一种提高Treg细胞活性的外泌体的培养方法与流程

一种提高treg细胞活性的外泌体的培养方法
技术领域
1.本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高treg细胞活性的外泌体的培养方法。


背景技术：

2.外泌体是指包含了复杂rna和蛋白质的小膜泡 (30
‑
150nm)，现今，其特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
3.申请号为cn201810168252.3的专利《人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用》提供了人脐带间充质干细胞外泌体的蔗糖密度梯度离心分离纯化方法，以及人脐带间充质干细胞外泌体应用到ii型糖尿病模型的治疗，该外泌体来自培养液的简单培养，没有提及外泌体其他的功能方面的改进。因此，现有的技术大多集中于外泌体分离方法的改进及优化，对于外泌体本身的功能改进还需要进一步的探索。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明提供了提高treg细胞活性的外泌体的培养方法。
5.为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：一种提高treg细胞活性的外泌体的培养方法，在间充质干细胞的培养过程中，在基础培养液中添加生长因子、tgf
‑
b、维生素c、抗凝剂和不饱和脂肪酸，培养获得的细胞上清超速离心后得到提高treg细胞活性的外泌体。
6.优选地，所述基础培养液为含有10%胎牛血清的amem培养液。
7.优选地，所述生长因子选自干细胞生长因子或成纤维细胞生长因子中的至少一种。
8.优选地，所述抗凝剂选自肝素钠；所述不饱和脂肪酸选自前列腺素e2。
9.优选地，在基础培养液中添加生长因子、tgf
‑
b、维生素c、抗凝剂和不饱和脂肪酸的方式如下：（1）在p1
‑
p3代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加干细胞生长因子及成纤维细胞生长因子；（2）在p4，p5 代间充质干细胞的培养过程中，在培养液中添加成纤维细胞生长因子、tgf
‑
b、维生素c、前列腺素e2、抗凝剂和不饱和脂肪酸。
10.步骤（1）中干细胞因子和成纤维生长因子的添加主要是提高p1
‑
p3代细胞的干性，增强细胞的增殖能力，步骤（2）中培养液中添加成纤维细胞生长因子、tgf
‑
b、维生素c、抗凝剂和不饱和脂肪酸，其中维生素c的添加主要起到抗氧化作用，减少细胞传代过程中复制性衰老，抗凝剂的添加主要是为了减少细胞的粘连，其他成纤维细胞生长因子、tgf
‑
b、前列腺
素e2、不饱和脂肪酸的添加主要是可增强间充质干细胞分泌的外泌体激活treg细胞活性的能力。
11.优选地，步骤（1）中干细胞生长因子和成纤维细胞生长因子的浓度均为1
‑
30ng/ml。例如1ng/ml、3ng/ml、7ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、22ng/ml、27ng/ml、或30ng/ml。
12.优选地，步骤（2）中成纤维细胞生长因子、tgf
‑
b和肝素钠的浓度均为1
‑
30ng/ml，例如1ng/ml、3ng/ml、7ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、22ng/ml、27ng/ml、或30ng/ml。前列腺e2的浓度1
‑
30mg/ml，例如1ng/ml、3ng/ml、7ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、22ng/ml、27ng/ml、或30ng/ml。维生素c的浓度为10
‑
50ug/ml，例如1ng/ml、3ng/ml、7ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、22ng/ml、27ng/ml、30ng/ml、36ng/ml、38ng/ml、42ng/ml、47ng/ml、50ng/ml。
13.本发明提供一种提高treg细胞活性的外泌体，所述提高treg细胞活性的外泌体由上述培养方法培养而成。
14.一种上述提高treg细胞活性的外泌体在促进treg的药物中的应用。
15.相对于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明一种提高treg细胞活性的间充质干细胞的培养方法，通过采用阶段性加入细胞因子可有效的增强间充质干细胞激活treg细胞活性的能力，通过在细胞p1代
‑
p3间充质干细胞的培养过程添加干细胞生长因子，成纤维细胞生长因子提高细胞的干性。在细胞扩增的p4，p5 代间充质干细胞的培养过程中添加了成纤维细胞生长因子，前列腺素e2，tgf
‑
b，维生素c，肝素钠，其中维生素c的添加主要起到抗氧化作用，减少细胞传代过程中复制性衰老，抗凝剂的添加主要是为了减少细胞的粘连，其他成纤维细胞生长因子、tgf
‑
b、前列腺素e2、不饱和脂肪酸的添加主要是可增强间充质干细胞分泌的外泌体激活treg细胞活性的能力，有效提高外泌体的应用范围及效果。
附图说明
16.图1为本发明实施例1中提高treg细胞活性的外泌体的电镜图；图2为不同外泌体分别与pbmc共培养后流式检测结果；图3为不同外泌体对成纤维细胞增殖s期的影响。
具体实施方式
17.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
18.实施例1复苏冻存的p0代间充质干细胞，离心后获得p1代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加10ng/ml干细胞生长因子，10ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；传代的p1间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p2代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加10ng/ml干细胞生长因子，10ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
19.传代的p2间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p3代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加10ng/ml干细胞生长
因子，10ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
20.传代的p3间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p4代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加15ng/ml成纤维细胞生长因子，10mg/ml前列腺素e2，10ng/ml tgf
‑
b，30ug/ml维生素c，10ng/ml肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
21.传代的p4间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p5代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加15ng/ml成纤维细胞生长因子，10mg/ml前列腺素e2，10ng/ml tgf
‑
b，30ug/ml维生素c，10ng/ml肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
22.培养3天后待细胞生长至融合度达到85%时，收集细胞上清，300
×
g离心10分钟，离心后收集上清， 2000
×
g离心10分钟，离心后收集上清进行第三次离心10000
×
g离心30分钟，离心后收集上清，进行第四次离心，100000
×
g离心70分钟离心后，弃去上清，加入磷酸盐缓冲液吹打混匀后，进行第五次离心，100000
×
g离心70分钟离心后所得的沉淀为外泌体。
23.对比例本对比例与实施例1的区别在于： p1
‑
p3代间充质干细胞的培养过程中培养液中未添加10ng/ml干细胞生长因子，10ng/ml成纤维细胞生长因子；p4
‑
p5代间充质干细胞的培养过程中培养液中15ng/ml成纤维细胞生长因子，10mg/ml前列腺素e2，10ng/ml tgf
‑
b，30ug/ml维生素c，10ng/ml肝素钠。
24.图1为实施例1获得的提高treg细胞活性外泌体的电镜图，说明通过该方法所获得提高treg细胞活性的外泌体结构完整，大小均匀其直径在90
‑
120nm之间，纯度较高，无其他杂质。
25.图2为不同外泌体分别与pbmc共培养后treg细胞激活情况，图2中因子处理组的外泌体的treg细胞比例为21%，未处理组的外泌体的treg细胞比例为12.3%，未加外泌体组的treg细胞比例为3.2%，由此可知因子诱导后的外泌体具有激活treg细胞活性的能力。
26.图3为不同外泌体对成纤维细胞增殖s期的影响，图3中成纤维细胞的s期是13.6%，未处理的细胞分泌的外泌体与成纤维细胞共培养后，成纤维细胞的s期是19.8%，因子处理的细胞分泌的外泌体与成纤维细胞共培养后，成纤维细胞的s期是30%，由此可知因子处理的细胞外泌体促进成纤维细胞的增殖。
27.实施例2复苏冻存的p0代间充质干细胞，离心后获得p1代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加1ng/ml干细胞生长因子，1ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；传代的p1间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p2代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加1ng/ml干细胞生长因子，1ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
28.传代的p2间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p3代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加1ng/ml干细胞生长因子，1ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
29.传代的p3间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p4代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加1ng/ml成纤维细胞生长因子，1mg/ml前列腺素e2，1ng/ml tgf
‑
b，10ug/ml维生素c，1ng/ml肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
30.传代的p4间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p5代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加1ng/ml成纤维细胞生长因子，1mg/ml前列腺素e2，1ng/ml tgf
‑
b，10ug/ml维生素c，1ng/ml肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
31.培养3天后待细胞生长至融合度达到85%时，收集细胞上清，300
×
g离心10分钟，离心后收集上清， 2000
×
g离心10分钟，离心后收集上清进行第三次离心10000
×
g离心30分钟，离心后收集上清，进行第四次离心，100000
×
g离心70分钟离心后，弃去上清，加入磷酸盐缓冲液吹打混匀后，进行第五次离心，100000
×
g离心70分钟离心后所得的沉淀既为外泌体。
32.实施例3复苏冻存的p0代间充质干细胞，离心后获得p1代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加1ng/ml干细胞生长因子，1ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养；传代的p1间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p2代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加30ng/ml干细胞生长因子，30ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
33.传代的p2间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p3代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加30ng/ml干细胞生长因子，30ng/ml成纤维细胞生长因子，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
34.传代的p3间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p4代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加30ng/ml成纤维细胞生长因子，30mg/ml前列腺素e2，30ng/ml tgf
‑
b，50ug/ml维生素c，30ng/ml肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
35.传代的p4间充质干细胞培养3天待细胞生长至融合度达到80%时，消化细胞，消化离心后获得p5代间充质干细胞，加入无血清细胞培养液，培养液中添加30ng/ml成纤维细胞生长因子，30mg/ml前列腺素e2，30ng/ml tgf
‑
b，50ug/ml维生素c，30ng/ml肝素钠，十字法摇匀后置于细胞培养箱中培养。
36.培养3天后待细胞生长至融合度达到85%时，收集细胞上清，300
×
g离心10分钟，离心后收集上清， 2000
×
g离心10分钟，离心后收集上清进行第三次离心10000
×
g离心30分钟，离心后收集上清，进行第四次离心，100000
×
g离心70分钟离心后，弃去上清，加入磷酸盐缓冲液吹打混匀后，进行第五次离心，100000
×
g离心70分钟离心后所得的沉淀既为外泌体。
37.实施例4本实施例提供一种treg细胞活性的外泌体，所述提高treg细胞活性的外泌体由上述实施例1的培养方法培养而成。
38.以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何在本技术揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。