一种复合菌剂、应用以及利用复合菌剂制备藜麦发酵乳的方法与流程

1.本发明涉及保健食品技术领域，特别是涉及一种复合菌剂、应用以及利用复合菌剂制备藜麦发酵乳的方法。


背景技术：

2.乳酸菌(lactic acid bacteria，lab)是发酵食品和饮料中常用的益生菌，也是人类或动物的食品补充剂，其种类繁多，广泛存在于人和动物的肠道内、食物中。乳酸菌可通过改善和稳定肠道微生物群对宿主产生积极影响，这些细菌粘附在肠上皮细胞上，通过产生抗菌物质，如有机酸和细菌素，阻止有害微生物的发展。它们也可以通过激活巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞和释放多种细胞因子来增强非特异性细胞免疫应答。此外，它们可以通过增加iga( )细胞的数量来改善肠道粘膜免疫系统。乳酸杆菌(lactobacillus)在许多疾病的治疗中发挥着重要作用，包括腹泻、胃肠炎、炎症性肠病、高血糖症以及与免疫功能受损直接相关的慢性代谢性综合疾病。乳酸菌发酵食品的作用主要有：(1)通过发酵不同食物基质可获得特殊口味、香味及质地；(2)通过代谢乳酸、酒精、乙酸和碱性发酵抑制腐败菌达到保存食品的目的；(3)通过代谢蛋白质、必需氨基酸、脂肪酸对产品进行生物富集。不同菌种不仅形态各异，其生理特性也大不相同。
3.杂粮发酵乳是以杂粮与生牛乳或复原乳为主料，经巴氏杀菌后，接入乳酸菌进行发酵制成一种具有特殊风味且富含益生活性的乳制品。杂粮富含膳食纤维、抗性淀粉等抗消化物质，这类物质不仅可以控制体重，而且食用后不会引起身体内血糖浓度的快速升高，属于低血糖生成指数(低gi)食物原料。其次谷类食物含有丰富的植物活性成分，比如酚类化合物、皂苷、植物雌激素等，经常食用可有效的预防糖尿病、癌症及心脑血管等慢性疾病。杂粮发酵乳对人类膳食平衡具有重要意义，比普通发酵乳来说更具有研究价值。
4.藜麦被认为是适合所有人的植物性食品，可作为健康意识较强的消费者、素食者及运动员等人群的主要膳食选择，因为它与大多数杂粮作物相比蛋白利用率更高，氨基酸构成比例平衡，与牛奶中酪蛋白类似，在很多地方可以代替肉制品和奶制品为人体提供蛋白质。藜麦籽粒中蛋白质含量为7.47％～22.08％，其中主要由11s型球蛋白和2s白蛋白构成，分别占总蛋白的37％和35％，另外还含有少部分醇溶蛋白。藜麦氨基酸组成比例更接近人体所需氨基酸比例，富含赖氨酸(5.1％～6.4％)、蛋氨酸(0.4％～1.0％)和特殊人群所需的组氨酸。藜麦种子的碳水化合物含量与其他杂粮相当，主要成分是淀粉，淀粉干物质约在30％～70％之间，藜麦粉呈现的特性很大程度上取决于藜麦淀粉的组成和性质。藜麦淀粉颗粒小，直链淀粉所占比例较低，与支链淀粉的比例为1:3，支链淀粉具有大量的短链和超长链，这些特征使藜麦淀粉在食品工业和其他行业得到了很广泛的应用，如制作皮克林乳液。藜麦油可作为皮肤保湿剂应用于化妆品中，这是由于藜麦中天然必需脂肪酸和维生素e的强大组合，使它成为一种抗氧化和抗炎复合物，有助于恢复皮肤表皮的屏障功能，并通过增加胶原蛋白和弹性蛋白来预防过早衰老的现象。藜麦总膳食纤维含量约为13.4％，
其中可溶性膳食纤维约为2.4％，不可溶性膳食纤维约为11.0％。藜麦膳食纤维具有较强的吸水膨胀能力，经蒸煮后体积迅速增大，摄入后可提高机体饱腹感，降低进食量，从而有利于控制体重，另外可对预防心血管疾病、调节糖代谢和脂代谢、抗肿瘤能力产生影响。经饲喂小鼠试验证明长期食用藜麦可使机体血糖、血脂水平大幅度下降，属低糖、低热量食品，因此可将藜麦作为三高人群、肥胖人群以及糖尿病患者的主要膳食选择。藜麦是一种无麸质食品，可治疗乳糜泻患者，为麸质过敏(2％成年人和5％儿童)的人群提供了各种营养食品。
5.复杂的慢性疾病糖尿病是全球第11个死亡原因，目前尚无彻底根治糖尿病的方法，只能从提高人体胰岛细胞敏感性、降低胰岛素抵抗、降低餐后血糖等思路进行治疗。目前乳酸菌等具有抗糖尿病潜力的益生菌被应用于天然产物的接种，以进一步提高其抗糖尿病活性，研究证明益生菌发酵产品可以作为一种补充或辅助治疗糖尿病的功能性食品，但以现有乳酸菌发酵菌剂制备的杂粮发酵乳的抗氧化性和辅助降糖效果并不理想，市场上尚缺乏一种辅助降糖效果优异的藜麦发酵乳保健食品。因此，制备一种辅助降糖效果好、可以满足糖尿病人食用需求的藜麦发酵乳是十分必要的。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种复合菌剂、应用以及利用复合菌剂制备藜麦发酵乳的方法，以解决上述现有技术存在的问题，使藜麦发酵乳的辅助降糖效果好、可以满足糖尿病人的食用需求。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明的技术方案之一是提供一种复合菌剂，所述复合菌剂为植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌质量比1
‑
3:1
‑
3的复合菌剂。
9.进一步地，所述复合菌剂为植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌质量比2:1的复合菌剂。
10.本发明的技术方案之一是提供上述复合菌剂在制备发酵乳方面的应用。
11.进一步地，所述发酵乳为藜麦发酵乳。
12.本发明的技术方案之三是提供上述复合菌剂制备藜麦发酵乳的方法，包括以下步骤：
13.将藜麦进行熟化后打浆制得藜麦浆；
14.将所述藜麦浆与木糖醇和复原乳混合，将得到的混合物加热均质，得到均质后的混合物；
15.将所述均质后的混合物灭菌后冷却，接种所述复合菌剂，发酵，即得所述藜麦发酵乳。
16.进一步地，所述打浆的料水比为1g:5ml。
17.进一步地，所述藜麦浆的添加量为所述混合物质量的20
‑
40％。
18.进一步地，所述木糖醇的添加量为所述混合物质量的3
‑
7％。
19.进一步地，所述加热的温度为70℃；所述均质的压力为20mpa，时间为10min。
20.进一步地，所述复合菌剂的接种量为2
‑
4％。
21.进一步地，所述复合菌剂的接种量为3％。
22.进一步地，所述发酵温度为36
‑
40℃，所述发酵时间为6
‑
8h。
23.进一步地，所述发酵温度为38℃，所述发酵时间为8h。
24.本发明公开了以下技术效果：
25.本发明的复合菌剂能够使藜麦发酵乳具有优异的抗氧化性和辅助降糖效果，利用该复合菌剂制得的藜麦发酵乳，其基本营养成分符合糖尿病人需求，微生物指标符合标准。
26.本发明制得的无蔗糖藜麦发酵乳dpph自由基清除率、abts

自由基清除率、羟基自由基清除率、fe
3
还原能力、α
‑
葡萄糖苷酶抑制率、α
‑
淀粉酶抑制率均高于普通发酵乳，具有较好的抗氧化能力和抑制相关消化酶的能力，具有良好体外辅助降血糖功能，可以满足糖尿病人食用需求。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为乳酸菌生长曲线；
29.图2为乳酸菌不同ph耐受结果，其中，图a为乳酸菌在ph 2.0时耐受结果，图b为乳酸菌在ph 3.0时耐受结果；
30.图3为乳酸菌胆盐耐受结果，其中，图a为乳酸菌在0.3％胆盐时耐受结果，图b为乳酸菌在0.5％胆盐时耐受结果；
31.图4为复合发酵剂比例对发酵乳ph和活菌数的影响；
32.图5为木糖醇添加量对发酵乳品质的影响；
33.图6为藜麦浆添加量对发酵乳sod活力及感官评分的影响；
34.图7为乳酸菌接种量对发酵乳sod活力及感官评分的影响；
35.图8为发酵温度对发酵乳sod活力及感官评分的影响；
36.图9为发酵时间对发酵乳sod活力及感官评分的影响；
37.图10为不同浓度发酵乳dpph自由基清除率变化；
38.图11为不同浓度发酵乳abts

自由基清除率变化；
39.图12为不同浓度发酵乳羟基自由基清除率变化；
40.图13为不同浓度发酵乳fe
3
还原能力变化；
41.图14为不同浓度发酵乳α
‑
葡萄糖苷酶抑制率变化；
42.图15为不同浓度发酵乳α
‑
淀粉酶抑制率变化。
具体实施方式
43.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
44.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括
或排除在范围内。
45.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
46.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
47.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
48.本发明所用材料与试剂：
49.藜麦，青海高原红藜麦；脱脂奶粉，黑龙江双城雀巢有限公司；嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus，la)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum，lp)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus，lr)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei，lcp)，东北农业大学菌库；氢氧化钠、盐酸、氯化铁、牛胆盐、铁氰化钾、酚酞，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；sod活力检测试剂盒、羟自由基测试盒，南京建成生物工程研究所；1,1
‑
二苯基
‑2‑
三硝基苯肼(dpph)、2,2
‑
联氮
‑
二(3
‑
乙基
‑
苯并噻唑
‑6‑
磺酸)二铵盐(abts)，美国sigma公司；α
‑
葡萄糖苷酶、对硝基苯酚
‑
α
‑
d
‑
吡喃葡葡糖苷(pnpg)溶液、α
‑
淀粉酶，上海源叶生物科技有限公司。
50.乳酸菌菌种活化：
51.甘油保存的菌液接种于灭菌后的mrs液体培养基中，摇匀，放置于37℃的恒温培养箱培养24h，在无菌操作台中挑取菌液，采用平板划线法接入mrs固体培养基中，放置于37℃的恒温培养箱培养24h，连续传代3次，使其充分活化，挑取斜面培养基生长较好的菌落接种至mrs液体培养基中37℃培养24h，于4℃冰箱保存备用。
52.实施例1
53.(1)藜麦浆制备：挑选籽粒饱满、颜色均匀的红藜麦，反复清洗2遍，放于蒸锅中100℃熟化40min，按1:5(g/ml)料水比，10000转/分打浆5min至充分磨匀，过200目筛得藜麦浆，于4℃冰箱保存备用。
54.(2)复原乳制备：将脱脂乳粉25g加入180ml 70℃蒸馏水，混合均匀。
55.(3)均质：将30％藜麦浆和5％木糖醇加入复原乳中，预热至70℃，混合均匀，于20mpa条件下均质10min。
56.(4)灭菌：采用高压灭菌法于95℃下，灭菌10min。
57.(5)将灭菌后的混合物冷却至25℃，然后接种3％复合发酵剂(lp：la质量比2:1)，在38℃下发酵8h，即得藜麦发酵乳。
58.制得的藜麦发酵乳的sod活力为241.17u/ml。
59.实施例2
60.(1)藜麦浆制备：挑选籽粒饱满、颜色均匀的红藜麦，反复清洗2遍，放于蒸锅中100℃熟化50min，按1:5(g/ml)料水比，10000转/分打浆5min至充分磨匀，过200目筛得藜麦浆，
于4℃冰箱保存备用。
61.(2)复原乳制备：将脱脂乳粉25g加入180ml 70℃蒸馏水，混合均匀。
62.(3)均质：将20％藜麦浆和3％木糖醇加入复原乳中，预热至70℃，混合均匀，于20mpa条件下均质10min。
63.(4)灭菌：采用高压灭菌法于95℃下，灭菌10min。
64.(5)将灭菌后的混合物冷却至25℃，然后接种2％复合发酵剂(lp：la质量比1:1)，在36℃下发酵7h，即得藜麦发酵乳。
65.实施例3
66.(1)藜麦浆制备：挑选籽粒饱满、颜色均匀的红藜麦，反复清洗2遍，放于蒸锅中100℃熟化45min，按1:5(g/ml)料水比，10000转/分打浆5min至充分磨匀，过200目筛得藜麦浆，于4℃冰箱保存备用。
67.(2)复原乳制备：将脱脂乳粉25g加入180ml 70℃蒸馏水，混合均匀。
68.(3)均质：将40％藜麦浆和7％木糖醇加入复原乳中，预热至70℃，混合均匀，于20mpa条件下均质10min。
69.(4)灭菌：采用高压灭菌法于95℃下，灭菌10min。
70.(5)将灭菌后的混合物冷却至25℃，然后接种4％复合发酵剂(lp：la质量比1:2)，在40℃下发酵6h，即得藜麦发酵乳。
71.实施例4乳酸菌生长曲线
72.将上述4株乳酸菌接种于mrs液体培养基中，以未接种乳酸菌的mrs液体培养基作为空白对照，每隔6h取定量混合均匀的发酵液测量其od
600
值，结果见图1。
73.图1显示，大多数菌株在24h左右生长速度降低，其生长状况处于从对数期过渡到平稳期，当发酵时间为30h时，生长速率接近于0，其菌体数量变化较小，即大多数菌株在30h时生长过程进入稳定期，菌株lcp的菌体数量在12h～30h间迅速增大，此范围是其生长对数期，相比较其他菌，菌株lcp对数期时间较长，而菌株lp和la在0h～6h时快速增长，说明这两种菌株的延滞期较短，可快速进入生长繁殖阶段，且一直处于高活菌数状态。
74.实施例5乳酸菌耐ph 2.0、ph 3.0酸性
75.将乳酸菌接种于经hcl调整ph分别为2.0和3.0的mrs液体培养基中，37℃恒温培养0h、1h、2h、3h后进行梯度稀释涂布测定活菌数，结果如图2所示，其中，图a为乳酸菌在ph 2.0时耐受结果，图b为乳酸菌在ph 3.0时耐受结果。
76.实施例6乳酸菌耐0.3％、0.5％胆盐
77.将乳酸菌接种于胆盐浓度分别为0.3％和0.5％的mrs液体培养基中，37℃培养箱恒温培养0h、1h、2h、4h后进行梯度稀释涂布测定活菌数，结果如图3所示，其中，图a为乳酸菌在0.3％胆盐时耐受结果，图b为乳酸菌在0.5％胆盐时耐受结果。
78.人体小肠胆盐浓度正常为0.3％左右，胆盐可破坏乳酸菌细胞膜的结构和对菌体的脱氧核糖核酸产生损伤，从而抑制生长或逐渐杀死菌体，乳酸菌想要充分发挥生理活性，必须要适应胃肠特殊环境，因此菌株对酸和胆盐的耐受能力已成为评价菌株是否具有益生特性的必要条件之一。
79.在mrs液体培养基胆盐浓度0.3％的条件下，发现菌株均有不同胆盐耐受性，随着时间延长，活菌数均有不同程度的下降，当时间为1h～4h时，菌体数量变化趋于平缓，说明
乳酸菌菌体已适应生长环境，在发酵时间在4h时，菌株lp活菌数最大，可见在0.3％胆盐时菌株lp耐受性最好。
80.在mrs液体培养基胆盐浓度0.5％的条件下，胆盐浓度增加，4种不同菌株生长状况有明显差别，且随着时间延长，4株乳酸菌活菌数下降程度更大，最终当发酵时间为4h时，菌株lp存活菌体数量最多，菌株lp胆盐浓度0.5％时耐受性最好，此结果与胆盐浓度0.3％时基本一致。
81.实验结果显示，4种乳酸菌株耐胆盐能力从大到小排序依次为lp、lcp、la、lr。
82.实施例7复合发酵剂比例对发酵乳ph和活菌数的影响
83.选用lp和la作为发酵菌种，设置不同比例的复合发酵剂(lp:la为1:3、1:2、1:1、2:1、3:1)，分析复合发酵剂比例对发酵乳ph和活菌数的影响，结果见图4。
84.由图4可以看出，随着lp接种比例的增大发酵乳ph逐渐降低。分析原因lp产酸量较大，其接种比例越多发酵乳中酸度越高。lp和la以2:1比例复配时，发酵乳中活菌数最高达6.54
×
109cfu/ml，随后下降，考虑可能是发酵乳内部环境酸度过高，导致菌株生长繁殖受到一定的抑制，使菌株活菌数减少，并且发酵乳酸度过高，口感不宜被消费者接受。
85.实施例8木糖醇添加量对发酵乳感官评分的影响
86.添加不同含量的木糖醇(3％、4％、5％、6％、7％)，对发酵乳进行色泽、气味、口感、组织形态等综合感官评价，木糖醇添加量对发酵乳品质的影响如图5所示。
87.发酵乳的感官评分值随着木糖醇添加量的增加，呈现先增加后降低的趋势。木糖醇添加量过少，发酵乳过酸，发酵效果不好，组织状态不稳定。木糖醇添加量过多，发酵乳口感偏甜，感官评分下降。
88.实施例9藜麦浆添加量对发酵乳sod活力及感官评分的影响
89.设定接菌量3％、发酵温度为38℃、发酵时间为8h，藜麦浆添加量依次取10％、20％、30％、40％、50％，4℃静置2h以停止发酵，发酵结束测定sod活力及感官评分，结果见图6。
90.藜麦经乳酸菌发酵代谢产生超氧化物歧化酶(sod)、脂肪酶、蛋白酶等多功效酶类，其中sod是最重要的抗氧化酶之一，在机体内能够使超氧阴离子自由基发生歧化，从而降低细胞内游离金属离子浓度，减轻h2o2的损伤，可直接用于衡量机体抗氧化能力强弱。藜麦浆添加量为30％时，发酵乳sod活力和感官评分均达最高，这可能是由于混合液中糖类物质恰好促进乳酸菌生长繁殖。藜麦富含的酚类、黄酮类、sod类活性物质，能够显著抑制脂质过氧化和清除o2‑
自由基的能力；当藜麦浆过多时，原料难以调配均匀，导致乳酸菌发酵不充分，抗氧化酶系统受损，发酵乳sod活力下降。
91.实施例10乳酸菌接种量对发酵乳sod活力及感官评分的影响
92.设定藜麦添加量为30％、发酵温度为38℃、发酵时间为8h，接菌量依次取1％、2％、3％、4％、5％，4℃静置2h以停止发酵，发酵结束测定sod活力及感官评分，结果见图7。
93.由图7可知，随乳酸菌接种量的增加，发酵乳sod活力和感官评分均呈现先升高后下降的趋势。乳酸菌接种量为3％时，发酵乳sod活力和感官评分均达最高，接种量较少时发酵乳易污染杂菌形成不利于菌种增殖生长的环境且发酵乳凝乳状态差，组织不清晰。若接种量超过3％，发酵过度导致发酵乳ph改变，过酸、过碱会使菌体处于不利于本身繁殖生长的环境，致使乳酸菌生长提前进入衰亡期。sod化学本质为蛋白质，其分子内部规律性结构
易受ph、温度等物理或化学因素影响导致氢键断裂进而空间结构被破坏，致使sod活性降低。
94.实施例11发酵温度对发酵乳sod活力及感官评分的影响
95.设定藜麦添加量为30％、接菌量为3％、发酵时间为8h，发酵温度依次取34℃、36℃、38℃、40℃，42℃，4℃静置2h以停止发酵，发酵结束测定sod活力及感官评分，结果见图8。
96.由图8可知，随发酵温度的增加，发酵乳sod活力和感官评分均呈现先升高后下降的趋势，在发酵温度为38℃时，发酵乳的sod活力和感官评分最高。这可能由于发酵温度过低不利于乳酸菌生长，使发酵速度变慢，所产生的代谢产物不足，sod活力下降且发酵乳组织状态形成缓慢。根据酶促反应动力学，温度升高，反应速度加快，呼吸强度增高，导致微生物繁殖代谢加快。但温度升高的同时会导致酶失活速度增大，缩短发酵周期，乳酸菌菌体提前衰老而自溶，影响其代谢产物酶的活性且发酵乳无乳香味，品质下降。
97.实施例12发酵时间对发酵乳sod活力及感官评分的影响
98.设定藜麦添加量为30％、接菌量为3％、发酵温度为38℃，发酵时间依次取6h、8h、10h、12h、14h，4℃静置2h停止发酵，发酵结束测定sod活力及感官评分，结果见图9。
99.由图9可知，随发酵时间的增加，发酵乳sod活力和感官评分均呈现先升高后下降的趋势。发酵时间为8h，发酵乳sod活力和感官评分最高，此时发酵乳气味醇正，略带藜麦香气，口感酸甜合适。这是因为当发酵时间过短，乳酸菌生长繁殖不充分，代谢产物积累不足，酶活性低。时间过久，乳酸菌生长繁殖所需的营养物质不足，其生长提前进入衰亡期，菌体死亡数增加，发酵乳中代谢废物逐渐积累，致使sod活力迅速下降，且发酵产酸量过高，导致发酵乳酸甜比失衡，严重影响其风味，组织出现絮块状，口感品质降低。
100.本发明的感官评分是取10位专业感官评价员的平均分作为感官评分，评分标准如表1所示：
101.表1感官评分准则
[0102][0103][0104]
实施例13dpph自由基清除率测定
[0105]
取稀释成不同浓度的发酵乳2ml与2ml 0.02mg/ml dpph
‑
乙醇溶液混匀，避光
30min，将样品在5000r/min条件下离心10min，517nm处测定样品吸光度值，计算公式如下：
[0106][0107]
a1—有样品时dpph溶液的吸光度；
[0108]
a2—样品和无水乙醇混合时的吸光度；
[0109]
a0—无样品时dpph溶液的吸光度。
[0110]
不同浓度发酵乳dpph自由基清除率变化见图10，本发明无蔗糖藜麦发酵乳的dpph清除率显著高于普通发酵乳，其dpph清除率最高分别为86.23
±
2.35％、76.81
±
3.12％，添加藜麦浆的发酵乳dpph清除率提高了近10％，这说明无蔗糖藜麦发酵乳中的藜麦发挥重要抗氧化作用，这是由于藜麦中富含多糖、多酚等活性物质，vollmannov
á
研究证明荞麦、苋菜、藜麦中酚类物质和芦丁含量会直接影响其抗氧化能力，且自由酚和结合酚占比越大，对dpph清除能力越强。藜麦经乳酸菌发酵后槲皮素和香草酸等多酚化合物含量升高与乳酸菌自身抗氧化性产生协同作用，进一步提高发酵乳的dpph自由基清除能力。
[0111]
实施例14abts

自由基清除率测定
[0112]
参考郑金熊等人的方法，进行abts溶液的制备。取稀释成不同浓度的发酵乳0.5ml，加入3.5ml abts溶液，避光暗反应6min，测定样品吸光度值(734nm)，计算公式如下：
[0113][0114]
a0—0.5ml蒸馏水和3.5ml abts溶液混合时吸光度；
[0115]
a1—0.5ml样品和3.5ml abts溶液混合时吸光度；
[0116]
a2—0.5ml样品和3.5ml无水乙醇混合时吸光度。
[0117]
不同浓度发酵乳abts

自由基清除率变化见图11，可见，无蔗糖藜麦发酵乳的abts

清除率明显高于普通发酵乳，且发酵乳对abts

的清除能力随着浓度的升高而增强，无蔗糖藜麦发酵乳和普通发酵乳最终abts

清除率分别为71.32
±
2.32％、52.96
±
1.95％，添加藜麦浆的发酵乳abts

清除率提高了近20％，说明添加藜麦浆能显著提高发酵乳对abts

的清除能力。
[0118]
实施例15羟(
·
oh)自由基清除率的测定
[0119]
使用羟自由基测试试剂盒测定发酵乳羟基自由基清除率，不同浓度发酵乳羟基自由基清除率变化如图12所示，无蔗糖藜麦发酵乳的羟基自由基清除率明显高于普通发酵乳，随着发酵乳浓度的升高，无蔗糖藜麦发酵乳和普通发酵乳体外抑制羟基自由基能力均稳步上升，最终两者羟基自由基清除率分别为48.19
±
2.69％、63.27
±
2.01％，添加藜麦浆的发酵乳羟基自由基清除率提高了近15％，说明添加藜麦浆能显著提高发酵乳对羟基自由基清除能力。
[0120]
实施例16fe
3
还原力测定
[0121]
参考杨淑妮的方法制备frap试剂。1ml发酵乳样品与5ml frap试剂混合，37℃静置10min，于593nm处测定吸光度值，通过标准溶液的线性回归方程y＝0.0009x 0.0767(r2＝0.9914)计算样品fe
3
还原能力(mmol/l)。不同浓度发酵乳fe
3
还原能力变化见图13。还原
三价铁能力能够评价物质的总抗氧化能力，还原力强的物质含有丰富的电子供体，因此fe
3
还原能力可作为检测样品中是否含有电子供体最有效的方法，若含有电子供体则可将fe
3
还原成fe
2
，使溶液颜色发生变化。由图13可知，无蔗糖藜麦发酵乳的fe
3
还原能力明显高于普通发酵乳，并随着发酵乳浓度的不断升高，两款发酵乳的体外fe
3
还原能力均稳步上升，最终当浓度达到100％时，两者fe
3
还原能力分别为0.48
±
0.02mmol/l、0.29
±
0.03mmol/l，证明添加藜麦浆能显著提高发酵乳对fe
3
还原能力。有研究表明，fe
3
还原能力与物质中游离酚含量有关，发酵能促进藜麦中结合酞成分释放，因此发酵后的藜麦使发酵乳具有较高fe
3
还原能力。
[0122]
实施例17α
‑
葡萄糖苷酶抑制率
[0123]
采用葡萄糖氧化酶法进行测定。取样品溶液50μl，加入100μl浓度为0.1mol/l的pbs缓冲液(ph＝6.8)，加入100μl浓度为20mmol/l的pnpg溶液，混合均匀，37℃水浴20min，再加入60μl浓度为20u/ml的α
‑
葡萄糖苷酶溶液，继续水浴10min后，加入100μl浓度为1mol/l na2co3作为反应终止液，将终止液于405nm处测定其吸光值，其中以0.1mol/l的pbs溶液(ph＝6.8)作为α
‑
葡萄糖苷酶溶液及待测样品的空白对照，计算α
‑
葡萄糖苷酶抑制率，计算公式如下：
[0124][0125]
a—不含待测样品但含有α
‑
葡萄糖苷酶溶液；
[0126]
b—不含有待测样品和α
‑
葡萄糖苷酶溶液；
[0127]
c—含有待测样品和α
‑
葡萄糖苷酶溶液；
[0128]
d—含有待测溶液但不含有α
‑
葡萄糖苷酶溶液。
[0129]
不同浓度发酵乳α
‑
葡萄糖苷酶抑制率变化见图14，由图14可知，发酵乳的α
‑
葡萄糖苷酶抑制率与其浓度呈现正相关，且无蔗糖藜麦发酵乳的α
‑
葡萄糖苷酶抑制率明显高于普通发酵乳，发酵乳浓度在20％
‑
60％时，抑制率迅速上升，在60％
‑
100％范围内抑制率已基本稳定，最终两者抑制率分别为46.33％，27.79％，添加了藜麦浆的发酵乳α
‑
葡萄糖苷酶抑制率提高了近20％，较普通发酵乳而言，无蔗糖藜麦发酵乳具有较强抑制α
‑
葡萄糖苷酶活性的能力。
[0130]
实施例18α
‑
淀粉酶抑制率
[0131]
参考文献的方法，取2ml待测样品溶液，加入2ml浓度为2mg/ml的α
‑
淀粉酶溶液(用ph值＝7.0的磷酸缓冲液配制)，37℃下反应20min，加入2ml的可溶性淀粉(质量分数1％)，37℃下水浴反应15min，加碘液显色，于660nm处测定其吸光值，计算α
‑
淀粉酶抑制率，计算公式如下：
[0132][0133]
a—不含有待测样品和α
‑
淀粉酶溶液；
[0134]
b—不含有待测样品但含有α
‑
淀粉酶溶液；
[0135]
c—含有待测样品但不含有α
‑
淀粉酶溶液；
[0136]
d—含有待测样品和α
‑
淀粉酶溶液。
[0137]
不同浓度发酵乳α
‑
淀粉酶抑制率变化见图15，发酵乳的α
‑
淀粉酶抑制率与其浓度呈现依赖性关系，且无蔗糖藜麦发酵乳的α
‑
淀粉酶抑制率亦明显高于普通发酵乳，最终两者α
‑
淀粉酶抑制率分别为56.50％和31.29％，添加了藜麦浆的发酵乳α
‑
淀粉酶抑制率提高了近25％，表明较普通发酵乳而言，无蔗糖藜麦发酵乳具有较强抑制α
‑
淀粉酶活性的能力。
[0138]
实施例19无蔗糖藜麦发酵乳基本营养成分
[0139]
上述发酵乳基本营养成分测定结果见表2，由表2可知，无蔗糖藜麦发酵乳中蛋白质、脂肪、非脂乳固体、能量均略低于普通发酵乳，这是因为普通发酵乳原料用的是全脂奶粉，无蔗糖藜麦发酵乳的原料中加入藜麦浆液代替了部分脱脂乳，同时利用木糖醇替代蔗糖，所以导致无蔗糖藜麦发酵乳中蛋白质、脂肪、非脂乳固体含量及能量略低，本发明无蔗糖藜麦发酵乳的基本营养成分均符合相关国标要求，且无蔗糖藜麦发酵乳更满足减肥人群的膳食需求。
[0140]
表2发酵乳基本营养成分测定结果
[0141][0142]
实施例20无蔗糖藜麦发酵乳和普通发酵乳的ph、酸度、粘度、持水率对比
[0143]
表3发酵乳物化指标测定结果
[0144][0145]
由表3可看出，无蔗糖藜麦发酵乳的酸度低于普通发酵乳，而ph则相反，这是由于无蔗糖藜麦发酵乳中添加了藜麦浆，导致复原乳在原料中占比低，其乳糖含量总体减少，而乳酸菌发酵机理就是乳酸菌利用原料中的乳糖产生乳酸，因此最终产品酸度下降，ph上升；黏度形成原理是乳酸菌发酵原料中的糖类产生胞外多糖，其中就包含了具有粘附性的荚膜多糖和粘液多糖，持水力的形成是由于脂肪经均质破裂成微小脂肪球，均匀分布于发酵底物，导致与蛋白质吸附表面积增加，使酪蛋白结构变化发生凝胶网络的聚集，无蔗糖藜麦发酵乳中以脱脂乳粉为底物、木糖醇替代蔗糖，使其中糖类物质和脂肪含量均低于普通发酵乳，因此导致产品黏度和持水力降低，同时蛋白质含量的减少也会使发酵乳的黏度和持水力的下降，而藜麦属于高蛋白杂粮，因此以脱脂奶粉为底物的无蔗糖藜麦发酵乳的黏度和持水力略低于普通发酵乳。
[0146]
实施例20色泽测定
[0147]
利用色差仪测定发酵乳的色泽，30s后读取并记录数据，发酵乳色泽测定结果见表
4。
[0148]
表4发酵乳色泽测定结果
[0149][0150]
l*值为明度参数，此值越大说明样品越白亮，a*值和b*值为彩色参数，a*值为绿红色， a*值越大代表被测样品颜色越红，
‑
a*值越大代表被测样品颜色越绿。b*值为黄蓝色， b*值越大代表被测样品颜色越黄，
‑
b*值越大代表被测样品颜色越蓝。无蔗糖藜麦发酵乳的l*值低于普通发酵乳，而a*值和b*值则相反，这可能是添加红色藜麦浆或者原料中还原糖降解产物以及多酚复合物，增加了其彩色值，降低了其明亮度。
[0151]
实施例21发酵乳微生物测定
[0152]
对无蔗糖藜麦发酵乳进行微生物指标测定，如表5所示，无蔗糖藜麦发酵乳的乳酸菌数高于普通发酵乳，且未检出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌，卫生指标合格，符合国家标准要求。
[0153]
表5微生物指标测定结果
[0154][0155][0156]
结果显示，本发明制得的无蔗糖藜麦发酵乳dpph自由基清除率、abts

自由基清除率、羟基自由基清除率、fe
3
还原能力、α
‑
葡萄糖苷酶抑制率、α
‑
淀粉酶抑制率均高于普通发酵乳，说明本发明无蔗糖藜麦发酵乳有较好抗氧化能力和抑制相关消化酶的能力，具有良好体外辅助降血糖功能。
[0157]
实施例22
[0158]
本发明在实施例1的基础上，进一步对藜麦进行了处理，具体操作为：
[0159]
(1)藜麦浆制备：挑选籽粒饱满、颜色均匀的红藜麦，反复清洗2遍，然后在150℃条件下烘烤20min，将藜麦冷却至室温，然后在20g/l的碳酸钠水溶液中浸泡0.5min，之后置于5g/l的l
‑
半胱氨酸盐酸盐溶液中浸泡20s，用清水冲洗干净后，按1:5(g/ml)料水比进行打浆至充分磨匀，过200目筛得藜麦浆，于4℃冰箱保存备用。
[0160]
(2)复原乳制备：将脱脂乳粉25g加入180ml 70℃蒸馏水，混合均匀。
[0161]
(3)均质：将30％藜麦浆和5％木糖醇加入复原乳中，预热至70℃，混合均匀，于
20mpa条件下均质10min。
[0162]
(4)灭菌：采用高压灭菌法于95℃下，灭菌10min。
[0163]
(5)将灭菌后的混合物冷却，然后接种3％复合发酵剂(lp：la质量比2:1)，在38℃下发酵8h，即得藜麦发酵乳。
[0164]
将藜麦依次利用碳酸钠水溶液和l
‑
半胱氨酸盐酸盐溶液浸泡后，制得的藜麦发酵乳的基本营养成分、色泽与实施例1相当，未见明显变化，微生物指标测定结果同样符合标准要求。
[0165]
本实施例制得到的藜麦发酵乳抗氧化能力和抑制相关消化酶的能力得到提升，其sod活力为258.62u/ml；dpph自由基清除率为86.23％、abts

自由基清除率为71.32％、羟基自由基清除率为48.19％、fe
3
还原能力为0.48mmol/l、α
‑
葡萄糖苷酶抑制率为46.33％、α
‑
淀粉酶抑制率为56.50％。
[0166]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。