瘤菌根菌菌株1219及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种瘤菌根菌菌株1219及其应用。


背景技术：

2.青天葵是我国岭南常用稀有中草药，为广西“十大南药”之一；又名独叶莲、珍珠叶、坠千斤等；其来源于兰科芋兰属多年生宿根小草木毛唇芋兰nervilia fordii(hanee)schltr.的全草或叶。性甘凉，具有清热润肺止咳，解毒消肿止痛等功效；临床上常用于治疗各种肺部疾病，如小儿呼吸道感染、肺炎等。
3.兰科植物种子具有细小如尘的特征，故也称为“灰尘种子”且种子量大，每一颗成熟的果实含种子超过数万粒，但是在自然条件下种子萌发率较低，同时近年来，很多药用植物野生资源不合理的过度开发利用，造成了资源面临枯竭，人工种植成为一条必然之路。现今人工繁育兰科植物方法主要通过有根茎分株繁殖和组织培养两种；而传统根茎分株繁殖速度慢，效率低，种苗成本高，很难满足大面积的栽培需求；而组织培养所生产的无菌试管苗生长缓慢、移栽成活率低。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
5.本发明还有一个目的是提供一种瘤菌根菌菌株1219，分类命名为：瘤菌根属epulorhiza sp.，所述瘤菌根菌菌株1219于2021年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.21960。
6.本发明还提供一个目的是提供一种瘤菌根菌菌株1219的应用，其所获得的瘤菌根菌菌株1219可提高白及种子的萌发率及促进幼苗的生长。
7.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种瘤菌根菌菌株1219，分类命名为：瘤菌根属epulorhiza sp.，所述瘤菌根菌菌株1219于2021年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.21960。
8.还提供一种瘤菌根菌菌株1219促进白及种子萌发的方法。包括以下步骤：
9.步骤一、将所述瘤菌根菌菌株1219接种于固体培养基中培养；
10.步骤二、将白及种子播撒在固体培养基上，置于20～30℃条件下培养，在培养时于光照条件下培养12h，黑暗条件下培养12h，光照、黑暗交替培养9周，其中，光照强度为1000～2000lx。
11.优选的是，所述固体培养基为燕麦固体培养基。
12.优选的是，所述燕麦固体培养基包括：2.5g/l燕麦、6g/l琼脂，ph＝5.2。
13.优选的是，在播撒白及种子前先在固体培养及上铺设尼龙网，然后将白及种子播
撒在尼龙网上。
14.优选的是，在进行光照、黑暗交替培养前，先在黑暗处进行培养6～8d，然后再进行光照、黑暗交替培养。
15.优选的是，白及种子的获取方法为：选取完整无损的白及硕果，将白及硕果先至于75％乙醇溶液中浸泡20～40s，然后在2.5％次氯酸钠溶液中浸泡5～15min，浸泡结束后使用无菌水冲洗，再使用滤纸吸干硕果表面水分，最后采用无菌手术刀切开硕果即可获得白及种子。
16.本发明还提供一种瘤菌根菌菌株1219在促进白及种子萌发中的应用。
17.本发明至少包括以下有益效果：
18.第一、本发明的瘤菌根菌菌株1219通过共生萌发实验将白及种子和空白对照组分别在燕麦琼脂培养基上培养，通过种子萌发率的比较，成功地获得促进白及种子萌发的有效菌株，从而为利用白及种子和真菌共生萌发来高效培育种苗、种苗回归野外环境及种群重建提供一条高效的途径。
19.第二、本发明对比现有白及共生萌发方法，具有操作简单方法简易，且萌发时间更短，萌发率高，且种苗质量优异的特点。
20.第三、本发明所获得的瘤菌根菌菌株1219可提高白及种子的萌发率及促进幼苗的生长，即瘤菌根菌菌株1219具有促兰科植物种子萌发的生物活性。
21.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
22.图1为本发明其中一个实施例所述的白及种子播撒后第三周的生长状态图；
23.图2为本发明其中一个实施例所述的白及种子播撒后第九周的生长状态图。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
25.<实施例1>
26.瘤菌根菌菌株1219，分类命名为：瘤菌根属epulorhiza sp.，所述瘤菌根菌菌株1219于2021年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.21960。
27.瘤菌根菌菌株1219的获取方法具体为：
28.s1、选取青天葵健康植株，整株挖出并带根际土及环境土放入花盆，于12h内将样品送达实验室；
29.s2、将青天葵的根、茎、叶组织分离并将青天葵根使用自来水冲洗干净，然后将青天葵根置于75％的乙醇溶液中浸泡30s，再置于2.5％次氯酸钠溶液中浸泡3min，使用无菌水漂洗三次，再使用灭菌滤纸吸附青天葵上多余的水分，最后使用无菌刀将青天葵切为5mm
×
5mm的小片组织块；
30.s3、将小片组织块分置于添加有100mg/l链霉素、100mg/l四环素的pda平皿上进行
培养，然后置于黑暗、25℃条件下培养至菌落直径生长至1cm，挑选菌落边缘菌丝转接至另一个pda平皿上进一步纯化形成单一纯菌落，即为瘤菌根菌菌株1219。
31.其中，2020年5月在广西省桂林市三皇乡县区采集青天葵。
32.<实施例2>
33.瘤菌根菌菌株1219，分类命名为：瘤菌根属epulorhiza sp.，所述瘤菌根菌菌株1219于2021年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.21960(获取方法同实施例1)。
34.瘤菌根菌菌株1219在促进白及种子萌发中的应用。
35.瘤菌根菌菌株1219促进白及种子萌发的方法，包括以下步骤：
36.步骤一、将所述瘤菌根菌菌株1219接种于固体培养基中培养；
37.步骤二、将白及种子播撒在固体培养基上，置于20℃条件下培养，在培养时于光照条件下培养12h，黑暗条件下培养12h，光照、黑暗交替培养9周，其中，光照强度为1000lx。
38.所述固体培养基为燕麦固体培养基。
39.所述燕麦固体培养基包括：2.5g/l燕麦、6g/l琼脂，ph＝5.2。
40.在播撒白及种子前先在固体培养及上铺设尼龙网(200目)，然后将白及种子播撒在尼龙网上。
41.在进行光照、黑暗交替培养前，先在黑暗处进行培养6d，然后再进行光照、黑暗交替培养。
42.白及种子的获取方法为：选取完整无损的白及硕果，将白及硕果先至于75％乙醇溶液中浸泡20s，然后在2.5％次氯酸钠溶液中浸泡5min，浸泡结束后使用无菌水冲洗，再使用滤纸吸干硕果表面水分，最后采用无菌手术刀切开硕果即可获得白及种子。
43.<实施例3>
44.瘤菌根菌菌株1219，分类命名为：瘤菌根属epulorhiza sp.，所述瘤菌根菌菌株1219于2021年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.21960(获取方法同实施例1)。
45.瘤菌根菌菌株1219在促进白及种子萌发中的应用。
46.瘤菌根菌菌株1219促进白及种子萌发的方法，包括以下步骤：
47.步骤一、将所述瘤菌根菌菌株1219接种于固体培养基中培养；
48.步骤二、将白及种子播撒在固体培养基上，置于25℃条件下培养，在培养时于光照条件下培养12h，黑暗条件下培养12h，光照、黑暗交替培养9周，其中，光照强度为1500lx。
49.所述固体培养基为燕麦固体培养基。
50.所述燕麦固体培养基包括：2.5g/l燕麦、6g/l琼脂，ph＝5.2。
51.在播撒白及种子前先在固体培养及上铺设尼龙网(200目)，然后将白及种子播撒在尼龙网上。
52.在进行光照、黑暗交替培养前，先在黑暗处进行培养7d，然后再进行光照、黑暗交替培养。
53.白及种子的获取方法为：选取完整无损的白及硕果，将白及硕果先至于75％乙醇
溶液中浸泡30s，然后在2.5％次氯酸钠溶液中浸泡10min，浸泡结束后使用无菌水冲洗，再使用滤纸吸干硕果表面水分，最后采用无菌手术刀切开硕果即可获得白及种子。
54.<实施例4>
55.瘤菌根菌菌株1219，分类命名为：瘤菌根属epulorhiza sp.，所述瘤菌根菌菌株1219于2021年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.21960(获取方法同实施例1)。
56.瘤菌根菌菌株1219在促进白及种子萌发中的应用。
57.瘤菌根菌菌株1219促进白及种子萌发的方法，包括以下步骤：
58.步骤一、将所述瘤菌根菌菌株1219接种于固体培养基中培养；
59.步骤二、将白及种子播撒在固体培养基上，置于30℃条件下培养，在培养时于光照条件下培养12h，黑暗条件下培养12h，光照、黑暗交替培养9周，培养结束，其中，光照强度为2000lx。
60.所述固体培养基为燕麦固体培养基。
61.所述燕麦固体培养基包括：2.5g/l燕麦、6g/l琼脂，ph＝5.2。
62.在播撒白及种子前先在固体培养及上铺设尼龙网(200目)，然后将白及种子播撒在尼龙网上。
63.在进行光照、黑暗交替培养前，先在黑暗处进行培养8d，然后再进行光照、黑暗交替培养。
64.白及种子的获取方法为：选取完整无损的白及硕果，将白及硕果先至于75％乙醇溶液中浸泡40s，然后在2.5％次氯酸钠溶液中浸泡15min，浸泡结束后使用无菌水冲洗，再使用滤纸吸干硕果表面水分，最后采用无菌手术刀切开硕果即可获得白及种子。
65.<空白对照组>
66.基于实施例3促进白及种子萌发，其中，不同的是：未添加瘤菌根菌菌株1219，即促进白及种子萌发的方式为：
67.将白及种子播撒在固体培养基上，置于25℃条件下培养，在培养时于光照条件下培养12h，黑暗条件下培养12h，光照、黑暗交替培养，其中，光照强度为1500lx。
68.所述固体培养基为燕麦固体培养基(oma)。
69.所述燕麦固体培养基包括：2.5g/l燕麦、6g/l琼脂，ph＝5.2。
70.在播撒白及种子前先在固体培养及上铺设尼龙网，然后将白及种子播撒在尼龙网上。
71.在进行光照、黑暗交替培养前，先在黑暗处进行培养至白及种子萌发形成原球茎，然后再进行光照、黑暗交替培养。
72.白及种子的获取方法为：选取完整无损的白及硕果，将白及硕果先至于75％乙醇溶液中浸泡30s，然后在2.5％次氯酸钠溶液中浸泡10min，浸泡结束后使用无菌水冲洗，再使用滤纸吸干硕果表面水分，最后采用无菌手术刀切开硕果即可获得白及种子。
73.<瘤菌根菌菌株1219鉴定>
74.1.1瘤菌根菌菌株1219形态学鉴定
75.本发明上述瘤菌根菌菌株1219在pda平皿上培养三周后，菌落整体呈白色略带黄
色，贴培养基呈放射状生长；表面平滑且具有润泽感，菌丝下沉生长，有少量白色气生菌丝，呈长绒状；在光学显微镜下观察，菌丝体无色、光滑，菌丝分枝近直角，分枝略缢，距分枝点较近处形成隔膜；有大量念珠状厚垣孢子，呈椭圆形或短圆柱状。
76.1.2瘤菌根菌菌株1219分子生物学鉴定
77.取出瘤菌根菌菌株1219并置于pda平皿，在黑暗条件下培养2周后，用无菌刀片刮取表面菌丝进行提取dna，提取方法参照真菌dna提取试剂盒使用指南进行总dna的提取(e.z.n.atm fungal dna kit，omega bio
‑
tek，doraville，gergia，usa)；its扩增引物序列为通用引物its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑3’
)和its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc
‑3’
)，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；扩增反应在50μlpcr反应体系中进行，包括x santaq pcr mix 25μl、模板dna(20～50ng
·
μl
‑1)2～10μl、引物(5μm)各2μl，加ddh2o(双蒸水)补足50μl。
78.pcr扩增反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火25s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃再延伸7min，4℃终止反应暂存，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化测序。
79.瘤菌根菌菌株1219的核糖体脱氧核糖核酸内部转录间隔区序列为：
80.caatgatgtcacggatgtgctggcggcttaacaccccgcatgtgcactccttaacacaattacacacctgtgaacctcgaaccgtgtctgtgtgctgatcccgtagggagatgcgtgcgcgcgcgcgttcttactttacaaaacccctgttaactaaagctctagaaagtgttggttaataaaaaacaaccatcagcaacggatctcttggcattccaatcgatgaagaacgtagcgaattgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgccctctggtattccggagggcatgcccggttgagtgtcatgaatatctcaactctaacgttttgttaacggtcttgtgggtgaagcctgtggtctagcgagattgcaggttgtaatccttaggacttgaagtgttagagattggacttgagttctgttggcccgctaggtcaactgactcgaaattgattagcgatgcgtgatccattgggtccatctcggcgtgataagttgatcgctgtaaaggaaccatgtgggtgtggcttgcttctaatcgtcttaggacagctttgacatttacacctcaactcgggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaaaagccgggaggaaga。
81.将瘤菌根菌菌株1219所得序列在genbank数据库中进行blast比对，其与gu166409.1epulorhiza sp.相似性最高达98.48％；相似性≥95％，暂定为同一属；结合形态学特征最终确定瘤菌根菌菌株1219归属于瘤菌根属epulorhiza sp.。
82.<实验表征>
83.1、各阶段白及种子萌发情况
84.采用实施例3和空白对照组的方式进行撒播白及种子，播种后每周(检测两组白及种子萌发情况。在体视显微镜下观察记录种子萌发及原球茎发育情况。种子萌发和原球茎发育情况参照文献xm tan&cl wang(2014)的方法进行统计，并增加阶段6、阶段7、阶段8，白及种子萌发分为9个阶段，即：阶段0描述为种子未萌发，种子存活；阶段1描述为胚膨大，产生假根(发芽)；阶段2描述为胚继续增大，种皮破裂，进一步产生假根；阶段3描述为原球茎形成，出现芽尖；阶段4描述为长芽尖形成第一片子叶；阶段5描述为第一片子叶完全形成，阶段6描述为第二片子叶出现，阶段7描述为第二片子叶完全形成，阶段8植株完全形成并出现根系。
85.根据上述方式统计各个时间下实施例3与空白对照组各阶段种子的占比以及各处理下的种子萌发率(观察在培养9周内白及种子的变化)，实施例3光暗交替培养第3周后种
子萌发率达97.89％，对比ck对照同比增长12.68％。在光暗交替培养后第2周出现3阶段原球茎，萌发率达43.26％；第3周大部分达第4阶段，占比达63.16％，且有1.05％的达第5阶段的种子；第4周出现6阶段；第5周出现7阶段，第6周实验组出现8阶段，且7、8阶段数量占比对比空白组存在显著差异；当培养时间达9周时，实施例3中76.34％白及种子均达到8阶段，而空白对照组仅7.35％达到8阶段。上述第3周及第9周结果如图1、图2所示。
86.2、9周后幼苗生物指标
87.统计实施例3和空白对照组培养9周后的生物指标包括株高、根长、根数/条、子叶数/片、鲜重/g，结果如表1所示；
88.表1为9周后幼苗生物指标
[0089] 株高(mm)根长(mm)根数(条)子叶数(片)鲜重(g)实施例38.7606385715.2009575340.7260099822.5912745970.003183297空白对照组2.6258928570.8566666670.0535714291.8214285710.000548214优化倍数3.346.0713.551.425.81
[0090]
由表1可知白及种苗状态实施例3远优于空白对照组，实施例3根分化多，成苗整齐，叶色浓绿，且植株健壮；实施例3幼苗鲜重为空白对照组的5.81倍，株高同比增长达3.34倍；实施例3根萌发数量总体占比是空白对照组的13.55倍，根长为6.07倍。上述实验结果可以说明本发明对白及种子萌发及幼苗生长均具有显著效应，即瘤菌根菌菌株1219具有促兰科植物种子萌发的生物活性。
[0091]
3、现有技术中白及种子萌发率
[0092]
数据源于文献记载，现有技术中白及种子萌发率如表2所示；
[0093]
表2为现有技术及实施例3白及种子萌发率
[0094]
由表2可知，本发明(实施例3)可有效促进白及种子萌发，而且萌发时间短、萌发
[0095][0096]
率高。
[0097]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
[0098]
[0099]
[0100]