一种新型多肽及其在诊断和治疗前列腺癌中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种新型多肽及其在诊断和治疗前列腺癌中的应用。


背景技术：

2.前列腺癌(prostate cancer，pca)是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，是男性常见的恶性肿瘤之一，其发病率在男性中居首位，病死率仅次于肺癌和结直肠癌(siegel rl,miller kd,jemal a.cancer statistics,2017[j].ca cancer j clin，2017,67(1):7
‑
30.)。近年来，前列腺癌的发病率呈逐年上升、年轻化的趋势(feng rm,zong yn,cao sm,et al.current cancer situation in china:good or bad news from the 2018global cancer statistics？[j].cancer commun(lond),2019,39(1):22.)。目前，针对前列腺癌患者的治疗，临床上多采用阻断雄激素及其信号通路的方法来治疗晚期前列腺癌，然而在这种雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy，adt)18～30个月后，大多数患者会进展为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，crpc)(lo em,balasubramanian a,pastuszak aw,et al.bipolar androgen therapy in prostate cancer(update)[j].j sex med,2020,17(5):831
‑
834.)。crpc阶段的前列腺癌治疗手段有限，预后较差。免疫治疗是一种全新的治疗方法，通过调节人体免疫系统达到杀伤肿瘤细胞的目的，可在一定程度上改善部分前列腺癌患者的预后。
[0003]
在免疫治疗中，嵌合抗原受体修饰t细胞(chimeric antigen receptor modification t cells，car
‑
t)在治疗急、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤治疗中已经取得了显著的临床疗效(chen sf,zhu zp,wu yf.clinical application challenges and countermeasures of car
‑
t cell therapy in treatment of tumors[j].chinese journal of tumor biotherapy,2019,26(7):802
‑
809.)，但是，car
‑
t治疗也存在着一些问题，比如脱靶效应、细胞因子释放综合症(cytokine release syndrome，crs)等。自然杀伤(natural killer cell，nk)因其无需预先致敏并且不会导致移植物抗宿主病，在car细胞疗法中受到越来越多的关注，在血液系统肿瘤中，目前研究较多的为嵌合抗原受体修饰nk细胞(chimeric antigen receptor modification nk cells，car
‑
nk)。除血液系统肿瘤外，car细胞疗法在前列腺癌治疗的研究中也取得了较大进展，前列腺癌相关的特异性地识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，taa)的鉴定是有效开发car
‑
t或car
‑
nk的第一步，前列腺癌细胞表达的taa有前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，psma)、前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，psca)、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，psa)，其中以psma和psca为靶点的car
‑
t或car
‑
nk治疗进展较快，其可显著抑制肿瘤细胞的生长，一定程度地延缓疾病的进展。
[0004]
但是目前制备的car
‑
t或car
‑
nk所使用的胞外识别区均为单链抗体，单链抗体的开发依赖于特异性识别肿瘤相关抗原明确的肿瘤，且单链抗体来源于常规的单抗制备并测
序获得，这种制备car
‑
t或car
‑
nk的方法存在如下技术问题：(1)抗体的制备周期长；(2)抗体单链化后特异性结合效率普遍较低；(3)只局限于表面抗原明确的肿瘤，才能够制备对应的car
‑
t或car
‑
nk细胞，无法针对抗原不明确肿瘤。鉴于此，本发明的目的在于提供一种噬菌体
‑
多肽文库筛选tabp
‑
eic(tumor antigen binding peptide
‑
engineering immune cell，肿瘤抗原结合肽
‑
工程化免疫细胞)胞外识别区序列的方法，该方法得到的多肽配体可替代传统的单链抗体用于制备tabp
‑
eic细胞，相对于传统的制备tabp
‑
eic细胞的方法而言，这种开创性的制备方法显著缩短了tabp
‑
eic细胞胞外识别区序列的筛选时间，筛选出的多肽配体与相关肿瘤特异性抗原的结合效率更高，且可以筛选出针对抗原不明确肿瘤的识别多肽配体。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供了一种新型多肽及其在诊断和治疗前列腺癌中的应用，所述多肽经噬菌体
‑
多肽文库筛选得到，能够特异性地结合肿瘤特异性抗原，且结合效率高，筛选得到的多肽能够替代传统的单链抗体用于制备tabp
‑
eic细胞，这种开创性的制备方法显著缩短了tabp
‑
eic细胞胞外识别区序列的筛选时间，筛选出的多肽配体与相关肿瘤特异性抗原的结合效率更高，且可以筛选出针对于抗原不明确肿瘤的识别多肽配体。
[0006]
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0007]
本发明的第一方面提供了一种靶向psma的新型多肽。
[0008]
进一步，所述多肽包括如seq id no:1所示的氨基酸序列的多肽、或其活性片段、类似物；
[0009]
优选地，所述活性片段、类似物的氨基酸序列具有与如seq id no:1所示的氨基酸序列至少95％的相同性；
[0010]
更优选地，所述多肽的核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0011]
本发明的第二方面提供了一种融合多肽。
[0012]
进一步，所述融合多肽包括至少两个任意顺序的亚基；
[0013]
优选地，其中一个亚基对psma是特异性的；
[0014]
优选地，另一种或多种亚基对以下组中的任一种或多种抗原是特异性的：psma、psca、psa、pap、msln、cd19、cd20、cd22、cd27、cd28、cd38、cd38、cd45、cd56、cd81、cd117、cd138、cd200、bcma；
[0015]
更优选地，所述亚基包括对psma具有结合特异性的多肽；
[0016]
最优选地，所述多肽为本发明第一方面所述的多肽。
[0017]
本发明的第三方面提供了一种多肽衍生物。
[0018]
进一步，所述多肽衍生物包括含有本发明第一方面所述的多肽的缀合物、含有本发明第二方面所述的融合多肽的缀合物、含有本发明第一方面所述的多肽的肿瘤抗原结合肽、含有本发明第二方面所述的融合多肽的肿瘤抗原结合肽；
[0019]
优选地，所述含有本发明第一方面所述的多肽的缀合物、含有本发明第二方面所述的融合多肽的缀合物包括对所述多肽和/或融合多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或连接用于多肽检测或纯化的标签所得到的产物，或与其他物质结合得到的产物；
[0020]
更优选地，所述的常规修饰包括氨基化、羟基化、羧基化、羰基化、酰胺化、烷基化、磷酸化、糖基化、环化、生物素化、乙酰化、酯化、荧光基团修饰、聚乙二醇peg修饰、固定化修饰；
[0021]
更优选地，所述的标签包括his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、c
‑
myc、profinityexact、igg、flag；
[0022]
更优选地，所述其他物质包括多肽、蛋白、药物；
[0023]
最优选地，所述蛋白包括血清白蛋白，所述多肽包括fc区、信号肽、多肽标记，所述药物包括双膦酸盐类药物、环烯醚萜化合物；
[0024]
优选地，所述含有本发明第一方面所述的多肽的肿瘤抗原结合肽、含有本发明第二方面所述的融合多肽的肿瘤抗原结合肽包括含有抗原识别区的胞外信号结构域、连接至所述胞外信号结构域的跨膜结构域、连接至所述跨膜结构域的胞内信号结构域；
[0025]
更优选地，所述胞外信号结构域包括多肽；
[0026]
最优选地，所述多肽特异性地结合抗原psma、psca、psa、pap、msln、cd19、cd20、cd22、cd27、cd28、cd38、cd38、cd45、cd56、cd81、cd117、cd138、cd200、bcma；
[0027]
最优选地，所述多肽特异性地结合抗原psma；
[0028]
最优选地，所述多肽为本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的融合多肽；
[0029]
更优选地，所述胞外信号结构域还包括铰链区；
[0030]
最优选地，所述铰链区包括以下任一种或多种分子的铰链区：cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos、cd154；
[0031]
更优选地，所述跨膜结构域包括以下任一种或多种分子的跨膜结构域：cd3ε、cd8、cd9、cd28、cd45、cd4、cd5、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、icos；
[0032]
更优选地，所述胞内信号结构域包括以下任一种或多种分子的信号转导结构域：cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ，cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d；和/或包含共刺激分子的共刺激结构域，共刺激分子包括cd27、4
‑
1bb、cd30、cd40、icos、cd28、ox40、nkg2c、b7
‑
h3、fc受体相关γ链；
[0033]
更优选地，所述肿瘤抗原结合肽还包括信号肽，所述信号肽来源于以下分子：t细胞受体的α链及β链、cd28、cd3ε、cd35ζ、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、icos、cd154、gitr。
[0034]
本发明的第四方面提供了一种核酸分子。
[0035]
进一步，所述核酸分子包括编码本发明第一方面所述的多肽的核苷酸序列、编码本发明第二方面所述的融合多肽的核苷酸序列；
[0036]
优选地，所述核酸分子包括选自下列组中的核酸分子：
[0037]
(a)编码如seq id no:1所示的氨基酸序列的多肽、或其活性片段、类似物的核酸分子；
[0038]
(b)编码本发明第二方面所述的融合多肽的核酸分子；
[0039]
(c)与(a)或(b)互补的核酸分子；
[0040]
(d)与(a)或(b)或(c)有至少70％相同性的核酸分子；
[0041]
更优选地，所述核酸分子为编码seq id no:1所示氨基酸序列的核酸分子、编码本发明第二方面所述的融合多肽的核酸分子；
[0042]
最优选地，所述编码seq id no:1所示氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0043]
本发明的第五方面提供了一种载体。
[0044]
进一步，所述载体包括本发明第四方面所述的核酸分子；
[0045]
优选地，所述载体为本发明第四方面所述的核酸分子与质粒、病毒载体或运载体表达载体构建而成的重组载体；
[0046]
更优选地，所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体、慢病毒载体。
[0047]
本发明的第六方面提供了一种工程化的宿主细胞。
[0048]
进一步，所述工程化的宿主细胞包含本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的融合多肽、本发明第三方面所述的多肽衍生物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体；
[0049]
优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞；
[0050]
更优选地，所述免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞、粒细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞。
[0051]
进一步，在本发明的具体实施例中所述宿主细胞称为tabp
‑
eic(tumor antigen binding peptide
‑
engineering immune cell，肿瘤抗原结合肽
‑
工程化免疫细胞)。
[0052]
本发明的第七方面提供了一种药物组合物。
[0053]
进一步，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的融合多肽、本发明第三方面所述的多肽衍生物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的工程化的宿主细胞；
[0054]
优选地，所述药物组合物还可包括药学上可接受的载体和/或辅料。
[0055]
进一步，所述药学上可接受的载体和/或辅料在remington's pharmaceutical sciences中有详细的记载。
[0056]
本发明的第八方面提供了一种试剂盒。
[0057]
进一步，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的融合多肽、本发明第三方面所述的多肽衍生物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的工程化的宿主细胞。
[0058]
本发明的第九方面提供了如下任一种方法：
[0059]
(1)一种本发明第一方面所述的多肽的筛选方法，所述方法包括如下步骤：以psma为靶标，采用噬菌体
‑
多肽文库筛选出本发明第一方面所述的多肽；
[0060]
(2)一种制备本发明第六方面所述的工程化的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的融合多肽、本发明第三方面所述的多肽衍生物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体引入到宿主细胞中，得到本发明第六方面所述的工程化的宿主细胞；
[0061]
优选地，所述核酸分子或载体通过包括缀合、转化、转染、转导、电穿孔的方式引入到宿主细胞中；
[0062]
(3)一种非诊断和非治疗目的地检测样本中psma的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的多肽和/或本发明第二方面所述的融合多肽与样本接触，检测所述多肽和/或融合多肽与样本中psma的反应；
[0063]
优选地，所述反应通过荧光、酶显色、化学发光进行检测；
[0064]
优选地，所述方法还包括检测样本中psma的含量；
[0065]
优选地，所述样本选自以下组的一种或多种：组织、血液、血浆、血清、尿液、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、组织学制备物；
[0066]
(4)一种生产多肽的方法，所述方法包括如下步骤：培养本发明第六方面所述的工程化的宿主细胞，从细胞培养物中分离出包含如seq id no:1所示的氨基酸序列的多肽。
[0067]
进一步，所述方法还包括一种治疗有需要的患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的本发明七方面所述的药物组合物。
[0068]
进一步，所述方法还包括一种诊断受试者是否患有表达psma的肿瘤的方法，所述方法包括使用本发明第一方面所述的多肽和/或本发明第二方面所述的融合多肽检测所述受试者来源的样本中psma的含量；
[0069]
优选地，所述方法还包括将所述受试者来源的样本中psma的含量与psma在已知标准品或参照品中的含量进行比较，并确定所述受试者来源的样本中psma的水平是否落入与肿瘤相关的psma水平内；
[0070]
优选地，所述方法还包括用本发明第八方面所述的试剂盒检测所述受试者来源的样本中psma的水平，进而判断所述受试者是否患有肿瘤；
[0071]
优选地，所述样本选自以下组的一种或多种：组织、血液、血浆、血清、尿液、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、组织学制备物；
[0072]
优选地，所述肿瘤包括实体瘤、非实体瘤；
[0073]
更优选地，所述实体瘤包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肺腺癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、血管内皮瘤、睾丸癌、皮肤癌；
[0074]
更优选地，所述非实体瘤包括急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、造血系肿瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性髓性白血病、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤；
[0075]
最优选地，所述肿瘤为前列腺癌。
[0076]
本发明的第十方面提供了如下任一方面的应用：
[0077]
(1)本发明第一方面所述的多肽在制备融合多肽、多肽衍生物、核酸分子、载体中的应用；
[0078]
(2)本发明第二方面所述的融合多肽在制备多肽衍生物、核酸分子、载体中的应用；
[0079]
(3)本发明第三方面所述的多肽衍生物在制备核酸分子、载体中的应用；
[0080]
(4)本发明第四方面所述的核酸分子在制备载体中的应用；
[0081]
(5)本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的融合多肽、本发明第三方面所述的多肽衍生物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体在制备用于肿瘤免疫治疗的免疫细胞中的应用；
[0082]
(6)本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的融合多肽、本发明第三方面所述的多肽衍生物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发
明第六方面所述的工程化的宿主细胞在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
[0083]
(7)本发明第一方面所述的多肽、本发明第二方面所述的融合多肽、本发明第三方面所述的多肽衍生物、本发明第四方面所述的核酸分子、本发明第五方面所述的载体、本发明第六方面所述的工程化的宿主细胞在制备检测psma和/或诊断肿瘤的试剂盒中的应用；
[0084]
(8)本发明第六方面所述的工程化的宿主细胞在预防和/或治疗肿瘤中的应用；
[0085]
(9)本发明第七方面所述的药物组合物在预防和/或治疗肿瘤中的应用；
[0086]
(10)本发明第八方面所述的试剂盒在检测psma和/或诊断肿瘤中的应用；
[0087]
优选地，所述检测psma和/或诊断肿瘤包括检测待测样品中psma的含量或水平、诊断受试者是否患有肿瘤；
[0088]
优选地，所述融合多肽为本发明第二方面所述的融合多肽；
[0089]
优选地，所述多肽衍生物为本发明第三方面所述的多肽衍生物；
[0090]
优选地，所述核酸分子为本发明第四方面所述的核酸分子；
[0091]
优选地，所述载体为本发明第五方面所述的载体；
[0092]
优选地，所述肿瘤包括实体瘤、非实体瘤；
[0093]
更优选地，所述实体瘤包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肺腺癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、血管内皮瘤、睾丸癌、皮肤癌；
[0094]
更优选地，所述非实体瘤包括急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、造血系肿瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性髓性白血病、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤；
[0095]
最优选地，所述肿瘤为前列腺癌。
[0096]
本发明的优点和有益效果：
[0097]
(1)本发明首次将经噬菌体
‑
多肽文库筛选得到的特异性多肽替代传统的单链抗体用于制备tabp
‑
eic细胞，相对于传统的制备tabp
‑
eic细胞的方法而言，这种开创性的制备方法显著缩短了tabp
‑
eic细胞胞外识别区序列的筛选时间，筛选出的多肽配体与相关肿瘤特异性抗原的结合效率更高，且可以筛选出针对抗原不明确肿瘤的识别多肽配体；
[0098]
(2)本发明提供了一种新型多肽，所述多肽能够特异性地结合前列腺癌相关肿瘤抗原psma，具有与抗原结合效率高、筛选时间短等优点，不仅能够应用于对前列腺癌相关肿瘤抗原psma的检测，而且能够替代传统的单链抗体用于制备tabp
‑
eic细胞，进而用于前列腺癌的免疫治疗中；
[0099]
(3)本发明提供的以肽段配体替代单链抗体制备tabp
‑
eic细胞的开创性的方法，为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路，在肿瘤的免疫细胞治疗中具有极高的应用价值。
附图说明
[0100]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0101]
图1显示多肽hfk在psma表达量较高的lncap细胞系中所得的免疫荧光结果图；
[0102]
图2显示多肽hfk在psma表达量低的pc3细胞系中所得的免疫荧光结果图。
具体实施方式
[0103]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下
可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0104]
实施例1以psma为靶标筛选获得特异性结合psma的多肽hfk
[0105]
1、实验材料
[0106]
本发明实施例中所使用的ph.d.
‑
12噬菌体展示肽库试剂盒购自于new england biolabs(neb)公司，目录号为e8110sc。
[0107]
2、ph.d.
‑
12噬菌体展示肽库试剂盒组成
[0108]
随机十二肽噬菌体展示文库：100μl，1.5
×
10
13
pfu/ml，贮存于含50％甘油的tbs溶液中，复杂度～2.7
×
109个转化子；
‑
28giii测序引物：5
’‑
hogtatgggattttgctaaacaac
‑3’
，100pmol，1pmol/μl；
‑
96giii测序引物：5
’‑
hoccctcatagttagcgtaacg
‑3’
，100pmol/μl，1pmol/μl；e.coli er2738宿主菌f’laciqδ(lacz)m15 proa b zzf::tn10(tetr)/fhua2 supe thiδ(lac
‑
proab)δ(hsdms
‑
mcrb)5(rk
–
mk
–
mcrbc
–
)：该菌株以含50％甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞，贮存于
‑
70℃；链霉亲和素streptavidin，冻干粉1.5mg；生物素：10mm 100μl。
[0109]
3、实验方法
[0110]
本发明采用ph.d.
‑
12噬菌体展示肽库试剂盒筛选出与psma特异性结合的多肽hfk，所述方法具体如下：
[0111]
第一天
[0112]
根据需要同时在其上进行文库淘选的靶分子的数量和种类不同，淘选试验在单个灭菌聚苯乙烯培养皿、12或24孔板、96孔微量板中进行，每种靶分子至少包被一个板(或一个孔)，下述方法中给出的量是60
×
15mm培养皿的用量，括号中为微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相应地调整此用量，但每种情况下，加入的噬菌体数量都是相同的：1.5
×
10
11
个病毒子；
[0113]
(1)准备100μg/ml的靶分子溶液(溶于0.1m ph 8.6的nahco3)，若需要稳定靶分子，也可使用其他相似离子强度的缓冲液(含金属离子等)；
[0114]
(2)每板(孔)加入1.5ml(微孔板每孔150μl)上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润；
[0115]
(3)在增湿容器(如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒)中4℃轻微震荡，孵育过夜，平板在此容器中4℃贮存备用；
[0116]
第二天
[0117]
(4)挑er2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于10ml lb液体培养基中，如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将er2738接种于20ml lb液体培养基，用250ml三角瓶，37℃剧烈震荡培养；
[0118]
(5)倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液，每板(或孔)加满封阻液，4℃作用至少1h；
[0119]
(6)速洗板6次，每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液(或使用自动洗板机)；
[0120]
(7)用1ml(微孔板则用100μl)的tbst缓冲液稀释4
×
10
10
的噬菌体(即10μl的原始
文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动10
‑
60min；
[0121]
(8)倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液；
[0122]
(9)按6中所述方法用tbst缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染；
[0123]
(10)根据所研究的分子间相互作用，用1ml(微孔板则用100μl)适当的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体，将靶分子的已知配体以0.1
‑
1mm的浓度溶于tbs溶液中或者用游离靶分子溶液(～100μg/ml溶于tbs中)从固定靶分子上将结合的噬菌体竞争性洗脱下来，室温温和摇动10
‑
60min，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中；也可用非特异性缓冲液如0.2m glycine
‑
hcl(ph 2.2)，1mg/ml bsa来分离已结合的分子：温和摇动>10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，然后再用150μl(微量孔则用15μl)1m tris
‑
hcl(ph 9.1)中和上述洗脱液；
[0124]
(11)按上述常规m13方法中的程序测定少量(～1μl)洗脱物的滴度，如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述：必要时可将剩余洗脱物4℃贮存过夜，第二天扩增，这时，可将er2738在lb
‑
tet培养基中过夜培养，第二天将培养物1:100稀释于20ml lb中(用250ml三角瓶盛装)，加入未扩增洗脱物，37℃剧烈摇动培养4.5h，继续第13步；
[0125]
(12)扩增剩余洗脱物：将洗脱物加入到20ml er2738培养物中(菌体处于对数前期)，37℃剧烈摇动培养4.5h；
[0126]
(13)将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心；
[0127]
(14)将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的peg/nacl，让噬菌体4℃沉淀至少60min，过夜；
[0128]
第三天
[0129]
(15)4℃10,000rpm离心peg沉淀15min，倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液；
[0130]
(16)沉淀物重悬于1ml tbs中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀；
[0131]
(17)上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的peg/nacl再沉淀，冰上孵育15
‑
60min，4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清；
[0132]
(18)沉淀物重悬于200μl tbs，0.02％nan3中，离心1min，沉淀任何残余的不溶物，上清转入新鲜管中，此即为扩增后的洗脱物；
[0133]
(19)根据上述常规m13方法用lb/iptg/xgal平板滴定扩增后的洗脱物，4℃贮存；
[0134]
(20)再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用；
[0135]
第四和第五天
[0136]
(21)计数板上蓝斑数确定滴度，用这个值来计算相应于1
‑2×
10
11
pfu的加入量；若滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109pfu的噬菌体加入量进行试验；
[0137]
(22)进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中1
‑2×
10
11
pfu的噬菌体量重复步骤4
‑
18，在清洗步骤中将tween的浓度增至0.5％(v/v)；
[0138]
(23)在lb/iptg/xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度；
[0139]
(24)再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用；
[0140]
第六天
[0141]
(25)进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2
×
10
11
pfu的噬菌体量重复步骤4
‑
11，清洗步骤中同样用0.5％(v/v)的tween；
[0142]
(26)在lb/iptg/xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度，第三轮洗脱物不必再扩增，除非还要进行第四轮淘选，滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用：只要注意平板培养时间不要超过18h，培养时间过长容易出现缺失，其余洗脱物4℃贮存；
[0143]
(27)挑一er2738单克隆于lb
‑
tet培养基中培养过夜。
[0144]
4、实验结果
[0145]
实验结果显示，筛选得到的与psma特异性结合的多肽hfk的氨基酸序列为hfkaphtvrlks(seq id no:1)，核苷酸序列为cacttcaaggccccccacaccgtgagactgaagagc(seq id no:2)。
[0146]
实施例2免疫荧光技术鉴定多肽hfk对前列腺癌细胞的亲和力
[0147]
1、实验材料
[0148]
前列腺癌细胞株pc3细胞(crl
‑
1435)、前列腺癌细胞株lncap细胞(crl
‑
1740)购自于atcc公司。
[0149]
2、实验方法
[0150]
(1)固定
[0151]
用新配制的4％多聚甲醛溶液在培养板中固定细胞15分钟，dpbs清洗样品，小心操作避免细胞从玻片上脱落；
[0152]
(2)清洗
[0153]
dpbs洗三遍，每次5分钟；
[0154]
(3)封闭
[0155]
以2％bsa在4℃温度条件下封闭30分钟，dpbs洗两次，每次5分钟；
[0156]
(4)多肽孵育
[0157]
加入使用fitc(异硫氰酸荧光素)标记的hfk多肽(终浓度1μg/ml)，黑暗条件下在湿度箱内4℃过夜孵育；
[0158]
(5)清洗
[0159]
dpbs洗三遍，每次5分钟；
[0160]
(6)封片及观察
[0161]
加入0.5μg/ml dapi(采用pbs配制)染色10分钟，也可采用其它的染核染料；
[0162]
用pbs洗三遍，去除多余的dapi，加入20μl封片剂封片，在显微镜下观察，注意荧光强度随着灯光刺激衰减，并尽快拍照。
[0163]
3、实验结果
[0164]
实验结果显示，实施例1中筛选得到的多肽hfk在psma表达量较高的lncap细胞系及psma表达量低的pc3细胞系中所得的免疫荧光结果图分别见图1和图2，其中，蓝色为细胞核染色，绿色为多肽hfk以绿色荧光染料标记后与细胞表面抗原psma结合，结果表明经筛选获得的多肽hfk能够特异性识别psma阳性的前列腺癌细胞系(lncap细胞系)。
[0165]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进
和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。