采用阴离子交换色谱法的生物分子(如质粒DNA)纯化工艺的制作方法

技术特征：
1.一种从混合物中分离或纯化相关生物分子的方法，所述方法包括以下步骤：在包含一定浓度盐的溶液中使混合物接触阴离子交换材料，所述一定浓度的盐可使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上；可选地，其中，可使生物分子选择性结合到阴离子交换材料上的所述一定浓度的盐是一种亲液盐；以及使用一种洗脱剂对相关生物分子进行洗脱，所述洗脱剂包含一定浓度的盐，使洗脱液中含有纯化生物分子；可选地，其中，可使洗脱液中含有纯化生物分子的所述一定浓度的盐是一种离液盐；进一步可选地，其中，(i)收集含有洗脱液中所述生物分子的部分和/或(ii)从任何一个或所有收集部分中分离所述相关生物分子和/或(iii)在不使用任何有机溶剂、洗涤剂、乙二醇、六氨合钴、亚精胺、聚乙烯吡咯烷酮的情况下执行所述方法。2.根据权利要求1所述的方法，其中，待纯化的生物分子是一种核酸；可选地，其中，所述核酸为质粒dna(pdna)，进一步可选地，其中，(i)所述质粒dna为超螺旋dna(sc pdna)；和/或(i)所述质粒dna包括哺乳动物dna、细菌dna、非编码dna或病毒dna；可选地，其中，所述质粒dna包括能够表达相关多肽的dna；和/或(iii)所述混合物包含超螺旋质粒dna、开环质粒dna、线状质粒dna、基因组dna、rna、脂多糖、内毒素、蛋白或其任何组合。3.根据权利要求2所述的方法，其中，纯化和/或分离质粒dna的纯度至少为90％、95％或98％。4.根据权利要求1
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3中任何一项所述的方法，其中，(i)使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上的盐浓度约大于0.5m，可选地，其中，使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上的盐浓度约为0.8m
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4.0m；和/或(ii)使洗脱液中含有纯化生物分子的盐浓度约为0.25m
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4.0m；和/或(iii)洗脱步骤包括通过改变洗脱剂中离液盐的浓度来进行梯度洗脱；可选地，其中，提高洗脱剂中离液盐的浓度。5.根据权利要求2
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4所述的方法，其中，生物分子为质粒dna，洗脱步骤包括分离超螺旋质粒dna与其他质粒dna形态(如线状质粒dna、开环质粒dna)以及(可选地)其他核酸分子。6.根据权利要求1
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5所述的方法，其中，(i)从以下一组盐中选择亲液盐：硫酸铵、柠檬酸铵、磷酸铵、磷酸钾、柠檬酸钠、磷酸钠及其混合物；可选地，其中，亲液盐为硫酸铵；进一步可选地，其中，硫酸铵的浓度约为0.5m
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2.0m；和/或(ii)从以下一组盐中选择离液盐：氯化铵、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硝酸镁、盐酸胍及其混合物；可选地，其中，离液盐为硫酸镁；进一步可选地，其中，硫酸镁的浓度约为0.5m
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1.0m；和/或(iii)含有亲液盐的溶液的ph约为5.0
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10.0、5.0
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8.0、6.0
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8.0或ph7。
7.根据权利要求1
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6所述的方法，其中，从以下材料中选择阴离子交换材料：阴离子交换膜、离子交换树脂、三维微孔水凝胶结构、一层超多孔珠、大孔珠、整块材料、琼脂糖珠、交联琼脂糖、硅珠、大孔凝胶、甲基丙烯酸酯基珠、聚苯乙烯基珠、纤维素基珠、葡聚糖基珠、双丙烯酰胺基珠、聚乙烯醚基珠、陶瓷基珠或聚合物基珠；可选地，其中，阴离子交换材料为(i)阴离子交换膜；可选地，其中，阴离子交换膜的平均孔径约为3.0μm
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5.0μm；优选地，其中，平均孔径约为3.0μm；或(ii)离子交换树脂，可选地，其中，离子交换树脂的平均粒径约为30μm
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300μm。8.根据权利要求1
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7中任何一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括在包含一定浓度盐的溶液中使混合物接触阴离子交换材料(所述一定浓度的盐可使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料上)前，从含有相关生物分子的混合物中分离固体组分，可选地，其中，通过过滤或相分离实现固体组分的所述去除目的。9.根据权利要求8所述的方法，其中，通过两相分离去除固体组分，可选地，其中，(i)加入缓冲液，使混合物的密度提高至约1.1kg/l以上，可选地，其中，缓冲液含有亲液盐，优选地，其中，亲液盐为硫酸铵；和/或(ii)密度高于顶相的两相混合物的低相应进行深层过滤。10.根据权利要求1
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9所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：(i)从洗脱液中沉淀生物分子；和/或(ii)通过切向流过滤来过滤洗脱液来分离生物分子；可选地，其中，切向流过滤步骤中所用过滤膜的平均孔径≤0.2μm；和/或(iii)将相关纯化生物分子冻干，可选地，其中，在存在碳水化合物的情况下进行冻干；和/或(iv)在包含一定浓度盐的溶液中使混合物接触阴离子交换材料(所述一定浓度的盐可使相关生物分子选择性结合到阴离子交换材料)后收集流穿液；可选地，其中，所述流穿液包含rna、基因组dna、蛋白质、细胞碎片或其组合，优选地，其中，所述流穿液包含rna；和/或(v)在相关生物分子洗脱前使用洗涤缓冲液洗涤阴离子交换材料；可选地，其中，所述洗涤缓冲液含有浓度低于相关生物分子洗脱所需浓度的离液盐，其中，从以下一组盐中优选离液盐：氯化铵、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硝酸镁及其混合物。11.根据权利要求1
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10中任何一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括洗脱和可选地分离生物分子后的进一步纯化步骤；可选地，其中，第二个纯化步骤包括使用嗜硫芳烃吸附色谱介质，其选择性可使超螺旋质粒dna与开环和/或线状dna分离。12.根据权利要求1
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11中任何一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：(i)使用核酸表达相关多肽；优选地，其中，所述核酸为质粒dna；或(ii)使用核酸生产并收获相关多肽；优选地，其中，所述核酸为质粒dna；可选地，其中，所述方法进一步包括将相关多肽配制成药物组合物。13.根据权利要求1
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12中任何一项所述的方法，其中，所述方法包括细胞收获和洗涤、细胞裂解、中和以及在使含有相关生物分子的所获混合物接触阴离子交换材料前的絮凝去
除步骤。14.根据权利要求1
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13中任何一项所述的方法，其中，所述方法不包括用于去除rna的cacl2沉淀步骤。15.将郁金香形容器用于权利要求8或权利要求9的所述方法。

技术总结
本发明提供了一种新的用于纯化或分离相关生物分子(如质粒DNA(pDNA))的改进方法，其中涉及阴离子交换(AEX)色谱法步骤。所述方法可简单有效地去除RNA、基因组DNA、蛋白质、细胞碎片或其组合等杂质。本发明的新方法特别适用于大规模生产工厂，可提供优质、高收率的纯化生物分子(如pDNA)，同时还可缩短加工时间、降低成本。低成本。低成本。


技术研发人员：安德里亚斯
受保护的技术使用者：隆萨有限公司
技术研发日：2020.02.28
技术公布日：2021/10/19