新型冠状病毒抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒抗体及其应用。


背景技术：

2.中国将sars-cov-2引起的疾病命名为新型冠状病毒肺炎，世界卫生组织将 sars-cov-2引发的疾病命名为2019冠状病毒病，英文缩写covid-19(corona virusdisease 2019)。
3.冠状病毒由于其不可预测性，可通过飞沫传播、接触呼吸道分泌物等途径传播，带来严重后果，已成为影响人类健康的重大威胁之一。
4.冠状病毒是一类有包膜的rna病毒。病毒的基因组为无节段的单股正链rna，是目前已知最大的rna病毒，编码dna长度约为26-32kb。冠状病毒主要编码结构蛋白s、 m、e、n和非结构蛋白nsp1-16。s蛋白形成同源三聚体，构成病毒颗粒表面的刺突，主要负责与宿主受体的结合。m蛋白可与核衣壳结合，在包膜的形成及装配过程中发挥作用。e蛋白主要负责病毒的组装和释放。n蛋白为核衣壳蛋白，与病毒rna基因组结合。部分冠状病毒还编码he糖蛋白，参与病毒与受体的结合过程。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供新型冠状病毒抗体及其应用。
6.本发明提供了抗体，包括重链和轻链，其特征在于：
7.重链的cdr选自36个cdrs中的至少一个；36个cdrs的序列分别如下：seq id no：61、seq id no：62、seq id no：63、seq id no：67、seq id no：68、seq id no： 69、seq id no：73、seq id no：74、seq id no：75、seq id no：79、seq id no： 80、seq id no：81、seq id no：85、seq id no：86、seq id no：87、seq id no： 91、seq id no：92、seq id no：93、seq id no：97、seq id no：98、seq id no： 99、seq id no：103、seq id no：104、seq id no：105、seq id no：109、seq id no： 110、seq id no：111、seq id no：115、seq id no：116、seq id no：117、seq id no：121、seq id no：122、seq id no：123、seq id no：127、seq id no：128、seq id no：129；
8.轻链的cdr选自36个cdrs中的至少一个；36个cdrs的序列分别如下：seq id no： 64、seq id no：65、seq id no：66、seq id no：70、seq id no：71、seq id no： 72、seq id no：76、seq id no：77、seq id no：78、seq id no：82、seq id no： 83、seq id no：84、seq id no：88、seq id no：89、seq id no：90、seq id no： 94、seq id no：95、seq id no：96、seq id no：100、seq id no：101、seq id no：102、seq id no：106、seq id no：107、seq id no：108、seq id no：112、seq idno：113、seq id no：114、seq id no：118、seq id no：119、seq id no：120、seqid no：124、seq id no：125、seq id no：126、seq id no：130、seq id no：131、 seq id no：132。
9.具体的，重链的三个cdr为如下(a1)至(a12)中任一所述：
10.(a1)依次如seq id no：61、seq id no：62和seq id no：63所示；
11.(a2)依次如seq id no：67、seq id no：68和seq id no：69所示；
12.(a3)依次如seq id no：73、seq id no：74和seq id no：75所示；
13.(a4)依次如seq id no：79、seq id no：80和seq id no：81所示；
14.(a5)依次如seq id no：85、seq id no：86和seq id no：87所示；
15.(a6)依次如seq id no：91、seq id no：92和seq id no：93所示；
16.(a7)依次如seq id no：97、seq id no：98和seq id no：99所示；
17.(a8)依次如seq id no：103、seq id no：104和seq id no：105所示；
18.(a9)依次如seq id no：109、seq id no：110和seq id no：111所示；
19.(a10)依次如seq id no：115、seq id no：116和seq id no：117所示；
20.(a11)依次如seq id no：121、seq id no：122和seq id no：123所示；
21.(a12)依次如seq id no：127、seq id no：128和seq id no：129所示。
22.具体的，轻链的三个cdr为如下(b1)至(b12)中任一所述：
23.(b1)依次如seq id no：64、seq id no：65和seq id no：66所示；
24.(b2)依次如seq id no：70、seq id no：71和seq id no：72所示；
25.(b3)依次如seq id no：76、seq id no：77和seq id no：78所示；
26.(b4)依次如seq id no：82、seq id no：83和seq id no：84所示；
27.(b5)依次如seq id no：88、seq id no：89和seq id no：90所示；
28.(b6)依次如seq id no：94、seq id no：95和seq id no：96所示；
29.(b7)依次如seq id no：100、seq id no：101和seq id no：102所示；
30.(b8)依次如seq id no：106、seq id no：107和seq id no：108所示；
31.(b9)依次如seq id no：112、seq id no：113和seq id no：114所示；
32.(b10)依次如seq id no：118、seq id no：119和seq id no：120所示；
33.(b11)依次如seq id no：124、seq id no：125和seq id no：126所示；
34.(b12)依次如seq id no：130、seq id no：131和seq id no：132所示。
35.具体的，重链的可变区为如下(c1)至(c12)中任一所述：
36.(c1)如seq id no：1中第20至149位氨基酸残基所示；
37.(c2)如seq id no：5中第20至143位氨基酸残基所示；
38.(c3)如seq id no：9中第20至145位氨基酸残基所示；
39.(c4)如seq id no：13中第20至142位氨基酸残基所示；
40.(c5)如seq id no：17中第20至146位氨基酸残基所示；
41.(c6)如seq id no：21中第20至137位氨基酸残基所示；
42.(c7)如seq id no：25中第20至143位氨基酸残基所示；
43.(c8)如seq id no：29中第20至138位氨基酸残基所示；
44.(c9)如seq id no：33中第20至139位氨基酸残基所示；
45.(c10)如seq id no：37中第20至137位氨基酸残基所示；
46.(c11)如seq id no：41中第20至140位氨基酸残基所示；
47.(c12)如seq id no：45中第20至136位氨基酸残基所示。
48.具体的，轻链的可变区为如下(d1)至(d12)中任一所述：
49.(d1)如seq id no：3中第20至129位氨基酸残基所示；
50.(d2)如seq id no：7中第20至130位氨基酸残基所示；
51.(d3)如seq id no：11中第20至132位氨基酸残基所示；
52.(d4)如seq id no：15中第20至128位氨基酸残基所示；
53.(d5)如seq id no：19中第20至129位氨基酸残基所示；
54.(d6)如seq id no：23中第20至130位氨基酸残基所示；
55.(d7)如seq id no：27中第20至130位氨基酸残基所示；
56.(d8)如seq id no：31中第20至126位氨基酸残基所示；
57.(d9)如seq id no：35中第20至131位氨基酸残基所示；
58.(d10)如seq id no：39中第20至125位氨基酸残基所示；
59.(d11)如seq id no：43中第20至127位氨基酸残基所示；
60.(d12)如seq id no：47中第20至126位氨基酸残基所示。
61.具体的，重链为如下(e1)至(e24)中任一所述：
62.(e1)如seq id no：1中第20至479位氨基酸残基所示；
63.(e2)如seq id no：1所示；
64.(e3)如seq id no：5中第20至473位氨基酸残基所示；
65.(e4)如seq id no：5所示；
66.(e5)如seq id no：9中第20至475位氨基酸残基所示；
67.(e6)如seq id no：9所示；
68.(e7)如seq id no：13中第20至472位氨基酸残基所示；
69.(e8)如seq id no：13所示；
70.(e9)如seq id no：17中第20至476位氨基酸残基所示；
71.(e10)如seq id no：17所示；
72.(e11)如seq id no：21中第20至467位氨基酸残基所示；
73.(e12)如seq id no：21所示；
74.(e13)如seq id no：25中第20至473位氨基酸残基所示；
75.(e14)如seq id no：25所示；
76.(e15)如seq id no：29中第20至468位氨基酸残基所示；
77.(e16)如seq id no：29所示；
78.(e17)如seq id no：33中第20至469位氨基酸残基所示；
79.(e18)如seq id no：33所示；
80.(e19)如seq id no：37中第20至467位氨基酸残基所示；
81.(e20)如seq id no：37所示；
82.(e21)如seq id no：41中第20至470位氨基酸残基所示；
83.(e22)如seq id no：41所示；
84.(e23)如seq id no：45中第20至466位氨基酸残基所示；
85.(e24)如seq id no：45所示。
86.具体的，轻链为如下(f1)至(f24)中任一所述：
87.(f1)如seq id no：3中第20至235位氨基酸残基所示；
88.(f2)如seq id no：3所示；
89.(f3)如seq id no：7中第20至236位氨基酸残基所示；
90.(f4)如seq id no：7所示；
91.(f5)如seq id no：11中第20至239位氨基酸残基所示；
92.(f6)如seq id no：11所示；
93.(f7)如seq id no：15中第20至235位氨基酸残基所示；
94.(f8)如seq id no：15所示；
95.(f9)如seq id no：19中第20至235位氨基酸残基所示；
96.(f10)如seq id no：19所示；
97.(f11)如seq id no：23中第20至236位氨基酸残基所示；
98.(f12)如seq id no：23所示；
99.(f13)如seq id no：27中第20至236位氨基酸残基所示；
100.(f14)如seq id no：27所示；
101.(f15)如seq id no：31中第20至233位氨基酸残基所示；
102.(f16)如seq id no：31所示；
103.(f17)如seq id no：35中第20至238位氨基酸残基所示；
104.(f18)如seq id no：35所示；
105.(f19)如seq id no：39中第20至232位氨基酸残基所示；
106.(f20)如seq id no：39所示；
107.(f21)如seq id no：43中第20至233位氨基酸残基所示；
108.(f22)如seq id no：43所示；
109.(f23)如seq id no：47中第20至233位氨基酸残基所示；
110.(f24)如seq id no：47所示。
111.具体的，所述抗体为如下12种抗体中的任意一种：
112.抗体中，重链的三个cdr如(a1)所述并且轻链的三个cdr如(b1)所述；
113.抗体中，重链的三个cdr如(a2)所述并且轻链的三个cdr如(b2)所述；
114.抗体中，重链的三个cdr如(a3)所述并且轻链的三个cdr如(b3)所述；
115.抗体中，重链的三个cdr如(a4)所述并且轻链的三个cdr如(b4)所述；
116.抗体中，重链的三个cdr如(a5)所述并且轻链的三个cdr如(b5)所述；
117.抗体中，重链的三个cdr如(a6)所述并且轻链的三个cdr如(b6)所述；
118.抗体中，重链的三个cdr如(a7)所述并且轻链的三个cdr如(b7)所述；
119.抗体中，重链的三个cdr如(a8)所述并且轻链的三个cdr如(b8)所述；
120.抗体中，重链的三个cdr如(a9)所述并且轻链的三个cdr如(b9)所述；
121.抗体中，重链的三个cdr如(a10)所述并且轻链的三个cdr如(b10)所述；
122.抗体中，重链的三个cdr如(a11)所述并且轻链的三个cdr如(b11)所述；
123.抗体中，重链的三个cdr如(a12)所述并且轻链的三个cdr如(b12)所述。
124.具体的，所述抗体为如下12种抗体中的任意一种：
125.抗体中，重链的可变区如(c1)所述并且轻链的可变区如(d1)所述；
126.抗体中，重链的可变区如(c2)所述并且轻链的可变区如(d2)所述；
127.抗体中，重链的可变区如(c3)所述并且轻链的可变区如(d3)所述；
128.抗体中，重链的可变区如(c4)所述并且轻链的可变区如(d4)所述；
129.抗体中，重链的可变区如(c5)所述并且轻链的可变区如(d5)所述；
130.抗体中，重链的可变区如(c6)所述并且轻链的可变区如(d6)所述；
131.抗体中，重链的可变区如(c7)所述并且轻链的可变区如(d7)所述；
132.抗体中，重链的可变区如(c8)所述并且轻链的可变区如(d8)所述；
133.抗体中，重链的可变区如(c9)所述并且轻链的可变区如(d9)所述；
134.抗体中，重链的可变区如(c10)所述并且轻链的可变区如(d10)所述；
135.抗体中，重链的可变区如(c11)所述并且轻链的可变区如(d11)所述；
136.抗体中，重链的可变区如(c12)所述并且轻链的可变区如(d12)所述。
137.具体的，所述抗体为如下24种抗体中的任意一种：
138.抗体中，重链如(e1)所述并且轻链如(f1)所述；
139.抗体中，重链如(e2)所述并且轻链如(f2)所述；
140.抗体中，重链如(e3)所述并且轻链如(f3)所述；
141.抗体中，重链如(e4)所述并且轻链如(f4)所述；
142.抗体中，重链如(e5)所述并且轻链如(f5)所述；
143.抗体中，重链如(e6)所述并且轻链如(f6)所述；
144.抗体中，重链如(e7)所述并且轻链如(f7)所述；
145.抗体中，重链如(e8)所述并且轻链如(f8)所述；
146.抗体中，重链如(e9)所述并且轻链如(f9)所述；
147.抗体中，重链如(e10)所述并且轻链如(f10)所述；
148.抗体中，重链如(e11)所述并且轻链如(f11)所述；
149.抗体中，重链如(e12)所述并且轻链如(f12)所述；
150.抗体中，重链如(e13)所述并且轻链如(f13)所述；
151.抗体中，重链如(e14)所述并且轻链如(f14)所述；
152.抗体中，重链如(e15)所述并且轻链如(f15)所述；
153.抗体中，重链如(e16)所述并且轻链如(f16)所述；
154.抗体中，重链如(e17)所述并且轻链如(f17)所述；
155.抗体中，重链如(e18)所述并且轻链如(f18)所述；
156.抗体中，重链如(e19)所述并且轻链如(f19)所述；
157.抗体中，重链如(e20)所述并且轻链如(f20)所述；
158.抗体中，重链如(e21)所述并且轻链如(f21)所述；
159.抗体中，重链如(e22)所述并且轻链如(f22)所述；
160.抗体中，重链如(e23)所述并且轻链如(f23)所述；
161.抗体中，重链如(e24)所述并且轻链如(f24)所述。
162.以上任一所述抗体具体为中和sars-cov-2的抗体。
163.以上任一所述抗体具体为igg。
164.以上任一所述抗体具体为igg1、igg2、igg3或igg4。
165.以上任一所述抗体可为人抗体、人源化抗体、多聚物形式或嵌合抗体等所有可能
的方式。
166.本发明还提供了抗体片段，包括以上任一所述的抗体的片段；所述抗体片段为双抗体、fab、fab'、fv、f(ab')2、单链抗体(scfv)、单域抗体(sdad)、重链抗体(hcab) 或纳米抗体(nb或vhh)。
167.所述重链抗体具体为以上任一所述抗体的所述重链。
168.本发明还提供了以上任一所述抗体进行修饰后得到的修饰抗体或以上任一所述抗体片段进行修饰后得到的修饰抗体片段；所述修饰包括但不限于：磷酸化修饰、糖基化修饰。
169.本发明还提供了融合物、缀合物或聚合物，其特征在于：其包括以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段。
170.本发明还提供了抗体的融合蛋白，其特征在于：其包括以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段。所述融合蛋白，其还可包括信号肽或引导肽。所述融合蛋白，其还可包括靶向肽。所述融合蛋白，其还可包括标签肽。所述融合蛋白，其还可包括荧光蛋白。所述融合蛋白，其还可包括一种或多种增强半衰期的功能蛋白。
171.本发明还提供了编码以上任一所述抗体或编码以上任一所述抗体片段的核酸分子。所述核酸分子具体可为dna分子，例如dna分子或cdna分子。所述核酸分子是正链核酸分子或有义链。所述核酸分子是与正链核酸分子或有义链配对的负链核酸分子。所述核酸分子具体可如seq id no：2、seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、 seq id no：10、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：16、seq id no：18、 seq id no：20、seq id no：22、seq id no：24、seq id no：26、seq id no：28、 seq id no：30、seq id no：32、seq id no：34、seq id no：36、seq id no：38、 seq id no：40、seq id no：42、seq id no：44、seq id no：46或seq id no：48 所示。
172.本发明还提供了具有或表达所述核酸分子的重组载体或重组细胞。示例性的，所述重组载体的出发载体可为pmd18t。示例性的，所述重组细胞的出发细胞可为293f 细胞。
173.本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞在制备疫苗中的应用；
174.所述疫苗为如下(g1)或(g2)：
175.(g1)治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的疫苗；
176.(g2)中和sars-cov-2的疫苗。
177.本发明还提供了疫苗，其活性成分为以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞；
178.所述疫苗为如下(g1)或(g2)：
179.(g1)治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的疫苗；
180.(g2)中和sars-cov-2的疫苗。
181.所述疫苗中，以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗
体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞可作为唯一活性成分，也可以作为活性成分之一。所述疫苗中，当以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞作为活性成分之一时，疫苗中还包括其他抗体或其他免疫促进剂。
182.本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞在制备药物中的应用；
183.所述药物为如下(h1)或(h2)：
184.(h1)治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的药物；
185.(h2)中和sars-cov-2的药物。
186.本发明还提供了药物或组合物，其包含以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞；
187.所述药物或组合物的功能为如下(i1)或(i2)：
188.(i1)治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎；
189.(i2)中和sars-cov-2。
190.所述药物或组合物中，以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞可作为唯一活性成分，也可以作为活性成分之一。所述药物或组合物中，当以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞作为活性成分之一时，药物或组合物中还包括其他抗体或其他免疫促进剂。
191.本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞在制备试剂盒中的应用；
192.所述试剂盒的功能为如下(j1)或(j2)：
193.(j1)诊断或辅助诊断新型冠状病毒肺炎；
194.(j2)检测或辅助检测sars-cov-2。
195.本发明还提供了试剂盒，包括以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述
缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞；
196.所述试剂盒的功能为如下(j1)或(j2)：
197.(j1)诊断或辅助诊断新型冠状病毒肺炎；
198.(j2)检测或辅助检测sars-cov-2。
199.本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白在中和sars-cov-2中的应用。
200.本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白在通过中和sars-cov-2治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎中的应用。
201.本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞的应用，所述应用为在治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎中的应用。
202.本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞的应用，所述应用为诊断或辅助诊断新型冠状病毒肺炎。
203.本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞的应用，所述应用为检测或辅助检测sars-cov-2。
204.本发明还提供了治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的方法，包括如下步骤：施用以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞，从而治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎。
205.本发明还提供了中和生物体中的sars-cov-2的方法，包括如下步骤：施用以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞，从而中和生物体中的sars-cov-2。
206.以上任一所述施用可通过皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内进行。
207.本发明还提供了诊断或辅助诊断新型冠状病毒肺炎的方法，包括利用以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融
合蛋白检测sars-cov-2的s蛋白的步骤。
208.本发明还提供了检测sars-cov-2的s蛋白的方法，其特征在于：利用以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白检测sars-cov-2的s蛋白。
209.sars-cov-2的s蛋白具体可如seq id no：53所示。
210.本发明对于新型冠状病毒肺炎的防控具有重大的应用价值，将产生深远的社会意义。
附图说明
211.图1为cov-s-rbd、sars-s-rbd和mers-s-rbd的序列比较。
212.图2为抗体与cov-s-rbd的结合活性的结果。
213.图3为抗体与sars-s-rbd的结合活性的结果。
214.图4为抗体与mers-s-rbd的结合活性的结果。
215.图5为p2c-1d5抗体、p2b-2f6抗体、p2a-1a10抗体的抗体中和活性的结果。
216.图6为p2c-1a3抗体、p2c-1f11抗体、p2c-1c10抗体、p2b-2g4抗体的抗体中和活性的结果。
217.图7为p2c-1c8抗体、p2b-2g11抗体、vrc01抗体的抗体中和活性的结果。
218.图8为p2a-1a9抗体、p2a-1b3抗体、p2a-1a8抗体的抗体中和活性的结果。
具体实施方式
219.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不用于限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
220.质粒pcdna3.1( )：invitrogen公司，产品目录号v790-20。293t细胞：盖德， crl-11268。pmd18t载体：takara，产品目录号d101a。
221.质粒pnl4-3r-e-luciferase(骨架质粒)：参考文献:he j,choe s,walker r,dimarzio p,morgan do,landau nr.j virol 69:6705
–
6711,1995.。
222.vrc01抗体：现有技术中的hiv抗体。
223.实施例1、抗体的发现和制备
224.一、抗体的发现
225.从sars-cov-2恢复期病人的外周血单个核细胞中分离记忆性b细胞，再扩增出记忆性b细胞的抗体基因得到抗体序列。通过大量比对、分析、制备和效果验证，本发明的发明人发现了12个新的具有优异活性的sars-cov-2抗体(均为igg抗体)。依次命名为： p2a-1a8抗体、p2a-1a9抗体、p2a-1a10抗体、p2a-1b3抗体、p2b-2f6抗体、p2b-2g4 抗体、p2b-2g11抗体、p2c-1a3抗体、p2c-1c8抗体、p2c-1c10抗体、p2c-1d5抗体、 p2c-1f11抗体。
226.p2a-1a8抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：1所示；seq id no：1中，第 1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至149位氨基酸残基组成重链
可变区，第150至479位氨基酸残基组成重链恒定区。p2a-1a8抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：3所示；seq id no：3中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至129位氨基酸残基组成轻链可变区，第130位至235位氨基酸残基组成轻链恒定区。
227.p2a-1a9抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：5所示；seq id no：5中，第 1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至143位氨基酸残基组成重链可变区，第144至473位氨基酸残基组成重链恒定区。p2a-1a9抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：7所示；seq id no：7中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至130位氨基酸残基组成轻链可变区，第131位至236位氨基酸残基组成轻链恒定区。
228.p2a-1a10抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：9所示；seq id no：9中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至145位氨基酸残基组成重链可变区，第146至475位氨基酸残基组成重链恒定区。p2a-1a10抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：11所示；seq id no：11中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至132位氨基酸残基组成轻链可变区，第133位至239位氨基酸残基组成轻链恒定区。
229.p2a-1b3抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：13所示；seq id no：13中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至142位氨基酸残基组成重链可变区，第143至472位氨基酸残基组成重链恒定区。p2a-1b3抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：15所示；seq id no：15中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至128位氨基酸残基组成轻链可变区，第129位至235位氨基酸残基组成轻链恒定区。
230.p2b-2f6抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：17所示；seq id no：17中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至146位氨基酸残基组成重链可变区，第147至476位氨基酸残基组成重链恒定区。p2b-2f6抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：19所示；seq id no：19中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至129位氨基酸残基组成轻链可变区，第130位至235位氨基酸残基组成轻链恒定区。
231.p2b-2g4抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：21所示；seq id no：21中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至137位氨基酸残基组成重链可变区，第138至467位氨基酸残基组成重链恒定区。p2b-2g4抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：23所示；seq id no：23中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至130位氨基酸残基组成轻链可变区，第131位至236位氨基酸残基组成轻链恒定区。
232.p2b-2g11抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：25所示；seq id no：25中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至143位氨基酸残基组成重链可变区，第144至473位氨基酸残基组成重链恒定区。p2b-2g11抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：27所示；seq id no：27中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至130位氨基酸残基组成轻链可变区，第131位至236位氨基酸残基组成
轻链恒定区。
233.p2c-1a3抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：29所示；seq id no：29中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至138位氨基酸残基组成重链可变区，第139至468位氨基酸残基组成重链恒定区。p2c-1a3抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：31所示；seq id no：31中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至126位氨基酸残基组成轻链可变区，第127位至233位氨基酸残基组成轻链恒定区。
234.p2c-1c8抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：33所示；seq id no：33中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至139位氨基酸残基组成重链可变区，第140至469位氨基酸残基组成重链恒定区。p2c-1c8抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：35所示；seq id no：35中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至131位氨基酸残基组成轻链可变区，第132位至238位氨基酸残基组成轻链恒定区。
235.p2c-1c10抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：37所示；seq id no：37中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至137位氨基酸残基组成重链可变区，第138至467位氨基酸残基组成重链恒定区。p2c-1c10抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：39所示；seq id no：39中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至125位氨基酸残基组成轻链可变区，第126位至232位氨基酸残基组成轻链恒定区。
236.p2c-1d5抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：41所示；seq id no：41中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至140位氨基酸残基组成重链可变区，第141至470位氨基酸残基组成重链恒定区。p2c-1d5抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：43所示；seq id no：43中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至127位氨基酸残基组成轻链可变区，第128位至233位氨基酸残基组成轻链恒定区。
237.p2c-1f11抗体全长重链的氨基酸序列如seq id no：45所示；seq id no：45中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至136位氨基酸残基组成重链可变区，第137至466位氨基酸残基组成重链恒定区。p2c-1f11抗体全长轻链的氨基酸序列如seq id no：47所示；seq id no：47中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至126位氨基酸残基组成轻链可变区，第127位至233位氨基酸残基组成轻链恒定区。
238.上述12个抗体的可变区见表1。
239.表1
240.[0241][0242]
二、抗体的制备
[0243]
(一)重组质粒的构建
[0244]
将重链dna分子插入pmd18t载体，得到重链表达载体。
[0245]
将轻链dna分子插入pmd18t载体，得到轻链表达载体。
[0246]
重链dna分子为双链dna分子，自上游至下游依次由如下三个区段组成：seq id no： 49所示的dna分子、重链编码区、seq id no：50所示的dna分子。seq id no：49 中，第1至888位核苷酸组成cmv启动子，第889-945位核苷酸编码信号肽。seq id no： 50中，第1至3位为终止密码子，第4-201位核苷酸为ploya片段。
[0247]
轻链dna分子为双链dna分子，自上游至下游依次由如下三个区段组成：seq id no： 51所示的dna分子、轻链编码区、seq id no：52所示的dna分子。seq id no：51 中，第1至888位核苷酸组成cmv启动子，第889-945位核苷酸编码信号肽。seq id no： 52中，第1至3位为终止密码子，第4-151位核苷酸为ploya片段。
[0248]
(二)重组细胞的构建
[0249]
将重链表达载体和轻链表达载体共转染293f细胞，得到重组细胞。
[0250]
(三)抗体的制备
[0251]
1、取步骤二得到的重组细胞，在含2％胎牛血清的dmem培养基培养72h，然后4℃、 4000rpm离心30min，收集上清液。
[0252]
2、亲和层析
[0253]
亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；
[0254]
亲和层析的柱填料：protein a beads(thermo，产品目录号10006d)；
[0255]
操作步骤：
①
将300ml步骤1得到的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育16小时；
②
用60ml结合缓冲液洗涤柱子；
③
用30ml洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。
[0256]
结合缓冲液：取甘氨酸112.6g、氯化钠175.2g，溶于水并用水定容至1l，用氢氧化钠调ph至8.0。
[0257]
洗脱缓冲液：取甘氨酸7.5g，溶于水并用水定容至500ml，用盐酸调ph至3.0。
[0258]
3、取步骤2得到的过柱后溶液，用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为pbs缓冲液 (ph7.2、10mm)，得到蛋白浓度为1mg/ml的抗体溶液。
[0259]
重链编码区为seq id no：2所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：4所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2a-1a8抗体溶液。
[0260]
重链编码区为seq id no：6所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：8所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2a-1a9抗体溶液。
[0261]
重链编码区为seq id no：10所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：12所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2a-1a10抗体溶液。
[0262]
重链编码区为seq id no：14所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：16所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2a-1b3抗体溶液。
[0263]
重链编码区为seq id no：18所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：20所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2b-2f6抗体溶液。
[0264]
重链编码区为seq id no：22所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：24所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2b-2g4抗体溶液。
[0265]
重链编码区为seq id no：26所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：28所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2b-2g11抗体溶液。
[0266]
重链编码区为seq id no：30所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：32所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2c-1a3抗体溶液。
[0267]
重链编码区为seq id no：34所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：36所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2c-1c8抗体溶液。
[0268]
重链编码区为seq id no：38所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：40所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2c-1c10抗体溶液。
[0269]
重链编码区为seq id no：42所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：44所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2c-1d5抗体溶液。
[0270]
重链编码区为seq id no：46所示的dna分子且轻链编码区为seq id no：48所示的dna分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为p2c-1f11抗体溶液。
[0271]
实施例2、抗体与病毒s蛋白的rbd区域的结合活性
[0272]
图1为cov-s-rbd、sars-s-rbd和mers-s-rbd的序列比较，序列差异较大。
[0273]
一、制备sars-cov-2的s蛋白的rbd区域
[0274]
sars-cov-2的s蛋白的rbd区域(简称cov-s-rbd)，如seq id no：55中第39 至261位氨基酸残基所示。sars-cov-2的s蛋白的rbd区域的预期分子量为25kda。
[0275]
1、构建重组质粒
[0276]
seq id no：56所示的双链dna分子插入质粒pfastbac-dual的bamhi和hindiii 酶切位点之间，得到重组质粒pfastbac-dual-cov-s-rbd。
[0277]
seq id no：56所示的双链dna分子编码seq id no：55所示的蛋白质。seq id no： 55中，第1至38位氨基酸残基组成信号肽，第262至267位氨基酸残基组成his6标签。信号肽用于引导蛋白分泌到细胞外，his6标签用于蛋白纯合，该两个区段都不具有抗体结合功能。
[0278]
2、制备cov-s-rbd
[0279]
(1)将步骤1得到的重组质粒pfastbac-dual-cov-s-rbd导入dh10bac感受态细胞，得到杆状病毒穿梭载体，杆状病毒穿梭载体转染sf9昆虫细胞，然后收集细胞培养上清并感染hi5细胞，收集细胞培养上清。
[0280]
(2)亲和层析
[0281]
亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；
[0282]
亲和层析的柱填料：镍柱beads(购自qiagen公司，产品目录号为30230)；
[0283]
操作步骤：
①
将300ml步骤(1)得到的细胞培养上清上样于亲和层析柱，4℃孵育3
p2a-1b3抗体、p2b-2f6抗体、p2b-2g4抗体、p2b-2g11抗体、p2c-1a3抗体、p2c-1c8 抗体、p2c-1c10抗体、p2c-1d5抗体、p2c-1f11抗体，vrc01抗体，s230抗体(现有技术中的sars病毒抗体)。
[0306]
供试抗原为：步骤二制备的sars-s-rbd。
[0307]
采用elisa试验检测供试抗体与供试抗原的结合活性。供试抗原作为包被抗原 (100μl/孔，其中抗原含量为100ng)。供试抗体用pbs缓冲液调整浓度，然后进行3 倍梯度稀释后作为一抗。hrp标记的抗人igg抗体(1:5000稀释)作为二抗。采用tmb 显色方法。吸光度计算方法：用450nm吸收光减去背景630nm的吸收光。
[0308]
结果见图3。s230抗体与sars-s-rbd特异性结合。实施例1制备的12个抗体均不与sars-s-rbd结合。
[0309]
六、抗体与mers-s-rbd的结合活性
[0310]
供试抗体分别为：实施例1制备的p2a-1a8抗体、p2a-1a9抗体、p2a-1a10抗体、 p2a-1b3抗体、p2b-2f6抗体、p2b-2g4抗体、p2b-2g11抗体、p2c-1a3抗体、p2c-1c8 抗体、p2c-1c10抗体、p2c-1d5抗体、p2c-1f11抗体，vrc01抗体，mab-gd33抗体(现有技术中的mers病毒抗体)。
[0311]
供试抗原为：步骤三制备的mers-s-rbd。
[0312]
采用elisa试验检测供试抗体与供试抗原的结合活性。供试抗原作为包被抗原 (100μl/孔，其中抗原含量为100ng)。供试抗体用pbs缓冲液调整浓度，然后进行3 倍梯度稀释后作为一抗。hrp标记的抗人igg抗体(1:5000稀释)作为二抗。采用tmb 显色方法。吸光度计算方法：用450nm吸收光减去背景630nm的吸收光。
[0313]
结果见图4。mab-gd33抗体与mers-s-rbd特异性结合。实施例1制备的12个抗体均不与mers-s-rbd结合。
[0314]
实施例3、中和试验
[0315]
一、sars-cov-2假病毒的制备
[0316]
1、将人工合成的seq id no：54所示的双链dna分子插入质粒pcdna3.1( )的bamhi和noti酶切位点之间，得到重组质粒pcdna3.1/sars-cov-2。seq id no：54 所示的双链dna分子编码seq id no：53所示的sars-cov-2的s蛋白。
[0317]
2、将重组质粒pcdna3.1/sars-cov-2和质粒pnl4-3r-e-luciferase共转染293t 细胞，得到重组细胞。
[0318]
质粒pnl4-3r-e-luciferase中含有hiv-1病毒基因组的全部基因(与野生hiv-1 病毒基因组的差异仅在于envelope基因发生了移码)。重组质粒pcdna3.1/sars-cov-2 和质粒pnl4-3r-e-luciferase共转染宿主细胞，可以表达sars-cov-2假病毒。 sars-cov-2假病毒只有病毒颗粒表面的膜蛋白是sars-cov-2的s蛋白，其他均为 hiv-1病毒的成分，只能在被感染的细胞中复制基因组并表达荧光素酶报告基因，不能再产生有感染性的病毒颗粒。
[0319]
3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的dmem培养基培养60h。
[0320]
4、完成步骤3后，取培养上清，即为sars-cov-2假病毒的病毒液(简称sars-cov-2 病毒液)。
[0321]
5、利用p24定量检测的elisa试剂盒检测sars-cov-2病毒液中的病毒滴度。
[0322]
二、抗体的中和活性检测
[0323]
供试抗体溶液分别为：实施例1制备的p2a-1a8抗体溶液、p2a-1a9抗体溶液、 p2a-1a10抗体溶液、p2a-1b3抗体溶液、p2b-2f6抗体溶液、p2b-2g4抗体溶液、p2b-2g11 抗体溶液、p2c-1a3抗体溶液、p2c-1c8抗体溶液、p2c-1c10抗体溶液、p2c-1d5抗体溶液、p2c-1f11抗体溶液，vrc01抗体溶液。
[0324]
1、取供试抗体溶液，用pbs缓冲液(ph7.2、10mm)进行倍比稀释，得到抗体稀释液。
[0325]
2、取96孔细胞培养板，每孔加入100微升抗体稀释液和50微升sars-cov-2病毒液(50微升sars-cov-2病毒液中的病毒浓度为1
×
104tcid
50
/ml)，使得混合体系中的抗体浓度为xμg/ml(以蛋白浓度计)，37℃静置孵育1小时。用等体积pbs缓冲液(ph7.2、10mm)代替抗体稀释液，作为病毒对照。用等体积含10％胎牛血清的dmem 培养基代替sars-cov-2病毒液，作为细胞对照。
[0326]
3、完成步骤2后，取所述细胞培养板，每孔接种100微升huh7细胞悬液(用于制备细胞悬液的溶剂为含10％胎牛血清的dmem培养基，细胞悬液中的huh7细胞浓度为2
×
105个细胞/ml)，37℃静置孵育64小时。
[0327]
4、完成步骤3后，取所述细胞培养板，吸弃上清，每孔加入150微升裂解液(微格拉斯生物技术，货号t003，按说明书操作)，37℃静置孵育5分钟。
[0328]
5、完成步骤4后，取所述细胞培养板，检测荧光素酶活性。
[0329]
每个处理设置多个复孔。
[0330]
中和活性(％)＝[1-(试验组的荧光强度-细胞对照的荧光强度)/(病毒对照的荧光强度-细胞对照的荧光强度)]
×
100％。
[0331]
利用prism 5软件计算中和活性为50％时的抗体浓度，即抗体的ic
50
值。
[0332]
中和活性的结果见表2，图5、图6、图7和图8。
[0333]
表2
[0334]
[0335]
[0336][0337][0338]
注：ic
50
值＜50μg/ml才能判断为特异性中和抗体。