SNP分子标记及其在提高大麦耐盐性中的应用的制作方法

snp分子标记及其在提高大麦耐盐性中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，尤其涉及snp分子标记及其在提高大麦耐盐性中的应用。


背景技术：

2.土壤盐渍化是威胁作物产量、生态环境和农业可持续发展的主要非生物胁迫。在盐胁迫下，植物一般通过改变自身形态结构、调节生理生化物质、平衡能量供应需求等途径增强对盐胁迫的耐受性。目前普遍认为渗透调节、离子平衡和抗氧化防御是植物适应盐胁迫的三大主要耐性机制。探究植物的耐盐性机理对于发展作物育种是至关重要的，同时也会极大的提高作物在盐碱条件下的产量，进一步满足日益增长的全球粮食需求。
3.由于大多数作物对盐敏感，盐胁迫已对全球约4000万公顷可耕地产生影响，每年造成大量作物损失。大麦(hordeum vulgare l.)作为研究作物耐盐机理及耐盐性改良的一种理想模式作物，具有适应性广、耐盐性强、生育期短等特点，且已完成基因组精细测序，同时也是全球第四大禾谷类作物，可用于粮食、饲料和啤酒原料等。
4.植物的耐盐性是由多基因调控的数量遗传性状，定位和克隆耐盐基因是研究作物耐盐遗传机理的基础。连锁分析和关联分析法是当前鉴定与耐盐性相关的遗传位点或等位基因的主要方法。全基因组关联分析(genome wide association study,gwas)是一种有效的鉴定分子标记与表型间关联的方法，已被成功地用于发掘许多与作物重要性状相关的候选基因。经过数年的研究，gwas已经鉴定到了许多与植物耐盐性相关的关键基因，并应用于指导标记辅助育种和作物改良。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供了一种snp分子标记，同时提供了该snp分子标记在筛选大麦耐盐性方面的应用，该分子标记s3h_672049359，应用于筛选不同耐盐性的大麦种质材料，同时在大麦遗传育种领域可用于培育具有较强耐盐性的大麦新品种。
6.具体技术方案如下：
7.本发明提供了一种snp分子标记，所述snp分子标记的位点位于大麦三号染色体第672049359个碱基处；snp碱基差异为c或t。
8.进一步地，所述snp分子标记的序列如seq id no.3所示；
9.即:ctacccgcgaccagtccaaacctcggaggtttgaccttccccttcttcctccttcctccccctctcccctccactcccatctcattctagggtttagggtttaaccgccgacgcgccaccatgcgccacctcgctcgcctcc(/t)tcaaccaccgcctcctcctcccctccaccgccaccccttcctccgccgccgcggccttctccacctccaggcgcgcctcccccaacgcatgccgggcca。
10.进一步地，所述耐盐性的表征指标为大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量。
11.进一步地，本发明根据上述snp位点设计了扩增引物，用于扩增所述snp分子标记的引物对序列，如下所示：
12.上游引物f为：5
’‑
ctacccgcgaccagtcca
‑3’
(seq id no.1)；
13.下游引物r为：5
’‑
acgcatgccgggcca
‑3’
(seq id no.2)。
14.扩增产物为241bp，序列如seq id no.3所示，snp位点位于所述扩增片段的第142bp处。
15.进一步地，本发明还提供了一种用于扩增所述snp分子标记的引物对，序列如下所示：
16.上游引物f为：5
’‑
ctacccgcgaccagtcca
‑3’
；
17.下游引物r为：5
’‑
acgcatgccgggcca
‑3’
。
18.利用上述引物对对不用大麦基因型进行pcr扩增并测序分析，可有效筛选不同耐盐性的大麦种质资源，具体为根部高相对干物重，高钠离子含量的大麦材料在该snp位点上为t类型，而低相对干物重及钠离子含量的大麦材料为c类型。
19.本发明还提供了所述snp分子标记以及所述引物对在大麦分子标记辅助育种中的应用。
20.本发明还提供了所述snp分子标记以及所述引物对在筛选不同耐盐性的大麦种质资源中的应用。
21.具体的，所述应用包括以下步骤：
22.(1)提取大麦植株的基因组dna；
23.(2)以步骤(1)所述基因组dna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增反应(使用vazyme rapid taq master mix)；
24.(3)对扩增产物进行测序，从而进行基因分型和单倍型分析；
25.若snp位点上的碱基为t类型，则该待测大麦植株为高耐盐性材料；若snp位点上的碱基为c类型，则该待测大麦植株为低耐盐性材料。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明通过对大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量全基因组关联分析鉴定对耐盐性有提高作用的snp位点，首次公开了一个与大麦盐胁迫下根部相对干物重及钠离子含量显著相关联的snp分子标记s3h_672049359，该分子标记检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高不同耐盐性大麦品种的鉴定效率。
附图说明
28.图1为实施例1中100份大麦材料根部相对干物重(a)及钠离子含量(b)gwas单倍型分析的箱型图。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本发明提供的分子标记和应用进行详细说明，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
30.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
31.本发明所使用的大麦材料可从浙江大学作物科学研究所得到。本发明所使用生化试剂均为市售。
32.实施例1
33.(1)供试材料
34.利用100份全球大麦微核心种质资源为材料，其中包含34份二棱大麦和66份六棱大麦。
35.(2)性状测定
36.用2％h2o2溶液对大麦种子进行消毒，并置于生长室的湿滤纸上发芽。种子发芽7天后，将幼苗移植到含有五分之一的hoagland溶液(ph 6.0)的15l黑色塑料容器中，水培营养液每3天更换一次。于2019年秋季在浙江大学紫金港校区网室和温室(250μmol
·
m
‑2s
‑1日光灯，23℃14h/18℃10h)进行水培育苗及盐处理试验。
37.在幼苗成长14天时向水培溶液中加入100mm氯化钠，第二天再添加氯化钠至200mm并持续处理两周。用去离子水冲洗植株后取根部，用吸水纸轻轻晾干，在80℃烘箱中干燥3天后测定根部样品干重。在2ml 69％hno3中消化干燥的根样品后采用icp
‑
oes/ms法测定消解液中na

含量。相对干重＝处理干重/对照干重
×
100％。
38.(3)gwas分析及snp分子标记确定
39.结合上述测定的大麦根部相对干物质重、na

含量和该群体的12564个snp标记，采用tassel软件进行gwas分析，结果显示位于三号染色体上的一个snp标记与大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量显著关联，该snp位于三号染色体的第672049359个碱基处，可在两个环境中重复检测，
‑
log10(p)值均大于4，所述snp位点为碱基c/t的差异。
40.(4)单倍型分析
41.结合snp标记与100份供试材料的根部相对干物质重、na

含量表型数据进行单倍型分析，结果如图1所示。其中，snp分型共分为两个组，深色为c型，浅色为t型，t型基因型大麦根部相对干物质重、na

含量显著高于c型大麦基因型。
42.实施例2
43.(1)供试材料
44.利用14份全球大麦微核心种质资源为材料，分别进行盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量的测定及s3h_672049359目标区域的分析。具体如表1所示，包括7份高相对干物质重和钠含量材料及7份低相对干物质重和钠含量材料。
45.表1 14份不同耐盐性的大麦种质材料
46.大麦种质snp检测结果na

含量相对干重指标类型w37t59.710.71高w42t58.730.37高w67t46.820.46高w70t50.410.85高w72t58.301.08高w86t55.470.50高w91t59.290.76高w81c27.140.18低w35c30.340.27低w94c32.540.26低
w97c34.210.22低w44c35.890.34低w16c36.840.15低w15c37.280.18低
47.(2)snp标记的获得
48.根据上述snp位点信息，结合大麦全基因组序列信息，开发snp标记引物，上游引物f为：5
’‑
ctacccgcgaccagtcca
‑3’
；下游引物r为：5
’‑
acgcatgccgggcca
‑3’
，扩增大小为241bp，所述snp位于扩增片段的第142bp处，利用上述引物，对大麦三号染色体672049359处碱基的变异进行检测。
49.(3)dna提取
50.以苗期新鲜叶片为材料，采用ctab法提取dna，详细步骤如下：
51.a)在2ml可立管内放入一大两小用75％乙醇清洗的钢珠并加入400μl ctab提取缓冲液；
52.b)取大麦嫩叶5g左右放入可立管中，放入全自动磨样机中55hz磨样1min后置于65℃水浴1h，每隔15min摇匀，水浴后置于室温冷却；
53.c)加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，并充分摇匀；经10000rpm离心10min，将上清液转入一个新的1.5ml离心管中；
54.d)加入上清液体积2/3预冷的异丙醇，缓慢上下摇匀30s使异丙醇与水层充分混合，在
‑
20℃下静置20min以沉淀dna；
55.e)12000rpm离心4min，弃去上清夜；加入400μl无水乙醇静置20min洗涤dna；
56.f)10000rpm离心ddh2o溶解dna，保存于
‑
20℃待用。
57.(4)pcr
58.pcr扩增反应体系为：2
×
rapid taq master mix(vazyme)25μl,10μmol/lprimer f 1μl,10μmol/l primer r 1μl,100ng/μl模板dna 1μl,无菌水22μl,反应总量50μl。
59.在pcr仪上进行pcr反应,程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3s，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存。
60.(5)反应结束后将反应产物测序进行基因分型鉴定，结果显示snp位点变异如表1所示。
61.以上结果说明我们制备的分子标记可以应用于大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量的分子标记辅助选择，以提高选择的准确度。