向位置，有利于正电荷酞菁与负电荷线粒体膜结合，实现线粒体靶向。因此，二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁成为一类具有线粒体靶向标记和荧光成像引导光动力治疗的潜在光敏剂。
8.本发明所述的一种线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁的制备方法，包括如下步骤：(1) 1
‑
(2
‑
羟乙基)咪唑和1,3
‑
二溴丙烷在乙腈中回流搅拌反应制备1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑；（2）1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑和二氯硅(ⅳ) 酞菁在无水k2co3存在下、甲苯中回流搅拌反应制备二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁配合物。
9.本发明所述的二氯硅酞菁是采用1, 3
‑
二亚氨基异吲哚啉、四氯化硅和喹啉在240℃下搅拌回流1 h，当反应液降至70℃时，将其倾入甲醇中，得到紫色沉淀，趁热过滤，沉淀分别用甲苯、喹啉、甲醇以及丙酮洗涤，真空干燥后得纯品。
10.本发明所述的1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑 (本发明将1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑简称为br
‑
id）优选1
‑
(2
‑
羟乙基)咪唑和1,3
‑
二溴丙烷在乙腈溶液中80 ℃搅拌回流24 h。反应结束后，冷却静置8 h，有白色固体析出。用乙腈和二氯甲烷等有机溶剂洗涤固体数次，真空干燥得白色固体。
11.本发明所述的一种线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁 (本发明将二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁简称br
‑
id
‑
sipc) 优选二氯硅 (iv) 酞菁和1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑在无水k2co3存在下、甲苯溶液中140 ℃搅拌回流48 h。反应结束后，冷却至室温，过滤，并用乙醇和甲醇洗涤沉淀数次，收集滤液。滤液经减压旋蒸除去溶剂，粗产物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇，干燥后得蓝色粉末。
12.本发明所述的一种线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁作为线粒体靶向标记和荧光成像引导光动力治疗酞菁光敏剂的应用。
13.本发明的有益效果：与以前申请的带正电荷的二
‑
(3,5
‑
二(1',3'
‑
甲基吡啶丙氧
基)苯甲氧基)轴向取代硅酞菁和二
‑
(3,5
‑
二(1',4'
‑
异喹啉丁氧基)苯甲氧基)轴向取代硅酞菁相比较，本发明合成一种新型具有线粒体靶向标记和荧光成像引导光动力治疗的二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁。一方面可以利用正电荷的1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑取代基的空间位阻和静电排斥作用在一定程度上抑制酞菁的聚集行为以及提高酞菁的水溶性；另一方面将亲脂性阳离子1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑取代基引入到酞菁的轴向位置，可以提高正电荷酞菁与负电荷线粒体膜相互作用，有利于酞菁定位线粒体。同时，1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑基可以调控酞菁的光物理性质和药代动力学性质，赋予二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁线粒体靶向标记和荧光成像引导光动力治疗性质。
附图说明
14.图1为二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁（br
‑
id
‑
sipc）在卵巢癌细胞中的荧光成像和线粒体定位图。
15.图 2 为二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁（br
‑
id
‑
sipc）对卵巢癌细胞的离体光动力活性图。
具体实施方式
16.下面结合实施例对本发明进行详细说明：具体实施例一1）二氯硅酞菁（sipccl2）的合成在250 ml的三颈烧瓶中分别加入1, 3
‑
二亚胺基异吲哚啉（7.28 g, 50.15 mmol），四氯化硅 （8.30 ml）和喹啉 （83 ml），220 ℃时搅拌回流 1 h，当反应液降至70℃时，将其倾入500 ml甲醇溶液，搅拌静置后过滤，沉淀用丙酮、甲醇、二氯甲烷等溶剂洗涤、真空干燥后得紫红色固体 3.68 g，产率为 48.62%。
17.）1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑（本发明简称为br
‑
id）的合成1
‑
(2
‑
羟乙基)咪唑 (0.09 g，0.80 mmol) 和1,3
‑
二溴丙烷 (0.16 g，0.80 mmol) 加入100 ml三口烧瓶中，然后加入30 ml乙腈将其溶解， n2保护下80℃搅拌回流24 h。反应结束后，冷却静置8 h，有白色固体析出，乙腈、二氯甲烷等有机溶剂洗涤固体数次，真空干燥得白色固体0.30 g，产率64.00%。合成表征：ir（kbr/cm
‑1）: 3285, 3068, 1738, 1629, 1564，1447, 1360, 1157, 1053，850, 755, 641, 565; 1
h nmr (d2o
, 400 mhz, δ/ppm): 8.84 (s, 2h; h5), 7.50 (s, 2h; h7), 4.70 (s, 2h; h6), 4.27 (d, j=8 hz, 2h; h3), 3.86 (s, 4h; h
2 ), 2.51~2.47 (t, 1h; h4), 1.98 (s, 1h; h
1 ) ; maldi
‑
tof
‑
ms: m/z calc. for [m] 234, found 234.3）二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁 (本发明简称为br
‑
id
‑
sipc) 的合成1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑（0.30 g，0.98 mmol），二氯硅(iv)酞菁 (0.20 g，0.32 mmol)， 无水k2co
3 (0.09 g，0.65 mmol) 和30 ml甲苯加入100 ml的圆底烧瓶中， 140℃搅拌回流反应48 h。反应结束后，冷至室温，过滤，滤液经减压浓缩得粗产物，粗产物经中性氧化铝进行柱层析分离，以甲醇为洗脱剂纯化2次。干燥后得蓝色粉末0.15 g，产率
46.00%。 合成表征: ir（kbr/cm
‑1): 3399, 1651, 1167, 1110, 1075, 912, 744, 641, 570; 1
h nmr (dmso
‑
d
6, 400 mhz, δ/ppm): 9.67 (m, 8h; h1), 8.49 (m, 8h; h2), 7.54 (m, 4h; h7), 4.25 (m, 2h; h5), 3.86~3.85 (m, 8h; h6), 2.91 (m, 4h; h4), 2.76 (s, 8h; h3). maldi
‑
tof
‑
ms: m/z calc. for [m h3o] 1097, found 1097.具体实施例二：实施例一中，过程2）中，1
‑
(2
‑
羟乙基)咪唑改为0.18 g,，1,3
‑
二溴丙烷改为0.32 g, 其它反应条件相同，产率41.50％。
[0018]
过程３）中，1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑改为0.60 g, 二氯硅(iv) 酞菁改为0.40 g, 其它反应条件相同，产率为35.00%。
[0019]
具体实施例三：实施例一中，过程2）中，1
‑
(2
‑
羟乙基)咪唑改为0.18 g，1,3
‑
二溴丙烷改为0.48 g，产率48.92％。
[0020]
过程３）中，1
‑
(2
‑
羟乙基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑改为0.60 g, 二氯硅(iv) 酞菁改为0.40 g, 反应温度改为150℃，其它反应条件相同，产率为33.85%。
[0021]
线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁(br
‑
id
‑
sipc)在卵巢癌细胞中的荧光成像和线粒体定位将处于对数生长期的ho
‑
8910 卵巢癌细胞消化和离心，dulbecco's modified eagle medium（dmem）细胞培养基重悬和重新计数后，以 1
×
10 4
个每孔（体积为200
ꢀµ
l）的细胞数接种于20 mm 共焦皿中，放入37 ℃恒温培养箱孵育4 h，待细胞贴壁生长后取出共焦皿加入 1 ml dmem 完全培养基，于恒温培养箱孵育20 h。轻轻吸去皿中旧的培养基，用 pbs缓冲溶液润洗细胞2次，用dmem细胞培养基将br
‑
id
‑
sipc稀释1
ꢀµ
m 后与细胞共孵育 6 h，pbs缓冲液彻底冲洗细胞。细胞浓度为 100 nm 的dmem细胞培养基中加入1 ml 50 nm 的商业化线粒体探针mito tracker
tm green fm，于37 ℃避光染色30 min后放到共聚焦显微镜下观察。br
‑
id
‑
sipc：双光子激发，激发波长为 860 nm，采集波长为650
‑
750 nm，mito tracker
tm green fm：单光子激发，激发波长为 488 nm，采集波长为 500
‑
550 nm，见图1。图1为线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁 (br
‑
id
‑
sipc) 在ho
‑
8910卵巢癌细胞中的荧光成像和线粒体定位图。
[0022]
线粒体靶向二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁(br
‑
id
‑
sipc)对卵巢癌细胞的离体光动力活性评价为了考察二
‑
(1
‑
(2
‑
乙氧基)
‑3‑
(3
‑
溴丙基)咪唑)轴向取代硅酞菁（br
‑
id
‑
sipc）的体外光动力效果，选择cell counting kit
‑
8 (cck
‑
8) 细胞活性检测试剂盒开展细胞毒性实验。将 ho
‑
8910 卵巢癌细胞以每孔 8
×
10
3 个的细胞数接入96 孔板中孵育24 h。第二天取出细胞，每孔加入100 ml含有br
‑
id
‑
sipc最终浓度为0、1、2、3、4、5
ꢀµ
m 的 dmem细胞培养基代替旧的培养基孵育 6 h。对孔板中细胞进行激光照射（671 nm，100 mw/cm 2
），光照时间分别为0 min和 10 min，培养4 h后每孔加入 10
ꢀµ
l cck
‑
8细胞活性检测试剂盒，再继续培养 2 h，用酶标仪测试各孔 450 nm od 值。 细胞活性=[od（加药）
‑
od（空白）]/[od（0 加药）
‑ꢀ
od（空白）]
×
100%。