一种功劳去火胶囊的检测方法与流程

1.本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种功劳去火胶囊的检测方法。


背景技术：

2.功劳去火胶囊，为贵州健兴药业有限公司的产品，功效为清热解毒,用于实热火毒型急性咽喉炎、急性胆囊炎、急性等。
3.功劳去火胶囊收载于ws3
‑
063(z
‑
063)
‑
2000(z)，标准中原有检测项目为：性状；显微鉴别、显色反正、栀子的薄层鉴别；功劳木和黄柏含量测定；黄芩含量测定。但在实际检测中存在以下缺陷：(1)栀子的薄层鉴别斑点模糊，重现性差，影响检验结果的判断；(2)功劳木和黄柏薄层色谱法含量测定过程中，回流至无色时，时间长达8小时，且展开斑点较小而模糊，重现性差，影响检验结果的判断；(3)黄芩薄层色谱法含量测定过程中，主斑点较模糊、且出现拖尾现象，斑点rf值偏小，影响检验结果的判断；(4)该检测方法未涉及栀子含量测定，不能有效控制功劳去火胶囊成品的质量。
4.为了解决上述问题，有效的提高产品质量，提升功劳去火胶囊的质量标准，本发明团队对功劳去火胶囊原检测方法进行深入研发、考察，建立了一种用于功劳去火胶囊的检测方法。该方法解决了栀子的薄层鉴别斑点模糊，重现性差的问题；解决了功劳木和黄柏薄层色谱法含量测定过程中，回流至无色时间长，且展开斑点较小而模糊，重现性差的问题；解决黄芩薄层色谱法含量测定过程中，主斑点较模糊、且出现拖尾现象，斑点rf值偏小的问题；增加了栀子含量测定，有效的控制产品的质量，进一步提高产品质量标准。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种功劳去火胶囊的检测方法。
6.本发明所述功劳去火胶囊的处方为：
7.功劳木604g 黄柏302g 黄芩302g 栀子302g
8.本发明所述功劳去火胶囊制法：
9.以上四味，取黄柏100g，粉碎成细粉，剩余的黄柏与功劳木加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏；黄芩，栀子加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏。上述两种稠膏分别加入黄柏细粉，混匀，干燥，粉碎，过60目筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得；
10.本发明所述胶囊的检测方法为：对胶囊中栀子药材的薄层鉴别检查，对功劳木、黄柏，黄芩，栀子药材的含量测定。
11.本发明所述胶囊中栀子药材薄层鉴别方法为：取本品内容物0.6g，加甲醇5～15ml，加热回流提取40～60分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以比例为7:2的氯仿
‑
甲醇为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，
显相同颜色的斑点。
12.优选的，
13.本发明所述胶囊中栀子药材薄层鉴别方法为：取本品内容物0.6g，加甲醇10ml，加热回流提取50分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以比例为7:2的氯仿
‑
甲醇为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
14.本发明所述胶囊中功劳木和黄柏含量测定的方法为：
15.供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，研匀，称取1g,精密称定，加甲醇90ml，称重，超声处理25～35分钟，用甲醇补足重量，置索氏提取器中，再加热回流至无色，提取液浓缩，转移至50ml量瓶中，并用甲醇适量洗涤容器，洗液加入量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，加于规格为100～200目，4g，内径1.5cm，乙醇湿法装柱的氧化铝柱上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
16.对照品溶液的制备取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.18mg的溶液，作为对照品溶液；
17.测定法照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液1μl、3μl，供试品溶液3μl，分别交叉点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶g薄层板上，以比例为7:1:2的正丁醇
‑
冰醋酸
‑
水为展开剂，展开，取出，晾干，避光放置1小时，照薄层色谱法进行扫描，波长λ
s
＝345nm，λ
r
＝370nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
18.优选的，
19.本发明对功劳木和黄柏进行含量测定的方法中所述供试品溶液的制备为：取装量差异项下的本品内容物，研匀，称取1g,精密称定,加甲醇90ml，称重，超声处理30分钟，用甲醇补足重量，置索氏提取器中，再加热回流至无色，提取液浓缩，转移至50ml量瓶中，并用甲醇适量洗涤容器，洗液加入量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，加于规格为100～200目，4g，内径1.5cm，乙醇湿法装柱的氧化铝柱上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。
20.本发明对功劳木和黄柏进行含量测定的方法中，所述超声处理功率为500w，频率为40khz。
21.本发明胶囊中黄芩含量测定的方法为：
22.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研匀，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％乙醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟,放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
23.对照品溶液的制备 另取黄芩苷对照品，加50％乙醇制成每1ml含0.44mg的溶液,作为对照品溶液；
24.测定法 照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.5μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以比例为1～3︰1的乙酸乙酯
‑
甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长λs＝283nm，λ
r
＝365nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计
算，即得。
25.优选的，
26.本发明对功劳木和黄柏进行含量测定的方法中所述测定法为：照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.5μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以比例为2︰1的乙酸乙酯
‑
甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长λs＝283nm，λ
r
＝365nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
27.本发明所述胶囊中栀子含量测定的方法为：
28.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80∶0.1的乙腈
‑
水
‑
0.05％～0.15％磷酸为流动相；检测波长为238nm，理论板数按栀子苷峰计算应不低于3000；
29.对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得；
30.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研细，精密称取0.5g置25ml量瓶中，加60％甲醇20ml，以功率250w、频率40khz超声处理30分钟，放冷，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
31.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
32.优选的，
33.本发明对栀子进行含量测定的方法中所述色谱条件与系统适用性试验为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80∶0.1的乙腈
‑
水
‑
0.1％磷酸为流动相；检测波长为238nm，理论板数按栀子苷峰计算应不低于3000；
34.有益效果：
35.1、本发明对栀子薄层鉴别中供试品的提取方法进行了筛选实验，得到了供试品处理的优选方案，并对栀子薄层鉴别方法进行了方法学考察，结果在专属性考察中，在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的主斑点，且斑点分离较好，阴性无干扰，表明此方法专属性强；在重现性考察中，10批样品检验结果一致，表明此方法的稳定性；在耐用性考察中，在不同薄层板、温度、湿度下考察，结果斑点分离好，无干扰，表明此方法耐用性好。
36.2、本发明对功劳木和黄柏含量测定方法进行了供试品提取方法的筛选实验，得到了供试品处理的优选方案，并对功劳木和黄柏含含量测定方法进行了方法学考察，结果在线性考察中，盐酸小檗碱点样浓度在0.0180μg/l～0.900μg/l范围内呈良好的线性关系；在精密度考察中，同一供试品溶液，重复点样6次，记录吸光度，rsd为0.41％，说明有良好的精密度；在专属性考察中，样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应波长处有相应的吸光度，且阴性无干扰，表明此方法专属性强，并对10批样品进行了盐酸小檗碱含量测定，结果10批盐酸小檗碱含量均符合标准。
37.3、本发明对黄芩含量的测定方法进行了展开剂的筛选实验，得到优选展开剂为乙酸乙酯
‑
甲酸(2：1)，并对黄芩含量的测定方法进行了方法学考察，结果在线性考察中，黄芩苷点样浓度在0.440μg/l～8.80μg/l范围内呈良好的线性关系；在精密度考察中，取同一供试品溶液，重复点样6次，记录吸光度，rsd为0.54％，说明有良好的精密度；在专属性考察
中，样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应波长处有相应的吸光度，且阴性无干扰，表明此方法专属性强，并对10批样品进行了黄芩苷含量测定，结果10批黄芩苷含量均符合标准。
38.4、本发明对栀子含量的测定方法进行了方法验证考察，线性考察结果表明栀子苷进样浓度在0.04mg/ml～2.00mg/ml范围内呈良好的线性关系；
39.精密度试验结果表明重复进样6次，计算相对标准偏差验证方法的精密度，计算rsd％值为0.59％，表明仪器精密度好；回收率试验结果表明栀子苷的回收率为97.45％，rsd为1.54％，说明本法有良好的回收率；专属性考察结果表明样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰；并对10批样品进行了栀子苷含量测定，结果10批栀子苷平均含量均为0.482mg/粒，暂定标准为0.46mg/粒。
具体实施方式
40.实施例1
41.【处方】功劳木604g 黄柏302g 黄芩302g 栀子302g
42.【制法】以上四味，取黄柏100g，粉碎成细粉，剩余的黄柏与功劳木加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏；黄芩，栀子加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏。上述两种稠膏分别加入黄柏细粉，混匀，干燥，粉碎，过60目筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。
43.【鉴别】
44.(1)取本品内容物，置显微镜下观察：纤维鲜黄色，直径16～38μm，常成束，多碎断，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维；石细胞鲜黄色，大多呈不规则分枝状，枝端锐，长约240μm，有的呈类圆形，纺锤形或短棱形，直径35～128μm，壁厚，层纹明显。
45.(2)取装量差异项下的内容物，研细，称取0.5g，加乙醇10ml，置水浴中加热至沸腾，放冷，滤过，取滤液10～15滴，加稀盐酸1ml与次氯酸钙少量,即显樱红色。
46.(3取本品内容物0.6g，加甲醇10ml，加热回流提取50分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇(7:2)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
47.【检查】应符合胶囊剂项下有关的各项规定
48.【含量测定】功劳木和黄柏
49.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研匀，称取1g,精密称定，加甲醇90ml，称重，以功率为500w，频率为40khz超声处理30分钟，用甲醇补足重量，置索氏提取器中，再加热回流至无色，提取液浓缩，转移至50ml量瓶中，并用甲醇适量洗涤容器，洗液加入量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，加于规格为100～200目，4g，内径1.5cm，乙醇湿法装柱的氧化铝柱上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
50.对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.18mg的溶液，作为对照品溶液；
51.测定法 照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液1μl、3μl，供试品溶液3μl，分别交叉
点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶g薄层板上，以比例为7:1:2的正丁醇
‑
冰醋酸
‑
水为展开剂，展开，取出，晾干，避光放置1小时，照薄层色谱法进行扫描，波长λ
s
＝345nm，λ
r
＝370nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，
52.本品每粒含功劳木和黄柏以盐酸小檗碱(c
20
h
18
clno4)计,不得少于2.5mg。
53.【含量测定】黄芩
54.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研匀，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％乙醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟,放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
55.对照品溶液的制备 另取黄芩苷对照品，加50％乙醇制成每1ml含0.44mg的溶液,作为对照品溶液；
56.测定法 照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.5μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以比例2︰1的乙酸乙酯
‑
甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长λ
s
＝283nm，λ
r
＝365nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
57.本品每粒含黄芩以黄芩苷(c
21
h
18
o
11
)计，不得少于9.0mg。
58.【含量测定】栀子
59.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研细，精密称取0.5g置25ml量瓶中，加60％甲醇20ml，以功率250w、频率40khz超声处理30分钟，放冷，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
60.对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得；
61.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80∶0.1的乙腈
‑
水
‑
0.1％磷酸为流动相；检测波长为238nm，理论板数按栀子苷峰计算应不低于3000；
62.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
63.本品每粒含栀子以栀子苷(c
17
h
24
o
10
)计，不得少于0.46mg。
64.【功能与主治】清热解毒,用于实热火毒型急性咽喉炎、急性胆囊炎、急性肠炎。
65.【用法与用量】口服，一次5粒，一日3次。
66.【注意】适用于实热火毒者，三焦热盛之证，虚寒者慎用；虚寒重症者禁用。
67.【规格】每粒装0.3g
68.【贮藏】密封，置阴凉干燥处。
69.【有效期】2年
70.实施例2
71.【处方】功劳木604g 黄柏302g 黄芩302g 栀子302g
72.【制法】以上四味，取黄柏100g，粉碎成细粉，剩余的黄柏与功劳木加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏；黄芩，栀子加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏。上述两种稠膏分别加入黄柏细粉，混匀，干燥，粉碎，过60目筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。
73.【鉴别】
74.(1)取本品内容物，置显微镜下观察：纤维鲜黄色，直径16～38μm，常成束，多碎断，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维；石细胞鲜黄色，大多呈不规则分枝状，枝端锐，长约240μm，有的呈类圆形，纺锤形或短棱形，直径35～128μm，壁厚，层纹明显。
75.(2)取装量差异项下的内容物，研细，称取0.5g，加乙醇10ml，置水浴中加热至沸腾，放冷，滤过，取滤液10～15滴，加稀盐酸1ml与次氯酸钙少量,即显樱红色。
76.(3取本品内容物0.6g，加甲醇5ml，加热回流提取40分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇(7:2)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
77.【检查】应符合胶囊剂项下有关的各项规定
78.【含量测定】功劳木和黄柏
79.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研匀，称取1g,精密称定，加甲醇90ml，称重，以功率为500w，频率为40khz超声处理25分钟，用甲醇补足重量，置索氏提取器中，再加热回流至无色，提取液浓缩，转移至50ml量瓶中，并用甲醇适量洗涤容器，洗液加入量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，加于规格为100～200目，4g，内径1.5cm，乙醇湿法装柱的氧化铝柱上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
80.对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.18mg的溶液，作为对照品溶液；
81.测定法 照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液1μl、3μl，供试品溶液3μl，分别交叉点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶g薄层板上，以比例为7:1:2的正丁醇
‑
冰醋酸
‑
水为展开剂，展开，取出，晾干，避光放置1小时，照薄层色谱法进行扫描，波长λ
s
＝345nm，λ
r
＝370nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，
82.本品每粒含功劳木和黄柏以盐酸小檗碱(c
20
h
18
clno4)计,不得少于2.5mg。
83.【含量测定】黄芩
84.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研匀，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％乙醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟,放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
85.对照品溶液的制备 另取黄芩苷对照品，加50％乙醇制成每1ml含0.44mg的溶液,作为对照品溶液；
86.测定法 照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.5μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以比例1︰1的乙酸乙酯
‑
甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长λ
s
＝283nm，λ
r
＝365nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
87.本品每粒含黄芩以黄芩苷(c
21
h
18
o
11
)计，不得少于9.0mg。
88.【含量测定】栀子
89.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研细，精密称取0.5g置25ml量
瓶中，加60％甲醇20ml，以功率250w、频率40khz超声处理30分钟，放冷，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
90.对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得；
91.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80∶0.1的乙腈
‑
水
‑
0.05％磷酸为流动相；检测波长为238nm，理论板数按栀子苷峰计算应不低于3000；
92.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
93.本品每粒含栀子以栀子苷(c
17
h
24
o
10
)计，不得少于0.46mg。
94.【功能与主治】清热解毒,用于实热火毒型急性咽喉炎、急性胆囊炎、急性肠炎。
95.【用法与用量】口服，一次5粒，一日3次。
96.【注意】适用于实热火毒者，三焦热盛之证，虚寒者慎用；虚寒重症者禁用。
97.【规格】每粒装0.3g
98.【贮藏】密封，置阴凉干燥处。
99.【有效期】2年
100.实施例3
101.【处方】功劳木604g 黄柏302g 黄芩302g 栀子302g
102.【制法】以上四味，取黄柏100g，粉碎成细粉，剩余的黄柏与功劳木加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏；黄芩，栀子加水煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏。上述两种稠膏分别加入黄柏细粉，混匀，干燥，粉碎，过60目筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。
103.【鉴别】
104.(1)取本品内容物，置显微镜下观察：纤维鲜黄色，直径16～38μm，常成束，多碎断，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维；石细胞鲜黄色，大多呈不规则分枝状，枝端锐，长约240μm，有的呈类圆形，纺锤形或短棱形，直径35～128μm，壁厚，层纹明显。
105.(2)取装量差异项下的内容物，研细，称取0.5g，加乙醇10ml，置水浴中加热至沸腾，放冷，滤过，取滤液10～15滴，加稀盐酸1ml与次氯酸钙少量,即显樱红色。
106.(3取本品内容物0.6g，加甲醇15ml，加热回流提取60分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇(7:2)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
107.【检查】应符合胶囊剂项下有关的各项规定
108.【含量测定】功劳木和黄柏
109.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研匀，称取1g,精密称定，加甲醇90ml，称重，以功率为500w，频率为40khz超声处理25分钟，用甲醇补足重量，置索氏提取器中，再加热回流至无色，提取液浓缩，转移至50ml量瓶中，并用甲醇适量洗涤容器，洗液加入量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，加于规格为100～200目，4g，内径1.5cm，乙
醇湿法装柱的氧化铝柱上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
110.对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.18mg的溶液，作为对照品溶液；
111.测定法 照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液1μl、3μl，供试品溶液3μl，分别交叉点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶g薄层板上，以比例为7:1:2的正丁醇
‑
冰醋酸
‑
水为展开剂，展开，取出，晾干，避光放置1小时，照薄层色谱法进行扫描，波长λ
s
＝345nm，λ
r
＝370nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，
112.本品每粒含功劳木和黄柏以盐酸小檗碱(c
20
h
18
clno4)计,不得少于2.5mg。
113.【含量测定】黄芩
114.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研匀，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％乙醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟,放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
115.对照品溶液的制备 另取黄芩苷对照品，加50％乙醇制成每1ml含0.44mg的溶液,作为对照品溶液；
116.测定法 照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.5μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以比例3︰1的乙酸乙酯
‑
甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长λ
s
＝283nm，λ
r
＝365nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
117.本品每粒含黄芩以黄芩苷(c
21
h
18
o
11
)计，不得少于9.0mg。
118.【含量测定】栀子
119.供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研细，精密称取0.5g置25ml量瓶中，加60％甲醇20ml，以功率250w、频率40khz超声处理30分钟，放冷，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
120.对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得；
121.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80∶0.1的乙腈
‑
水
‑
0.15％磷酸为流动相；检测波长为238nm，理论板数按栀子苷峰计算应不低于3000；
122.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
123.本品每粒含栀子以栀子苷(c
17
h
24
o
10
)计，不得少于0.46mg。
124.【功能与主治】清热解毒,用于实热火毒型急性咽喉炎、急性胆囊炎、急性肠炎。
125.【用法与用量】口服，一次5粒，一日3次。
126.【注意】适用于实热火毒者，三焦热盛之证，虚寒者慎用；虚寒重症者禁用。
127.【规格】每粒装0.3g
128.【贮藏】密封，置阴凉干燥处。
129.【有效期】2年
130.为了进一步验证本发明的有效性，发明人进行了一系列的验证试验，摘录部分如
下：
131.实验例
132.1材料、设备、试剂及对照品
133.1.1材料
[0134][0135]
1.2设备
[0136][0137]
1.3试剂
[0138][0139]
1.4对照品
[0140][0141]
2检测方法修订的来源
[0142]
原功劳去火胶囊收载于ws3
‑
063(z
‑
063)
‑
2000(z)，标准中原有检测项目为：性状；显微鉴别、显色反正、栀子的薄层鉴别；功劳木和黄柏含量测定；黄芩含量测定。但在实际检测中存在以下问题：(1)栀子的薄层鉴别斑点模糊，重现性差，影响检验结果的判断；(2)功劳木和黄柏薄层色谱法含量测定过程中，回流至无色时，时间长达8小时，且展开斑点较小且模糊，重现性差，影响检验结果的判断；(3)黄芩薄层色谱法含量测定过程中，主斑点较模糊、且出现拖尾现象，斑点rf值偏小，影响检验结果的判断；(4)该检测方法未涉及栀子含量
测定，不能有效控制功劳去火胶囊成品的质量。根据提高质量标准要求，拟对原标准检测项目进行修订及增加栀子含量测定。经实验研究对本品质量标准提出增修订草案，增修订内容实验依据如下。
[0143]
3检测方法修定内容
[0144]
3.1栀子药材薄层鉴别的修定
[0145]
原标准收载方中栀子的薄层鉴别，原标准收载方法栀子的提取是超声处理，薄层鉴别斑点模糊，重现性差，影响检验结果的判断，故在此，对本栀子药材的鉴别进行了修订，改变栀子的提取方式，经过多次实验结果，最终确定修订后的方法为：取本品内容物0.6g，加甲醇10ml，加热回流提取50分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇(7:2)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。
[0146]
3.1.1供试品提取方法的筛选
[0147]
取本品内容物3份，各0.6g，分别按以下提取方法制备供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇(7:2)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，结果见表1。
[0148]
方法1：取本品内容物0.6g，加甲醇10ml，加热回流提取50分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液；
[0149]
方法2：取本品内容物0.6g，加甲醇10ml，超声提取50分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液；
[0150]
方法3：取本品内容物0.6g，加甲醇10ml，振摇提50分钟，放冷，滤过，作为供试品溶液。
[0151]
表1供试品提取方法的筛选表
[0152][0153]
结果，由表一可知，方法1处理的样品，斑点清晰，分离度符合要求，rf值适中，重现性好，故“方法1”为供试品溶液处理的优选方案。
[0154]
3.1.2方法学验证
[0155]
3.1.2.1专属性
[0156]
取功劳去火胶囊、栀子对照药材及缺栀子阴性样品，同实施例1所述方法制得供试品溶液、对照品溶液及阴性供试品溶液，点于同一硅胶g薄层板上，以氯仿
‑
甲醇(7:2)为展开剂,展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的主斑点，且斑点分离较好，阴性无干扰。
[0157]
3.1.2.2重现性
[0158]
取按“实施例1”制备的功劳去火胶囊10批，分别按“3.1”项下栀子药材的薄层鉴别
修定的方法展开，结果见表2。
[0159]
表2试验方法、条件及重现性试验结果
[0160][0161]
3.1.2.3耐用性
[0162]
3.1.2.3.1不同薄层板的比较
[0163]
取按“实施例1”制备的功劳去火胶囊10批，分别按“3.1”项下栀子药材的薄层鉴别修定的方法展开，比较青岛海洋化工厂分厂硅胶g商品板和高效硅胶g商品板的薄层，结果见表3。
[0164]
表3不同薄层板耐用性结果表
[0165]
[0166][0167]
结果：高效硅胶板商品板斑点清晰，分离符合要求，rf值适中；硅胶g商品板斑点清晰，分离达到要求,rf值适中，故本方法耐用性好。
[0168]
3.1.2.3.2不同湿度的比较
[0169]
比较了低湿度(30％)和高湿度(75％)环境下高效薄层板展开效果，结果见表4。
[0170]
表4低湿度(30％)和高湿度(75％)环境下高效薄层板展开效果表
[0171][0172][0173]
结果：斑点清晰，分离符合要求，rf值适中，两个条件下均能得到较好的鉴别色谱。
[0174]
经上述方法学验证试验，结果表明不同湿度条件下，用高效薄层板和硅胶g商品板进行试验，色谱图斑点清晰，分离符合要求，rf值适中，验证试验表明重现性好、耐用性好。
[0175]
3.2功劳木和黄柏含量测定的修定
[0176]
功劳木和黄柏含量测定为原标准收载，由于原标准供试品的提取方法为回流提取至无色，实际操作中提取时间已达8小时，提取效率较低，且展开斑点较小且模糊，重现性差，故在此我们采取先超声处理，再回流提取，缩短检测时间，对不同提取方法、不同提取时间比对，根据比较结果，对供试品溶液提取方法进行了修订，在回流提取的前增加超声处理，功劳木和黄柏有效成分提取更完全，减少回流提取时间，提高检验效率，展开后斑清晰，重现性好，经过多次实验筛选，最终确定修订后的方法为：
[0177]
供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研匀，称取1g,精密称定，加甲醇90ml，称重，超声处理30分钟，用甲醇补足重量，置索氏提取器中，再加热回流至无色，提取液浓缩，转移至50ml量瓶中，并用甲醇适量洗涤容器，洗液加入量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，加于规格为100～200目，4g，内径1.5cm，乙醇湿法装柱的氧化铝柱上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀即得；
[0178]
对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.18mg的溶液，即得。
[0179]
测定法 照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液1μl、3μl，供试品溶液3μl，分别交叉点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶g薄层板上，以比例为7:1:2的正丁醇
‑
冰醋酸
‑
水为展开剂，展开，取出，晾干，避光放置1小时，照薄层色谱法进行扫描，波长λ<[s]>＝345nm，λ<[r]>＝370nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
[0180]
3.2.1供试品处理的方法的筛选
[0181]
3.2.1.1样品提取方法的筛选
[0182]
取“实施例1”制备的功劳去火胶囊装量差异项下的内容物，研匀，分别取3份样品各1g，精密称定。分别按以下方法制备供试品溶液：
[0183]
方法一：加甲醇90ml，称重，超声处理30min，用甲醇补足重量，置索氏提取器中，再加热回流至无色(2h)，提取液浓缩，转移至50ml量瓶中，并用甲醇适量洗涤容器，洗液加入量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，加于规格为100～200目，4g，内径1.5cm，乙醇湿法装柱的氧化铝柱上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀即得。
[0184]
方法二：置于索氏提取器中，加甲醇90ml，加热回流至无色(约8h)，提取液浓缩，转移至50ml量瓶中，并用甲醇适量洗涤容器，洗液加入量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2ml，加于氧化铝柱上(100～200目，4g，内径1.5cm，乙醇湿法装柱)上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀即得；
[0185]
方法三：加甲醇90ml，称重，超声处理30分钟，用甲醇补足重量，摇匀，精密吸取2ml，加于规格为100～200目，4g，内径1.5cm，乙醇湿法装柱的氧化铝柱上，用乙醇30ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加适量甲醇使溶解，定量转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀即得。
[0186]
经以上三种提取方试的供试品分别按“3.2”项下功劳木和黄柏修定的方法检测，结果见表5。
[0187]
表5提取方法的选择
[0188][0189]
结果：由表5可知，“方法一”“方法二”处理的供试品，含量均大于标准2.5mg/粒，但“方法二”薄层展开后斑点模糊，重现性差，故“方法一”为供试品处理的优选方案。
[0190]
3.2.1.2样品提取时间筛选
[0191]
取“实施例1”制备的功劳去火胶囊装量差异项下的内容物，研匀，分别取5份(样品1
‑
样品5)，各称取1g,精密称定，加甲醇90ml，称重，超声处理时间依次为20min、25min、30min、35min、40min，用甲醇补足重量，置索氏提取器中，再加热回流至无色所需的回流时间见表6。
[0192]
表6提取时间与含量考察表
[0193][0194]
结果：由表6可知，超声时间在25
‑
30min时，回流时间相差不大，超声时间在30
‑
40min时，回流至样品无色的时间相同，且盐酸小檗碱含量均相当，为了提高检测效率，超声时间30min、回流时间2h为样品提取时间的优选方案。
[0195]
3.2.2方法学考察
[0196]
3.2.2.1线性考察
[0197]
精密取浓度0.018mg/ml、0.036mg/ml、0.180mg/ml、0.360mg/ml、0.900mg/ml的盐酸小檗碱溶液，以标准工作液的吸光度对其相应浓度进行回归分析，得到线性方程为y＝11.25x
‑
0.0043，r2＝1，表明盐酸小檗碱点样浓度在0.0180μg/l～0.900μg/l范围内呈良好的线性关系，结果见表7。
[0198]
表7盐酸小檗碱线性关系考察
[0199][0200]
3.2.2.2精密度试验
[0201]
取同一供试品溶液，重复点样6次，记录吸光度，结果见表8，rsd为0.41％，说明有良好的精密度。
[0202]
表8精密度试验
[0203][0204]
3.2.2.3专属性
[0205]
取功劳去火胶囊、缺功劳木和黄柏阴性样品，同实施例1所述方法制得供试品溶液及阴性供试品溶液，分别取供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液点样、展开、照薄层色谱法进行扫描，样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应波长处有相应的吸光度，且阴性无干扰。
[0206]
3.2.2.4十批样品的盐酸小檗碱测定：结果见表9。
[0207]
表9 10批样品含量测定结果
[0208][0209][0210]
结果：由表9可知，10批样品测定结果，每粒含功劳木和黄柏以盐酸小檗碱(c
20
h
18
clno4)计,均大于2.5mg(标准为：不得少于2.5mg)。
[0211]
3.3黄芩进行含量测定的修定
[0212]
黄芩含量测定为原标准收载，由于原标准黄芩薄层色谱法试验中展开剂为36％醋酸，结果主斑点较模糊、且出现拖尾现象，斑点rf值偏小，影响检验结果的判断，故在此我们对展开剂作了进一步的筛选实验，根据供薄层斑点的标准要求，结合原有标准出现的问题，分析不同展的影响，经过多次实验筛选，对黄芩薄层色谱法试验中展开剂进行了修订，最终确定修订后的黄芩含量测定的方法为：
[0213]
供试品溶液的制备 取“实施例1”制备的功劳去火胶囊装量差异项下的内容物，研匀，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％乙醇50ml，密塞，摇匀，称定重量，加热回流30分钟,放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
[0214]
对照品溶液的制备 另取黄芩苷对照品，加50％乙醇制成每1ml含0.44mg的溶液,
作为对照品溶液；
[0215]
测定法 照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.5μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以比例为2︰1的乙酸乙酯
‑
甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长λ<[s]>＝283nm，λ<[r]>＝365nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。
[0216]
3.3.1展开剂的筛选
[0217]
取“实施例1”制备的功劳去火胶囊装量差异项下的内容物，研匀，分别取3份样品各0.5g，精密称定。按“3.3“项下黄芩的含量测定进行测定，分别以“方法1
‑
4”的展开剂展开，结果见表10。
[0218]
方法一：展开剂为2︰1的乙酸乙酯
‑
甲酸；
[0219]
方法二：展开剂为乙酸乙酯；
[0220]
方法三：展开剂为甲酸；
[0221]
方法四：展开剂为36％醋酸；
[0222]
表10黄芩薄层展开剂考察表
[0223][0224]
结果，由表10可知，展开剂为“2︰1的乙酸乙酯”的3个样品薄层色谱结果均为斑点清晰，分离度符合要求，rf值适中，符合规定，故为优选展开剂。
[0225]
3.3.2方法学考察
[0226]
3.3.2.1线性考察
[0227]
精密取浓度0.440mg/ml、0.880mg/ml、2.200mg/ml、4.400mg/ml、8.800mg/ml的黄芩苷溶液，以标准工作液的吸光度对其相应浓度进行回归分析，得到线性方程为y＝1.2571x
‑
0.0423，r2＝0.9994，表明黄芩苷点样浓度在0.440μg/l～8.80μg/l范围内呈良好的线性关系，结果见表11。
[0228]
表11黄芩线性关系考察
[0229][0230]
3.2.2.2精密度试验
[0231]
取同一供试品溶液，重复点样6次，记录吸光度，结果见表12，rsd为0.54％，说明有良好的精密度。
[0232]
表12精密度试验
[0233][0234]
3.2.2.3专属性
[0235]
取功劳去火胶囊、黄芩阴性样品，同实施例1所述方法制得供试品溶液及阴性供试品溶液，分别取供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液点样、展开、照薄层色谱法进行扫描，样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应波长处有相应的吸光度，且阴性无干扰。
[0236]
3.2.2.4十批样品的黄芩苷测定：结果见表13。
[0237]
表13 10批样品含量测定结果
[0238][0239]
结果：由表13可知，10批样品测定结果，每粒含黄芩以黄芩苷(c
21
h
18
o
11
)计,均大于9.0mg(标准为：不得少于9.0mg)。
[0240]
3.4栀子含量测定
[0241]
栀子含量测定为原标准未收载，不能有效控制产品质，为了提升质量标准，参照2020版一部药典中栀子的质量标准，结合功劳去火胶囊的成分特征，经过大量的实验筛选，
得到功劳去火胶囊中栀子药材含量测定方法为：
[0242]
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以比例为20∶80∶0.1的乙腈
‑
水
‑
0.1％磷酸为流动相；检测波长为238nm，理论板数按栀子苷峰计算应不低于3000；
[0243]
对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得；
[0244]
供试品溶液的制备 取实施例1制备的功劳去火胶囊装量差异项下的内容物，研细，精密称取0.5g置25ml量瓶中，加60％甲醇20ml，以功率250w、频率40khz超声处理30分钟，放冷，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
[0245]
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0246]
3.4.1方法验证
[0247]
3.4.1线性考察 精密吸取栀子苷对照品溶液0.04mg/ml、0.08mg/ml、0.20mg/ml、0.40mg/ml、0.80mg/ml、2.00mg/ml以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到线性方程为y＝22232.4x
‑
1.0655，r2＝0.9998,见表10。表明栀子苷进样浓度在0.04mg/ml～2.00mg/ml范围内呈良好的线性关系。
[0248]
表10栀子苷线性关系考察
[0249][0250]
3.4.2精密度试验 取以上按对照品溶液的制备方法制备的0.40mg/ml栀子苷对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，计算相对标准偏差验证方法的精密度，计算rsd％值为0.59％，表明仪器精密度好，测定结果见表11。
[0251]
表11精密度试验
[0252][0253]
3.4.3回收率试验 采用加样回收，精密吸取已测定栀子苷含量为0.48mg/粒的样品，再加栀子苷对照品适量，按实施例1所述色谱条件测定，计算回收率，结果见表12，栀子苷的回收率为97.45％，rsd为1.54％，说明本法有良好的回收率。
[0254]
表12回收率试验
[0255][0256]
3.4.4专属性
[0257]
取实施例1制备的功劳去火胶囊及阴性样品按供试品溶液制备方法制备样品溶液及阴性样品溶液，按上述色谱条件，分别取对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪，样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰。
[0258]
3.4.5稳定性试验
[0259]
按“3.4”项下方法制备供试品溶液一份，室温放置，按拟定色谱条件下于0，2，4，8，12，24h分别进样，测定峰面积。供试品溶液rsd％为1.01％，表明该检测方法栀子苷在24小时内相对稳定。稳定性试验结果见表13。
[0260]
表13稳定性试验结果
[0261][0262]
3.4.6十批样品的栀子苷含量测定：结果见表14。
[0263]
表14十批样品含量测定结果
[0264][0265]
结果：由表14可知，10批样品栀子苷的平均含量为0.482mg/粒，根栀子的投料量，
暂定本品每粒含栀子以栀子苷c
17
h
24
o
10
计，不得少于0.46mg。
[0266]
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。