一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法与流程

一种沙漠蛋白核小球藻异养
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稀释
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光诱导培养方法
技术领域
1.本发明涉及微藻养殖技术领域，具体为一种沙漠蛋白核小球藻异养
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稀释
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光诱导培养方法。


背景技术：

2.小球藻(chlorella sp.)是一种普生性单细胞绿藻，属于绿藻门，绿藻纲，卵囊藻科，小球藻属。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻、普通小球藻等。小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸、dha、epa等)、类胡萝卜素、虾青素和多种维生素，广泛应用于功能食品、饲料、化妆品和医药等领域。
3.现有的蛋白核小球藻藻粉生产方法主要包括开放式自养培养、密闭式异养培养、混合培养。开放式自养培养，易污染，光照、温度等培养条件易受天气影响，藻细胞浓度低，采收成本较高，密闭式异养培养一般利用葡萄糖作为碳源，采用高耗能的硝态氮如硝酸钠作为氮源，虽能够获得较为理想的藻细胞浓度，但由于培养过程一直处于黑暗条件下，后期收获的藻粉蛋白质和叶绿素等含量都较低，使得藻细胞的品质和多种生物活性功能明显不足，且培养过程中多用盐酸调节ph值，容易对发酵设备造成一定程度的损害。
4.塔克拉玛干沙漠绿藻作为极端环境微藻，在几十万年的进化中，其生物学特性、生理生化组分等与绿藻存在一定差异。培养条件和培养技术较为缺乏，为了解决，沙漠蛋白核小球藻自养培养生产周期长，生物量低，异养培养藻粉蛋白含量低等问题，本发明提供了一种适合沙漠蛋白核小球藻异养—稀释—光诱导培养方法，实现在短时间内获得较高品质的沙漠蛋白核小球藻。


技术实现要素：

5.鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种沙漠蛋白核小球藻异养
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稀释
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光诱导培养方法，包括步骤如下：步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取3
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5环藻种，接种到装有50ml培养基的100ml三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/ml，得到一级种子液；步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200ml培养基的500ml三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48～72小时，得到二级种子液；步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500ml培养基的1000ml三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48～72小时，得到三级种子液；
步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，ph为7，发酵罐转速50r/min，培养72小时后，每天取料2000ml，补充新鲜培养液2000ml，保持半连续培养体系的稳定；步骤六、稀释
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光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态2.12
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4.24g/l，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态150
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200g/l；将发酵罐中培养液稀释，转入60l柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1l/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束。
6.作为本发明的一种优选方案，步骤一至步骤四中使用的培养基均为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基。
7.作为本发明的一种优选方案，步骤五中使用的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/l的basal培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源。
8.作为本发明的一种优选方案，步骤五中利用50％醋酸和2mol/l氢氧化钠调节发酵罐中培养液的ph。
9.作为本发明的一种优选方案，步骤六中稀释发酵罐中培养液所用培养基为basal培养基。
10.作为本发明的一种优选方案，步骤六中结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40％
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55％。
11.本发明的有益效果：本发明提供的沙漠蛋白核小球藻异养—稀释—光诱导的培养方法，异养方式与自养方式的结合方式，大大提高沙漠蛋白核小球藻的生物量和蛋白质含量，达到高效生产大量高蛋白质含量的沙漠蛋白核小球藻的目的，不仅可在短时间内获得较高浓度的藻细胞生物量，还可诱导蛋白核小球藻内蛋白质、叶绿素等物质的积累，改善蛋白核小球藻品质，提高蛋白核小球藻的综合利用价值。此外，该方法具有操作简便、实用性强、易实现连续生产等特点，非常有利于大规模的推广和应用，以快速高效地获得大量的高含量蛋白质的沙漠蛋白核小球藻藻粉，为高品质沙漠蛋白核小球藻藻粉的生产提供技术支撑，满足工业生产的需求。
附图说明
12.图1为本发明所采用的分离纯化的蛋白核小球藻图片；
13.图2为异养和异养—光诱导沙漠蛋白核小球藻蛋白质含量图；
14.图3位不同稀释倍数光诱导沙漠蛋白核小球藻的叶绿素含量图；
15.图4位不同稀释倍数光诱导沙漠蛋白核小球藻蛋白含量含量图。
具体实施方式
16.实施例1
17.本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养
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稀释
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光诱导培养方法，采用的技术方案是，包括步骤如下：步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养基为含10g/l葡萄糖的
basal固体培养基，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取3环藻种，接种到装有50ml培养基的100ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/ml，得到一级种子液；步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200ml培养基的500ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48小时，得到二级种子液；步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500ml培养基的1000ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48小时，得到三级种子液；步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/l的basal培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，ph为7，发酵罐转速50r/min，培养72小时后，每天取料2000ml，补充新鲜培养液2000ml，利用50％醋酸和2mol/l氢氧化钠调节发酵罐中培养液的ph，保持半连续培养体系的稳定；步骤六、稀释
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光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态2.12g/l，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态150g/l；将发酵罐中加入basal培养基对培养液进行稀释，转入60l柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1l/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束；结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40％
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55％。
18.实施例2
19.本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养
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稀释
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光诱导培养方法，采用的技术方案是，包括步骤如下：步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取5环藻种，接种到装有50ml培养基的100ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/ml，得到一级种子液；步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200ml培养基的500ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养60小时，得到二级种子液；步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500ml培养基的1000ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养60小时，得到三级种子液；步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/l的basal培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，ph为7，发酵罐转速
50r/min，培养72小时后，每天取料2000ml，补充新鲜培养液2000ml，利用50％醋酸和2mol/l氢氧化钠调节发酵罐中培养液的ph，保持半连续培养体系的稳定；步骤六、稀释
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光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态3.21g/l，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态170g/l；将发酵罐中加入basal培养基对培养液进行稀释，转入60l柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1l/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束；结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40％
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55％。
20.实施例3
21.本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养
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稀释
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光诱导培养方法，采用的技术方案是，包括步骤如下：步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取5环藻种，接种到装有50ml培养基的100ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/ml，得到一级种子液；步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200ml培养基的500ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养72小时，得到二级种子液；步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500ml培养基的1000ml三角瓶中，培养基为含10g/l葡萄糖的basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养72小时，得到三级种子液；步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/l的basal培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，ph为7，发酵罐转速50r/min，培养72小时后，每天取料2000ml，补充新鲜培养液2000ml，利用50％醋酸和2mol/l氢氧化钠调节发酵罐中培养液的ph，保持半连续培养体系的稳定；步骤六、稀释
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光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态4.24g/l，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态200g/l；将发酵罐中加入basal培养基对培养液进行稀释，转入60l柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1l/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束；结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40％
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55％。
22.basal固体培养基主要成分及终浓度为：培养基成分终浓度mg/l培养基成分终浓度mg/lnano31250feso4·
7h2o49.8kh2po41250znso4·
7h2o88.2mgso4·
7h2o1000mncl2·
4h2o14.2
edta500na2moo4·
2h2o11.92h3bo4114.2cuso4·
5h2o15.7cacl2·
h2o111co(no3)2·
6h2o4.9
23.本文中未详细说明的部件为现有技术。
24.上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。