一种基于CRISPR/Cas9技术获取Period基因突变位点的方法及用途与流程

一种基于crispr/cas9技术获取period基因突变位点的方法及用途
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于crispr/cas9技术获取period基因突变位点的方法及用途。


背景技术：

2.period为作为人们发现并鉴定的第一个昆虫生物钟基因，研究发现它调节着昆虫的而各种生理行为，如per基因的表达紊乱会扰乱蟋蟀的昼夜节律
140.，影响苹果小卷蛾生殖系统精子的节律释放
141.，会打乱家蚕的羽化和孵化行为
142.以及影响着哺乳动物身体的饮食健康
143.等。此外per还与其他生物钟基因，联合执行功能，它们之间在功能可能还存在补偿关系。因而就需要全方位的研究生物钟基因在体能执行的功能，这样才能更好地为服务于人类和自然作出贡献。根据上述研究结果表明斜纹夜蛾两性交流活动存在明显的昼夜节律性特征，而部分生物钟基因的节律表达也反映出较为相似的特征，其中以生物钟基因period的节律性最为相似，为进一步分析生物钟基因对斜纹夜蛾两性交流活动可能存在的调控机理。
3.斜纹夜蛾在长期危害农作物的过程中常表现出明显的昼夜节律，但目前关于这些节律活动的分子机制尚不明确。因此，深入了解斜纹夜蛾生物钟基因per在斜纹夜蛾两性交流活动中作用，就必须首先通过基因编辑技术获取可以诱导per基因突变的靶标点。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于crispr/cas9技术获取period基因突变位点的方法及用途，本发明成功发现了2个可用于敲除period基因的靶标位点，对于period在斜纹夜蛾体内的功能分析奠定了基础。
5.本发明提供了一种基于crispr/cas9技术获取period基因突变位点的方法，具体包括如下步骤：
6.s1，sgrna模板的合成和体外转录：
7.第一轮pcr：以crispr
‑
per1
‑
f、crispr
‑
per2
‑
f和crispr
‑
r为引物，进行扩增，获得单一条带的产物，备用；
8.引物crispr
‑
per1
‑
f，其基因序列如seq id no.1所示；
9.引物crispr
‑
per2
‑
f，基因序列如seq id no.2所示；
10.引物crispr
‑
r，基因序列如seq id no.3所示；
11.第二轮pcr：以第一轮pcr得到的产物为模板，以引物sgrna
‑
f和sgrna
‑
r为引物进行扩增，纯化后进行体外转录sgrna；
12.引物sgrna
‑
r，基因序列如seq id no.4所示；
13.引物sgrna
‑
f，基因序列如seq id no.5所示；
14.s2，显微注射和突变检测：
15.收集斜纹夜蛾卵，将s1中得到的sgrna与cas9蛋白混合后，记为sgrna/cas9，显微注射到斜纹夜蛾卵中，24小时后，提取总dna，然后以提取的dna为模板，利用引物per
‑
jc
‑
f和per
‑
jc
‑
r进行pcr扩增，检测突变位点；
16.引物per
‑
jc
‑
f的核苷酸序列如seq id no.6所示；
17.引物per
‑
jc
‑
r的核苷酸序列如seq id no.7所示。
18.进一步地，s1中，第一轮pcr体系为2 x phanta max 25μl，引物crispr
‑
per1
‑
f或crispr
‑
per2
‑
f以及crispr
‑
r分别1μl，用双蒸水补足50μl。
19.进一步地，s1中，第一轮pcr程序如下：98℃预变性15秒，60℃15秒，72℃40秒，30个循环，72℃延伸5分钟。
20.进一步地，s1中，第二轮pcr体系为：2x phanta max 25μl，第一轮pcr产物1μl，引物sgrna
‑
f和sgrna
‑
r各1μl，双蒸水22μl。
21.进一步地，s1中，第二轮pcr程序为：98℃预变性12秒，55℃15秒，68℃40秒，35个循环，68℃延伸5分钟。
22.进一步地，第二轮pcr结束后获得的产物电泳条带单一，且大小为117bp。
23.进一步地，s2中，收集的斜纹夜蛾卵的过程为：收集刚产2小时内纸上的新鲜卵块，以体积分数为5％的甲醛溶液进行卵块消毒。
24.进一步地，s2中，每粒卵注射sgrna/cas9蛋白1nl，所述sgrna/cas9蛋白中sgrna的浓度为150ng/μl，cas9蛋白的浓度为3μg/μl。
25.进一步地，s2中，pcr扩增过程利用phanta酶。
26.一种所述的period基因的敲除在调控斜纹夜蛾两性交流活动中的用途。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
28.1、本发明利用crispr/cas9技术成功发现了2个可用于敲除period基因的靶标位点，对于period在斜纹夜蛾体内的功能分析奠定了基础。
29.2、本发明避免体外基因功能研究的缺陷，能以更为直观可信的数据，为分析基因体内功能提供理论支持。
30.3、本发明为在分子水平上理解生物钟与斜纹夜蛾两性交流活动的内在机理提供技术支持。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1表示本发明实施例1中生物钟基因per基因结构图以及sgrna靶标位点的位置信息图；
33.其中，方形长框表示外显子，外显子阴影部分表示靶标位点，在靶标位点序列中，3’端3个碱基(加粗)为pam序列，5’端atg为起始密码子，3’端taa为终止子；
34.图2表示本发明实施例1中合成的sgrna琼脂糖凝胶电泳检测结果；
35.其中，m：dna分子量标准，f1：per
‑
f1
‑
sgrna；f2：per
‑
f2
‑
sgrna；
36.图3表示本发明实施例1中g0代卵的突变检测图；
37.左图：pcr产物测序峰图；右图：靶标位点序列，其中，双下划线标注的序列为pam序列。
具体实施方式
38.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
39.实施例1
40.本实施例提供了一种基于crispr/cas9技术获取斜纹夜蛾period基因突变位点的方法，具体过程如下：
41.一、实验材料
42.1、斜纹夜蛾；
43.2、主要仪器设备和实验试剂：
44.表1 主要实验仪器及生产厂家
[0045][0046]
表2主要试剂/试剂盒及生产厂家
[0047][0048]
二、实验方法
[0049]
1、sgrna模板的合成和体外转录
[0050]
基于基因组与转录组数据，依据crispr/cas9要求手动设计sgrna所需引物：引物crispr
‑
per1
‑
f(基因序列如seq id no.1所示)，引物crispr
‑
per2
‑
f(基因序列如seq id no.2所示)，引物crispr
‑
r(基因序列如seq id no.3所示)，引物sgrna
‑
r(基因序列如seq id no.4所示)，引物sgrna
‑
f(基因序列如seq id no.5所示)。
[0051]
seq id no.1：
[0052]
taatacgactcactatagggaccattgtttcaatttggttttagagctagaaatagcaagttaaaataa
[0053]
seq id no.2：
[0054]
taatacgactcactataggagcatcaaatgtaggggcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataa
[0055]
seq id no.3：
[0056]
aaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaa
[0057]
seq id no.4：agcaccgactcggtgcca
[0058]
seq id no.5：taatacgactcactata
[0059]
此后合成sgrna模板操作如下：
[0060]
第一轮pcr：以体系：2 x phanta max 25μl，正引物crispr
‑
per1
‑
f或crispr
‑
per2
‑
f以及反引物crispr
‑
r分别1μl，用双蒸水补足50μl，进行pcr；程序如下：98℃预变性15秒，60℃15秒，72℃40秒，30个循环，72℃延伸5分钟，结束后进行2.0％的琼脂糖电泳检测；条带单一留着备用。
[0061]
第二轮pcr：体系有：2 x phanta max 25μl，一轮pcr产物1μl，通用引物sgrna
‑
f和sgrna
‑
r各1μl，双蒸水22μl；程序有：98℃预变性12秒，55℃15秒，68℃40秒，35个循环，68℃延伸5分钟。该反应结束后，进行1.7％琼脂糖电泳检测。若条带单一，且大小约为117bp。使用qia quick pcr purification kit试剂盒，参照说明书进行剩余pcr产物的纯化，通过荧光分光光度计测量产物质量和浓度。以纯化好的pcr产物为模板，使用转录试剂盒maxi script t7 in vivo transcription kit进行体外转录sgrna，具体步骤参照说明书。
[0062]
2、显微注射和突变检测
[0063]
针对于羽化的成虫进行混合放置于笼内，饲喂10％的蜂蜜水，及时观测昆虫交配状态。收集刚产2小时内纸上的新鲜卵块，以5％的甲醛溶液进行卵块消毒，并分粒摆放于乙醇消毒后的载玻片上，每片约120粒。使用显微注射仪进行注射，将sgrna(浓度为150ng/μl)和cas9蛋白(浓度为3μg/μl)以体积比100:1进行混合，然后记为sgrna/cas9蛋白，所述cas9蛋白购买自美国thermo。每粒卵注射sgrna/cas9蛋白约1nl。注射24小时后，收集20粒卵，根据dnaiso reagent试剂提取总dna，提取步骤如下：
[0064]
1)将收集的卵放在1.5ml的ep管中，加入500μl的dnaiso reagent。
[0065]
2)使用研磨棒对将ep管中的卵进行充分研磨后，12000g离心2min。
[0066]
3)转移上清液于新的1.5ml的无菌ep管中，再次10000g离心10min。
[0067]
4)缓慢转移上清液到新的1.5ml的ep管中，加入200μl的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，至沉淀析出，静置5min后10000g离心3min。
[0068]
5)将上清液倒掉，加1ml的75％的无水乙醇，上下颠倒，充分洗涤杂质，12000g离心5min，去上清，重复洗涤一次。将上清液全部吸出，超净工作台内吹干沉淀3min。
[0069]
6)加50μl ddh 2
o溶解沉淀，55℃温浴2h后用紫外分光光度计测定dna浓度及纯度。
[0070]
以此为dna模板结合用于检测突变的引物per
‑
jc
‑
f(基因序列如seq id no.6所示)和per
‑
jc
‑
r(基因序列如seq id no.7所示)，利用phanta酶进行pcr，并将产物送去测序。phanta酶保真性较高，能更好的应用于pcr扩增保证碱基准确。
[0071]
seq id no.6：taggtctcggtacctacacccca
[0072]
seq id no.7：ggatttttcttgcttcgtgctctt
[0073]
三、实验结果
[0074]
1、靶标位点的选择和sgrna的合成
[0075]
基于dna和mrna序列，将编码区和非编码区分开，然后根据sgrna位点结构要求，在第4个外显子(共有30外显子)发现有符合要求的位点序列，且该区域无限制性核酸内切酶位点(如图1所示)。
[0076]
图1中方形长框表示外显子，外显子阴影部分表示靶标位点，在靶标位点序列中，3’端3个碱基(加粗)为pam序列，5’端atg为起始密码子，3’端taa为终止子。
[0077]
根据设计好的靶标位点序列合成引物，通过pcr扩增合成得到sgrna模板，经过模板的纯化和体外转录，合成了斜纹夜蛾生物钟基因per的sgrna，将合成好的sgrna进行琼脂糖凝胶电泳检测(结果如图2所示)。
[0078]
图2中各标注解释为：m：dna分子量标准，f1：per
‑
f1
‑
sgrna；f2：per
‑
f2
‑
sgrna。
[0079]
2、显微注射后g0代突变检测
[0080]
将合成的sgrna和购买的cas9蛋白，按照终浓度分别为150ng/μl和3μg g/μl，以体积比100:1进行混合，并利用显微注射仪注射到斜纹夜蛾的新鲜卵中，每粒卵的注射剂量大约为1nl。在注射24h后，随机挑取20粒卵进行基因组dna的抽提，利用per
‑
jc
‑
f/per
‑
jc
‑
r引物进行pcr扩增，后经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，条带大小约751bp，将剩余的pcr产物送公司测序。pcr产物测序峰图结果表明，在两个靶标位点附近均出现套峰，此外发现序列中靶标位点也出现序列的缺失(如图3所示)，这证明有突变的发生。
[0081]
本发明成功发现了2个可用于敲除period基因的靶标位点，可以用于研究分析period在斜纹夜蛾体内功能分析。
[0082]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0083]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。