一种基于膜吸附的黄瓜基因DNA快速提取扩增方法与流程

一种基于膜吸附的黄瓜基因dna快速提取扩增方法
技术领域
1.本发明涉及黄瓜基因dna提取扩增技术领域，特别是涉及一种黄瓜基因dna快速提取扩增方法。


背景技术：

2.黄瓜是遍布世界的重要蔬菜，黄瓜基因组计划已经完成，各种基因组学研究方法正在如火如荼展开，特别是对黄瓜基因组的改造，在抗病性、抗虫害、抗逆性、抗除草剂、品质改良等方面进行了许多研究，得到了多种性状优良的品种，但是为了更好地品种确证，对黄瓜特定基因的鉴定与分析是常用的实验方法。
3.在黄瓜特定基因的鉴定与分析中，首先提取黄瓜基因dna。目前常用的提取方法是ctab法和sds法，一般以新鲜叶片为原材料，需要研磨等步骤，较为费时费力，而且在市场上销售的黄瓜也很难找到叶片。商品化试剂盒多采用二氧化硅吸附离心法与磁珠吸附法。在二氧化硅吸附离心法中，在高浓度超离液盐（chaotropic salt）存在的情况下核酸与固体二氧化硅支撑物结合，然后通过一系列清洗和离心步骤去除杂质，最后在低浓度盐溶液中从二氧化硅洗脱核酸。而磁珠吸附法是在磁珠表面进行官能团修饰，实现与核酸结合，然后利用磁铁吸附磁珠来进行分离和清洗杂质，然后将磁珠上的核酸洗脱。
4.滤膜（cellulose membrane）吸附法也可以用于核酸的提取，修饰后的滤膜可以从人血液里提取基因组dna，也可以在多种生物体里实现核酸快速提取，还可以用于法医中dna证物的长期保存。膜吸附法操作简便，不需要离心机、磁铁等辅助设备，具有很大的应用潜力。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种基于膜吸附的黄瓜基因dna快速提取扩增方法。
6.本发明采用的黄瓜基因dna快速提取扩增方法原理如图1所示，取黄瓜果实表皮、表层果肉或者中心果肉10
‑
100mg，放入小管中，用镊子捏碎，直至无明显大块果实，加入100μl裂解液，充分混匀，室温孵育1分钟。放入制备好的滤膜片，室温作用1分钟；将滤膜片取出后放入盛有清洗液的小管进行清洗，室温作用1分钟；将滤膜片取出放入配制好的pcr反应液中，室温孵育1分钟，去除滤膜片，进行核酸扩增，扩增后产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：基于膜吸附的黄瓜基因dna快速提取扩增方法，包括以下步骤：（1）黄瓜果实的切碎与裂解；（2）滤膜片的制备与基因dna吸附；（3）滤膜片的清洗；（4）滤膜片吸附dna在pcr反应液中的洗脱；（5）pcr扩增与产物电泳。
8.其中，所述黄瓜果实的切碎与裂解是取黄瓜果实表皮、表层果肉或者中心果肉10
‑
100mg，放入小管中，用镊子捏碎，直至无明显大块果实，加入100μl裂解液，充分混匀，室温孵育1分钟。
9.其中，所述黄瓜果实裂解过程中使用的裂解液配制步骤如下：如配制1l裂解液，依次加入100ml 8m盐酸胍（终浓度：800mm），100ml 500mm tris[ph 8]（终浓度：50mm），0.5ml triton x100，1ml tween
‑
20，用纯净水定容到1l。
[0010]
其中，所述滤膜片的制备如下，选择符合如下特征的滤膜：纤维素含量≥98%，孔径≈10μm，厚度≈200μm，过滤速度≈150s。将滤膜片裁剪成2
‑
3mm直径的圆片。，裁剪为2
‑
3mm直径的圆片，置于干燥处。
[0011]
其中，所述滤膜片吸附基因dna的步骤如下，在捏碎的黄瓜组织中加入100μl裂解液，充分混匀，室温孵育1分钟。
[0012]
其中，所述在滤膜片的清洗过程中使用的清洗液的配制步骤如下：如配制1l清洗液，加入20ml 500mm tris[ph 8]（终浓度：10mm），10ml tween
‑
20，用纯净水定容到1l。
[0013]
其中，所述滤膜片的清洗步骤如下：将吸附有基因dna的滤膜片放入盛有500μl清洗液的小管中，室温孵育1分钟。
[0014]
其中，所述滤膜片吸附dna在pcr反应液中的洗脱中的pcr反应液包括如下成分：taq酶、dntps、mgcl2等pcr扩增必需成分与目的基因特异性引物。
[0015]
其中，所述滤膜片吸附dna在pcr反应液中的洗脱的步骤如下：清洗后的滤膜片放入pcr混合液中，室温孵育1分钟，黄瓜基因dna直接洗脱在pcr混合液中。
[0016]
其中，所述pcr扩增与产物电泳步骤如下：按照扩增目的基因片断的大小和退火温度设定pcr程序，pcr扩增后，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察有无扩增产物，在pcr扩增过程中要设立阳性与阴性对照。
[0017]
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：目前黄瓜等蔬菜常用的基因dna提取方法是ctab法和sds法，一般以新鲜叶片为原材料，需要研磨、离心等多个步骤，费时费力。商品化试剂盒多采用二氧化硅吸附离心法或磁珠吸附法。二氧化硅吸附离心法需要通过一系列清洗和离心等步骤去除杂质，磁珠吸附法也需要多个步骤和外加磁场来提取核酸，这两种方法耗时较长，而且成本较高，还需要离心机等实验室设备。本发明方法利用滤膜吸附dna的原理，将黄瓜果实裂解后，由滤膜吸附游离的基因dna，漂洗掉内源性核酸酶等可能影响pcr的杂质，将核酸洗脱到pcr反应液中，直接对黄瓜基因进行扩增。本发明的方法操作简单，快速，成本低，具有较好特异性和灵敏度，是一个可应用于黄瓜基因dna快速提取扩增的方法。
[0018]
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的基于膜吸附的黄瓜基因dna快速提取扩增方法作进一步说明。
附图说明
[0019]
图1为本发明的基于膜吸附的黄瓜基因dna快速提取扩增方法的原理图；图2为使用5种不同裂解液时黄瓜基因dna的提取与act1基因的扩增结果；图3为在不同裂解时长时黄瓜基因dna的提取与act1基因的扩增结果；图4为在滤膜片不同吸附时长时黄瓜基因dna的提取与act1基因的扩增结果；图5为在滤膜片不同洗脱时长时黄瓜基因dna的提取与act1基因的扩增结果；
图6为黄瓜果实3个部位50mg与100mg样品中基因dna提取与act1基因的扩增结果；图7为黄瓜表皮基因dna提取与act1基因扩增灵敏度；图8为黄瓜表层果肉基因dna提取与act1基因扩增灵敏度；图9为黄瓜中心果肉基因dna提取与act1基因扩增灵敏度。
具体实施方式
[0020]
本实施例所用材料与试剂具体如下：材料：滤膜片：纤维素含量≥98%，孔径≈10μm，厚度≈200μm，过滤速度≈150s。
[0021]
试剂：盐酸胍（guanidine hydrochloride），三羟甲基氨基甲烷（tris），triton x100，tween
‑
20，黄瓜基因act1特异性引物（碱基序列见表1），pcr反应混合液（含taq酶、dntps、mgcl2等），纯净水。
[0022]
表1.相关dna序列名称序列act1上游引物5
’‑
gtggtggtgaatgagtagcc
‑3’
act1下游引物5
’‑
ttggattctggtgatggtgtc
‑3’
缓冲液：裂解缓冲液：800mm 盐酸胍，50mm tris[ph 8]，0.5% triton x100，1% tween
‑
20清洗缓冲液：10mm tris[ph8.0]，0.1%tween
‑
20基于膜吸附的黄瓜基因dna快速提取扩增方法，包括以下步骤：（1）黄瓜果实的切碎与裂解配制黄瓜果实裂解液1l，依次加入100ml 8m盐酸胍（终浓度：800mm），100ml 500mm tris[ph 8]（终浓度：50mm），0.5ml triton x100，1ml tween
‑
20，用纯净水定容到1l。取黄瓜果实表皮、表层果肉或者中心果肉10
‑
100mg，放入小管中，用镊子捏碎，直至无明显大块果实，加入100μl裂解液，充分混匀，室温孵育1分钟。
[0023]
（2）滤膜片的制备与基因dna吸附；选择滤膜，用打孔器将纤维素膜制成3mm直径圆形膜片，加入黄瓜组织裂解液中，确保膜片完全浸入液体中，室温孵育1min（3）滤膜片的清洗；用镊子将膜片取出置于500μl清洗缓冲液中（10mm tris[ph8.0]，0.1%tween
‑
20），室温孵育1min。
[0024]
（4）滤膜片吸附dna在pcr反应液中的洗脱；按照pcr试剂盒说明书配制pcr反应液200μl，其中2*pcr mix：100μl，上游引物0.5μl（100μm），下游引物0.5μl（100μm），水：99μl。将pcr反应液分装，每管25μl。将上述在清洗缓冲液中的膜片用镊子转移到pcr混合液中，室温孵育1min，用镊子去除膜片，进行pcr反应。
[0025]
（5）pcr扩增与产物电泳。
[0026]
在阳性对照管中加入0.5μl 商品化试剂盒提取的黄瓜基因组作为样品，在阴性对
照管中加入0.5μl清洗液作为样品。pcr反应条件为95℃ 1min；95℃ 15s，60℃ 15s，40个循环。反应完成后pcr产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像仪观察结果。
[0027]
本发明快检方法中关键参数的确定：（1）裂解液的配方配制五种裂解液：裂解液1：800mm 盐酸胍，50mm tris[ph 8]，0.5% triton x100，1% tween
‑
20；裂解液2：50mm tris[ph 8.0]，150mm nacl，2%pvp，1% tween
‑
20；裂解液3：2%（m/v）ctab（十六烷基三乙基溴化铵），100mm tris cl[ph8.0]，20mm edta[ph8.0]，1.4mm nacl；裂解液4：10% (m/v)ctab，0.7m nacl；裂解液5：1% (m/v) ctab，50mm tris cl[ph8.0]，10mm edta[ph8.0]。
[0028]
取黄瓜果实表层果肉5份，每份100mg，放入小管中，用镊子捏碎，在各管中分别加入裂解液1，裂解液2，裂解液3，裂解液4，裂解液5，各100μl，按照前述步骤进行核酸提取和act1基因扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳（见图2），泳道1为dna marker，泳道2
‑
6分别为裂解液1，裂解液2，裂解液3，裂解液4，裂解液5，泳道7为阳性对照，泳道8为阴性对照。
[0029]
只有裂解液1实现了有效扩增。
[0030]
（2）黄瓜裂解时间取黄瓜果实表层果肉4份，每份100mg，放入小管中，用镊子捏碎，在各管中分别加入裂解液100μl，按照前述步骤进行核酸提取和act1基因扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳（见图3），泳道1为dna marker，泳道2
‑
5分别为裂解1min，2min，4min，8min，泳道6为阳性对照，泳道7为阴性对照。
[0031]
裂解时间从1min到8min没有明显差异。
[0032]
（3）滤膜片吸附时间取黄瓜果实表层果肉4份，每份100mg，放入小管中，用镊子捏碎，在各管中分别加入裂解液100μl，室温作用1min，加入滤膜片，分别作用1min，2min，4min，8min，然后按照前述步骤进行核酸提取和act1基因扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳（见图4），泳道1为dna marker，泳道2
‑
5分别为作用1min，2min，4min，8min，裂解泳道6为阳性对照，泳道7为阴性对照。
[0033]
滤膜片吸附时间从1min到8min没有明显差异。
[0034]
（4）滤膜片洗脱时间取黄瓜果实表层果肉3份，每份100mg，放入小管中，用镊子捏碎，在各管中分别加入裂解液100μl，室温作用1min，加入滤膜片，室温作用1min，取出滤膜片放入清洗液进行清洗，然后放置到pcr混合液中进行洗脱，洗脱时间分别为1min，2min，4min，然后按照前述步骤进行act1基因扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳（见图5），泳道1为dna marker，泳道2
‑
4分别为洗脱时间1min，2min，4min扩增结果，泳道5为阳性对照，泳道6为阴性对照。
[0035]
滤膜片洗脱时间从1min到4min没有明显差异。
[0036]
（5）黄瓜不同部位的提取结果取黄瓜果实表皮、表层果肉与中心果肉各50mg与100mg，放入小管中，用镊子捏碎，在各管中分别加入裂解液100μl，按照前述步骤进行核酸提取和act1基因扩增，扩增产物琼
脂糖凝胶电泳（见图6），泳道1为dna marker，泳道2为50mg表皮，泳道3为100mg表皮，泳道4为50mg表层果肉，泳道5为100mg表层果肉，泳道6为50mg中心果肉，泳道7为100mg中心果肉，泳道8为阴性对照。
[0037]
黄瓜果实3个部位扩增效果无明显差别，50mg样品与100mg样品无明显差别。
[0038]
（6）黄瓜表皮基因提取灵敏度 分别取50mg、25mg、13mg与6mg黄瓜果实表皮放入小管中，用镊子捏碎，在各管中分别加入裂解液100μl，按照前述步骤进行核酸提取和act1基因扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳（见图7），泳道1为dna marker，泳道2为50mg表皮，泳道3为25mg表皮，泳道4为13mg表皮，泳道5为6mg表皮，泳道6为阴性对照，泳道7为阳性对照。
[0039]
黄瓜表皮最少在13mg实现了扩增。（7）黄瓜表层果肉基因提取灵敏度 分别取50mg、25mg、13mg与6mg黄瓜果实表层果肉放入小管中，用镊子捏碎，在各管中分别加入裂解液100μl，按照前述步骤进行核酸提取和act1基因扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳（见图8），泳道1为dna marker，泳道2为50mg表层果肉，泳道3为25mg表层果肉，泳道4为13mg表层果肉，泳道5为6mg表层果肉，泳道6为阴性对照，泳道7为阳性对照。
[0040]
黄瓜表层果肉最少在13mg实现了扩增。
[0041]
（8）黄瓜中心果肉基因提取灵敏度 分别取50mg、25mg、13mg与6mg黄瓜果实中心果肉放入小管中，用镊子捏碎，在各管中分别加入裂解液100μl，按照前述步骤进行核酸提取和act1基因扩增，扩增产物琼脂糖凝胶电泳（见图9），泳道1为dna marker，泳道2为50mg中心果肉，泳道3为25mg中心果肉，泳道4为13mg中心果肉，泳道5为6mg中心果肉，泳道6为阴性对照，泳道7为阳性对照。
[0042]
黄瓜中心果肉最少在25mg实现了扩增。
[0043]
（9）阳性阴性对照结果实验过程中，使用商品化试剂盒提取的黄瓜基因组作为阳性样品，加入到pcr混合液中，以此样品作为模板可以实现act1基因的高效扩增，在琼脂糖凝胶电泳中呈现150bp的条带，在黄瓜基因组提取的实验中都以此作为阳性对照。实验过程中，将清洗液作为样品，加入到pcr混合液中，以此样品作为模板无法实现act1基因的扩增，在琼脂糖凝胶电泳中无可见条带，在黄瓜基因组提取实验中都以此作为阴性对照。
[0044]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。