郁李仁分离蛋白凝胶及其制备方法与应用与流程

1.本技术属于食品技术，特别是涉及一种郁李仁分离蛋白凝胶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.较动物蛋白而言，植物蛋白更容易消化且有助于降低高胆固醇患者的血脂，减轻肾脏负担，因此植物蛋白的发展一直是研究者关注的重点。同时，基于一些蛋白质在功能上不符合某些食品加工和工艺的现状，蛋白质的改性成为近些年的研究重点。目前，蛋白质改性方法包括脉冲电场
‑
超声波技术、亚临界水技术、微生物发酵等多种改性方法，其中微生物发酵技术是一种改善食品成分的绿色技术，受到很多食品工业的关注。目前，微生物发酵技术已经用于燕麦蛋白、鸡蛋白蛋白改性中。
3.蛋白质的凝胶特性是蛋白质的重要功能特性之一。采用蛋白质所形成的凝胶被广泛用于制备植物基酸奶、人造肉以及活性成分包埋。植物蛋白质凝胶的制备方法主要包括酸诱导形成凝胶(葡糖酸
‑
δ
‑
内酯)和盐诱导形成凝胶(硫酸钙)。而采用微生物发酵诱导植物蛋白质形成凝胶是一种新技术，由于其制备工艺温和、简单而受到广泛关注。
4.郁李仁富含蛋白质(280g/kg)和苦杏仁苷(20g/kg)。通常郁李仁被用于苦杏仁苷的提取，而对于其蛋白质的应用研究则较为少见。本技术试图采用乳酸菌复合发酵技术来诱导郁李仁分离蛋白凝胶的形成，为植物蛋白凝胶的制备提供新技术。


技术实现要素：

5.发明目的：针对上述现有技术，本技术提供了一种郁李仁分离蛋白凝胶及其制备方法与应用。
6.技术方案：本发明所述的一种郁李仁分离蛋白凝胶，包含以下重量百分含量的各个组分：郁李仁分离蛋白5
‑
10％，糖5
‑
10％，发酵剂0.01
‑
0.5％，余量为无菌水。
7.优选的，所述的郁李仁分离蛋白凝胶包含以下重量百分含量的各个组分：郁李仁分离蛋白7％，糖8％，发酵剂0.1％，余量为无菌水。
8.其中，所述糖选自：蔗糖、葡萄糖、果葡糖浆、蜂蜜、乳糖或者其他代糖。
9.所述发酵剂包括等比例的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌。
10.其中，所述郁李仁分离蛋白通过以下方法制备：
11.(1)取郁李仁粉碎，过筛，用索氏提取器脱脂，1
‑
8次虹吸之后取出进行干燥；
12.(2)取步骤(1)得到的样品，按照1：5
‑
15的固液比加入无菌水，ph调至7.5
‑
9.0，搅拌，离心取上清液；ph值调至4.0
‑
5.0，再离心，将所得沉淀溶于少量蒸馏水，并调ph至6.5
‑
7.5，
‑
20℃预冷冻，随后冷冻干燥，得到郁李仁分离蛋白粉。
13.步骤(1)中，粉碎后过40
‑
100目筛；步骤(2)中，100
‑
500转/分搅拌60
‑
120分钟；步骤(2)中，在3000
‑
6000rmp/min下离心10
‑
30min。
14.本发明所述郁李仁分离蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)取配方量的郁李仁分离蛋白在无菌水中配置成5
‑
10％(w/v)的溶液，加入配方量的糖，调节ph至6.0
‑
7.0，于室温条件下搅拌0.5
‑
2h，冷藏12
‑
24h；
16.(2)将溶液置于75
‑
95℃下加热杀菌，取出冷却至室温；
17.(3)按照0.01
‑
0.5％接种发酵剂，置于38
‑
45℃下发酵0
‑
24h，发酵后冷藏10
‑
48h，即为郁李仁分离蛋白凝胶。
18.所述郁李仁蛋白凝胶在制备抗氧化和降血压功能性食品中的应用也在本发明的保护范围内。
19.本发明以郁李仁分离蛋白溶液为培养基，通过添加碳源，利用复合发酵，使得郁李仁分离蛋白分子发生去折叠化或者发生水解，继而郁李仁分离蛋白分子之间通过非共价键或共价键的形式形成凝胶。本发明研究了乳酸菌复合发酵郁李仁蛋白过程的作用机制，实验显示：发酵9h后，蛋白质凝胶的平均粒径、持水性、凝胶强度、表观粘度及储能模量均达到最大值。郁李仁蛋白酸奶体外消化产物具有抗氧化和降血压活性。本研究可为功能性植物蛋白发酵产品的研制提供理论依据和技术支撑。
20.本发明一方面，采用乳酸菌复合发酵的方法发酵郁李仁蛋白可以掩蔽郁李仁蛋白自身的苦味，另一方面，乳酸菌本身也能起到降低胆固醇、改善人体肠胃以及机体免疫的作用。乳酸菌复合发酵改善蛋白质的功能性质主要是利用复合后的乳酸菌分泌的蛋白酶，包括蛋白酶和肽酶,将分子量较大的蛋白质部分降解为分子量较小的游离氨基，从而促进人体消化系统。
21.有益效果：相比较于现有技术，本技术的优势在于：利用乳酸菌复合发酵来诱导蛋白质凝胶的形成，制备过程温和，且不需要引入凝固剂(葡糖酸
‑
δ
‑
内酯或硫酸钙)；所形成的凝胶本身富含益生菌；所形成的凝胶经过模拟胃肠道消化后，可以形成具有抗氧化和降血压活性的多肽。
附图说明
22.图1是乳酸菌复合发酵郁李仁蛋白状态图；
23.图2是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白粒径分布的影响；
24.图3是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白的粘度的影响；
25.图4是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白凝胶的储存模量g’的影响；
26.图5是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白的蠕变
‑
恢复性能的影响；
27.图6是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白持水性的影响；
28.图7是乳酸菌复合发酵郁李仁蛋白的荧光显微图像；
29.图8是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白酸奶消化产物清除羟基自由基能力的影响；
30.图9是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白酸奶消化产物清除超氧阴离子能力的影响；
31.图10是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白酸奶消化产物铁还原能力的影响；
32.图11是乳酸菌复合发酵对郁李仁蛋白酸奶消化产物降血压活性的影响。
具体实施方式
33.下面结合具体实施例对本技术作出详细说明。
34.本技术实验数据需计算平均值及标准偏差，并采用spss软件进行anova分析(p＜0.05)，采用origin8进行作图。
35.材料与试剂
[0036][0037]
实施例1郁李仁分离蛋白的制备
[0038]
将郁李仁用粉碎机粉碎，过60目筛后得到郁李仁粉末并用纱布包好，用索氏提取器进行脱脂，2至4次虹吸之后取出进行干燥。得到的样品按照1：10的固液比加入蒸馏水并将ph调至8.0，用搅拌机搅拌30
‑
40min并保持ph值不变，在4000rmp/min下离心20min，取上清液，随后将ph值调至4.5，再在4000rmp/min下离心20min，将所得沉淀溶于少量蒸馏水并调ph至7.0
‑
7.2，倒入蒸发皿中(1
‑
2mm)并于
‑
20℃进行预冷冻，随后在冷冻干燥机内进行冷冻干燥，三天后取出郁李仁蛋白粉。
[0039]
实施例2郁李仁分离蛋白的制备
[0040]
将郁李仁用粉碎机粉碎，过80目筛后得到郁李仁粉末并用纱布包好，用索氏提取器进行脱脂，2至4次虹吸之后取出进行干燥。得到的样品按照1：15的固液比加入蒸馏水并将ph调至9.0，用搅拌机搅拌50min并保持ph值不变，在5000rmp/min下离心30min，取上清液，随后将ph值调至4.5，再在5000rmp/min下离心25min，将所得沉淀溶于少量蒸馏水并调ph至7.0，倒入蒸发皿中(1
‑
2mm)并于
‑
20℃进行预冷冻，随后在冷冻干燥机内进行冷冻干燥，三天后取出郁李仁分离蛋白粉。
[0041]
实施例3乳酸菌复合发酵制备郁李仁分离蛋白凝胶
[0042]
将实施例1制备的郁李仁分离蛋白在无菌水中均配置成7％(w/v)的溶液，于溶液中混入8％(w/v)的蔗糖，调节ph至6.5，于室温条件下搅拌1h，于4℃放置12
‑
24h。然后，将溶液置于90℃下加热15min杀菌，取出后冷却至室温。将消毒瓶煮沸灭菌，于超净工作台中称量混合发酵剂分散在溶液中，使溶液中复合的菌浓度为0.1％，取出将其置于42℃下分别发酵0h、3h、6h、9h、12h，发酵后冷藏(4℃)10
‑
48h，即为郁李仁分离蛋白凝胶。
[0043]
制备过程中凝胶状态如图1所示，a:未发酵郁李仁分离蛋白溶液；b:乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白3h；c:乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白6h；d:乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白9h；e:乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白12h。由图1可知，采用乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白的方法可以使郁李仁分离蛋白完全形成凝胶状态，且乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白会在6h左右开始形成凝胶，而在9h时则完全形成凝胶，且郁李仁分离蛋白发酵终点的ph在4.8左右。
[0044]
乳酸菌复合发酵后郁李仁分离蛋白凝胶功能性质的测定
[0045]
1、粒径的测定
[0046]
分别将乳酸菌复合发酵0h、3h、6h、9h、12h后的郁李仁分离蛋白凝胶搅拌均匀后，用粒度仪进行测量。
[0047]
结果如图2所示，发酵3h前郁李仁分离蛋白质的粒径较未发酵时无显著变化，发酵6h后的郁李仁分离蛋白粒径随时间的推移有所增长，且在9h时达到顶峰，这种现象的出现可能归因于郁李仁分离蛋白在发酵过程中形成了共价键(如：二硫键)导致聚集体的形成，也有可能是由于非共价相互作用导致，如：疏水、氢键及静电作用。
[0048]
2、流变性的测定
[0049]
(1)粘度的测定
[0050]
将样品于室温下(22
‑
25℃)静置1h，用刮刀将其轻轻剥离(尽量保持样品完整性)，然后将发酵后的样品在稳态剪切条件下，利用ta流变仪(使用60mm的帕尔贴)进行测量，将间距调节至100μm，剪切速率为0.1
‑
1000s
‑1。每次测量开始时，需将样品在测量间隙中再次静置60s，然后测其粘度，所有测试须在35℃下测试。粘度是一种用于确定牛顿流体和非牛顿流体的物理性质，它缺乏光滑度，因此该物质难以流动，其中牛顿流体在剪切应力和剪切速率之间的比例是不变的，非牛顿流体则反之。
[0051]
结果如图3所示，样品随剪切速率的增加呈现下降的趋势，这表示郁李仁分离蛋白样品均具有非牛顿流体的剪切稀化行为。此外，与对照郁李仁分离蛋白相比，发酵后的郁李仁分离蛋白的粘度随时间的推移逐渐增强，且在9h时达到最大值，导致这一现象的原因可能是郁李仁分离蛋白形成了凝胶。
[0052]
(2)频率扫描
[0053]
利用ta流变仪将间距调至100μm，并在35℃温度下，在线性粘弹性条件下，通过小振幅振荡流变学测试，测试条件如下：角频率为0.1至100rad/s，恒定应变为0.1％，记录发酵后的郁李仁蛋白的储能模量(g')和损耗模量(g和)。频率扫描旨在研究郁李仁分离蛋白凝胶的粘弹性，通常以储能模量和损失模量表示。
[0054]
结果由图4可知，发酵后的郁李仁分离蛋白储能模量(g’)较未发酵郁李仁分离蛋白都有所上升，说明发酵处理后的郁李仁分离蛋白粘弹性增加，其中发酵9h效果最佳。
[0055]
(3)蠕变恢复
[0056]
使用ta流变仪在25℃下5pa的剪切应力下，记录测试的两个阶段：在恒定应力下的应变变化5min；在恢复阶段时消除压力后，记录另一个5min使其恢复。此外，须在振荡模式下以1hz的频率进行蠕变恢复测试。
[0057]
结果如图5所示，发酵6h后的郁李仁分离蛋白蠕变恢复效果较差，发酵9h时的蠕变恢复效果明显增强，而过度发酵的郁李仁分离蛋白(即发酵12h后的郁李仁分离蛋白)则蠕变恢复能力又会再次减弱。这说明郁李仁分离蛋白凝胶在9h处硬度最大，结合图1分析原因，有可能是由于复合的乳酸菌在发酵过程中水解了郁李仁分离蛋白，导致郁李仁分离蛋白疏水基团打开，然后又重新聚合导致凝胶的形成，接着复合的乳酸菌产生蛋白酶导致郁李仁分离蛋白被部分酶解。
[0058]
(4)持水性(whc)的测定
[0059]
称量空离心管的质量，记为m0，在离心管中各取1ml发酵后的郁李仁分离蛋白凝胶并称重，离心管与凝胶的总质量记为m1，在4℃下以10,000仁g速度离心10min，丢弃上清液，再次称重，离心管和沉淀的总质量记为m2，whc的计算公式如下：
[0060][0061]
持水性是测定蛋白质凝胶中蛋白质与水之间相互作用的一种重要功能特性，图6表示复合后的乳酸菌在不同的发酵时长对郁李仁分离蛋白凝胶持水性的影响。结果显示：郁李仁分离蛋白的持水性在开始的9h会随着发酵时长的增加而增加，且在9h时持水性最好，随后持水性则会降低，这就意味着乳酸菌复合发酵处理后的郁李仁分离蛋白持水性会得到明显改善，这可能是因为乳酸菌复合发酵改变了蛋白质间的相互作用或者微观结构的差异，另外一个原因可能是蛋白质在热处理过程中，展开了部分功能基团(如疏水基团)，从而使得他们之间相互作用使得蛋白质聚集形成网络，这与发酵后郁李仁分离蛋白粒径增大的结论相对应。
[0062]
(5)微观结构的测定
[0063]
荧光染料的配制：将异硫氰酸荧光素溶于二甲基亚砜中，使最终浓度为0.1mg/ml(避光储存)。
[0064]
测定方法：取0.5g的蛋白凝胶于离心管中，加入5μg配置好的荧光染料，取部分样品于载玻片上(注意保持样品的完整性)，于电子显微镜下进行观察拍照。
[0065]
利用荧光显微镜观察染色的发酵后的蛋白质凝胶，如图7显示，a：未发酵郁李仁分离蛋白溶液；b：乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白3h；c：乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白6h；d：乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白9h；e：乳酸菌复合发酵郁李仁分离蛋白12h。发酵6h后的郁李仁分离蛋白凝胶较未发酵、3h乳酸菌复合发酵后的蛋白凝胶网孔逐渐缩小，这意味着凝胶效果越来越好。这可能是由于不溶性蛋白质的含量增加，从而导致致密的微观结构的形成。
[0066]
实施例4郁李仁分离蛋白酸奶体外消化产物的制备
[0067]
郁李仁蛋白酸奶(9h发酵)进行体外模拟胃肠道消化的方法包括：向郁李仁蛋白酸奶中加入胃蛋白酶(0.2g/kg)，在温度为37℃，ph为2，转速为100rpm/min的条件下孵育2h，孵育过程中采用0.1mol/l的氢氧化钠或盐酸溶液维持ph恒定，然后调节ph值至7.0并保持37℃，加入胰蛋白酶(0.2g/kg)，在温度为37℃，转速为100rpm/min的条件下孵育4h，灭酶，离心去除沉淀。上清液利用超滤进行分离。先将上清液分别经过截留分子量为10kda的超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为30℃，操作压力为0.2mpa，得超滤膜截留液和透过液。超滤膜截留液是指超滤膜纯化系统截留的液体；超滤膜透过液是指能通过超滤膜纯化系统的液体。截留分子量为：截留分子量为10kda的超滤膜纯化系统是指其可以截留分子量大于10kda的分子，使分子量不大于10kda的分子通过。再将透过液经过截留分子量为5kda的超滤膜纯化系统进行过滤，操作温度为30℃，压力为0.4mpa，得到超滤膜截留液和透过液，分别将不同分子量段的郁李仁蛋白酸奶消化物真空冷冻干燥。
[0068]
郁李仁分离蛋白酸奶消化产物抗氧化活性的研究
[0069]
郁李仁分离蛋白酸奶消化产物的清除羟基自由基能力的评价参照羟自由基测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，清除超氧阴离子的评价参照抗超氧阴离子自由基试剂盒(南京建成生物工程研究所)，三价铁还原能力的测定参考总抗氧化能力测定参考总抗氧化能力试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
[0070]
结果如图8和9所示，gsh:谷胱甘肽；hydrolysate:郁李仁分离蛋白酸奶消化产物；
mw:分子量。不同分子量段的郁李仁分离蛋白酸奶消化产物对羟自由基和超氧阴离子均表现出不同程度的清除能力，与谷胱甘肽和消化产物比较，分子量段小于5kda清除能力最强。如图10所示，gsh:谷胱甘肽；hydrolysate:郁李仁蛋白酸奶消化产物；mw:分子量。不同分子量段的郁李仁分离蛋白酸奶消化产物均表现出铁还原能力，分子量段小于5kda的还原能力最强。
[0071]
郁李仁分离蛋白凝胶消化产物降血压活性的研究
[0072]
血管紧张素转换酶(ace)抑制活性的测定：
[0073]
在2ml的离心管中混合50心管消化产物(2mg/ml)和200/ml合定：产mol/l马尿酰组氨酸亮氨酸(hhl，hhl溶液用含有0.3mol/l氯化钠的0.1mol/l、ph8.3的硼酸缓冲液配制)。在37℃恒温水浴预热5min，然后加入50后加入热配制)。在ace启动反应，37℃恒温保持30min，加入0.2ml1mol/l的盐酸终止反应。加入1.2ml冰冷的乙酸乙酯，用力震荡混合，离心机3000r/min离心5min后，取出0.8ml酯层移入试管中，在85℃烘箱中烘干(约1h)，再加入2ml的去离子水震荡2min溶解马尿酸，溶液在228nm测定吸光值(od)；对照组除不加入消化产物外，其余操作与反应管完全相同。抑制率计算方法如下所示：
[0074][0075]
式中：od
a
：对照组的吸光值；od
b
：样品组的吸光值。
[0076]
结果如图11所示，hydrolysate:郁李仁分离蛋白凝胶消化产物；mw:分子量。不同分子量段的郁李仁分离蛋白凝胶消化产物均表现出降血压活性，分子量段小于5kda的降血压活性最强。
[0077]
实施例5乳酸菌复合发酵制备郁李仁分离蛋白凝胶
[0078]
将实施例1制备的郁李仁分离蛋白在无菌水中均配置成10％(w/v)的溶液，于溶液中混入5％(w/v)的蔗糖，调节ph至7.0，于室温条件下搅拌2h，于4℃放置24h。然后，将溶液置于95℃下加热15min杀菌，取出后冷却至室温。将消毒瓶煮沸灭菌，于超净工作台中称量混合发酵剂分散在溶液中，使溶液中复合的菌浓度为0.5％，取出将其置于42℃下发酵24h，发酵后冷藏(4℃)48h，即为郁李仁分离蛋白凝胶。
[0079]
实施例6乳酸菌复合发酵制备郁李仁分离蛋白凝胶
[0080]
将实施例1制备的郁李仁分离蛋白在无菌水中均配置成8.5％(w/v)的溶液，于溶液中混入10％(w/v)的蔗糖，调节ph至6.5，于室温条件下搅拌1h，于4℃放置18h。然后，将溶液置于85℃下加热30min杀菌，取出后冷却至室温。将消毒瓶煮沸灭菌，于超净工作台中称量混合发酵剂分散在溶液中，使溶液中复合的菌浓度为0.25％，取出将其置于42℃下分别发酵12h，发酵后冷藏(4℃)24h，即为郁李仁分离蛋白凝胶。