一种用于监测液相质谱分析过程中样品残留程度的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种用于监测液相质谱分析过程中样品残留程度的方法。


背景技术：

2.随着大数据时代的到来，大样本队列正在逐步增多。限于仪器性能、方法、数量等的局限，提高液相质谱的有效时间利用率就变得极为必要。
3.目前，大多数液相质谱方法都需要有单独的清洗色谱柱的时间，并在样品间插入标品的检测，用于评估上一个样本的残留，避免对后续样本造成检测污染，这样会减少液相色谱有效的检测时间。当优化方法达到每一次检测方法最后跟随的短清洗梯度可以基本将所有残留清洗干净时，即可以将单独设置的清洗色谱时间取消。但随之而来的问题是，随着样本数目的积累，可能会出现色谱柱效的降低或实验环境的波动等问题，但却无法有效便捷的评估连续样本残留的积累对样品分析造成的影响，也无法确定哪些样本受影响过大而造成数据已经较大偏离真实情况而无法使用。


技术实现要素：

4.发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于监测液相质谱分析过程中样品残留程度的方法。
5.技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种用于监测液相质谱分析过程中样品残留程度的方法，包括以下步骤：
7.1)设置至少两组外源肽段参考品，每组外源肽段参考品至少包含三条不同极性的肽段，组间肽段均不相同，但是每组中三条肽段的极性分布与其他组中三条肽段的极性分布相同；
8.2)将外源肽段参考品组整体交替排列，即按照参考品组1,2,3
…
n,1,2,3
…
n,1,2,3
…
n
…
排列，样品按进样顺序，即按照样品1,2,3
…
m排列，两者依此分别成对混合；
9.3)进样检测，提取处理数据，根据每组中相同极性的外源肽段参考品的残留率，计算公式为：残留百分率＝上次样品中肽段参考品的肽段强度/当次样品中对应肽段参考品的肽段强度，评价针对该极性的分离柱效及样品残留程度。
10.优选的，步骤1)中，所述三条不同极性的肽段，其极性分布为：分别可以被5
‑
30％，30
‑
60％，60
‑
95％乙腈水溶液从液相色谱柱上洗脱。
11.优选的，步骤1)中，所述组间肽段均不相同，包括序列、同位素标记、修饰等的不同，即能够达到在质谱中区分不同肽段的目的即可。
12.优选的，步骤2)中，所述样品数量大于等于参考品组数，参考品组数量大于等于两组小于样品数，所述参考品组数量至少两组，且不多于样品数量，即m大于等于n。
13.优选的，步骤2)中，所述外源肽段参考品加入前进行准确定量。
14.优选的，步骤3)中，所述提取处理数据，可以使用软件对肽段参考品的肽段进行定
性定量数据提取，可使用部分先进质谱检测软件自带的实时鉴定方法，或在获得全数据后进行定性定量数据提取。
15.优选的，步骤3)中，所述提取处理数据，使用蛋白质组分析软件spectronaut，将所有定性定量肽段数据进行导出，对导出数据进行手动或编程软件搜索并确定相应差异倍数。
16.作为优选方案，当外源肽段参考品设置两组时，具体的方法如下：
17.1)准备两组外源肽段参考品a和b，每组外源肽段参考品至少包含三条不同极性的肽段，每组中的三条肽段极性分布相同，均分别可以被5
‑
30％，30
‑
60％，60
‑
95％乙腈水溶液从液相色谱柱上洗脱，并且两组中的肽段序列均不相同；
18.2)将两组参考品间隔使用，排列顺序为ababab
…
，样品按进样顺序，即按照样品1,2,3
…
m排列，两者依此分别成对混合，进样检测，提取处理数据，则在当前含有肽段组参考品b的样品数据中，可以分析前一个样品中肽段组参考品a是否残留，及残留量，用来评估前一个样品在检测结束后，在液相色谱柱中的残留情况(计算极性相同肽段参考品的残留，可以评价针对该极性的分离柱效及样品残留程度)，同理，可以利用含有肽段组参考品a的样品数据，分析前一个样品中肽段参考品b的残留；
19.3)使用蛋白质组分析软件spectronaut，将所有定性定量肽段数据进行导出，对导出数据进行手动或编程软件搜索并确定相应差异倍数，计算公式为：当前样品残留百分率＝加入瓶后一瓶中肽段参考品的肽段强度/加入瓶中肽段参考品的肽段强度。
20.准备肽段参考品时，可以将其放置于瓶盖颜色不同的样品瓶中，以示区别，样品瓶也可以不加入其他样品，只加入上样缓冲液溶解其中肽段，单独作为柱效监测的标品，也可作为步骤2的定量参考；
21.有益效果：与现有技术相比，本发明可以在减少液相质谱非样品检测时间从而提升检测样品通量的同时，能够有效评估连续进样带来的样品残留，确认样品残留对后续分析的影响程度，并能够评估液相分离柱的柱效。
附图说明
22.图1：设置3组外源肽段参考品的本发明加样方法示意图，参考品预先置于不同样品瓶(盖颜色不一样)，再将样品加入样品瓶。
具体实施方式
23.以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
24.实施例
25.1.准备两种样品瓶，分别为蓝帽和红帽，标记为a瓶和b瓶；
26.2.准备两组多肽，分别包括：
27.极性第一组第二组亲水lgdneqqtrgndneqntk中性dglwatsysapvrgwlwatsasagvk疏水vfliffaqgsgflrlgliafavgsfflk
28.3.将第一组多肽加入a瓶，将第二组多肽加入b瓶，分别取10ul，将两种样品瓶进行离心冷冻干燥；
29.4.将一批次蛋白质组提取酶解的肽段样品6个，标记为样品1～6；
30.5.准备好6个样品瓶，3个a瓶，3个b瓶，分别取每个样品20ul，10ug肽段，按照样品1,3,5加入a瓶，样品2,4,6加入b瓶；
31.6.将样品按照样品号依次排列放置在上样板上，即ababab瓶排列；
32.7.通过液相质谱检测蛋白质组肽段数据，.raw格式文件；
33.8.本实例使用spectronaut软件对数据进行抽提，导出peptide定性定量数据表，通过编程r语言程序，快速从表中提取得到1,2两组肽段在6个样本中丰度如下表：
[0034][0035][0036]
9.使用每个样品中残留参考肽段强度比上上一个样品中加入参考肽肽段强度，可以得出每个样品残留百分比：
[0037] 123样品20.04％0.05％0.08％样品30.04％0.03％0.07％样品40.06％0.08％0.06％样品50.11％0.14％0.10％样品60.17％0.18％0.21％
[0038]
通过计算残留比例可以看出，样品5及样品6，由于柱效下降，前一个样品残留较多，均值已经超过0.1％，已经可以影响样品鉴定数据，这两个数据的使用将需要慎重，同时判定需要重新清洗或更换色谱柱，来进行接下来的数据采集。