中胚层杀伤（MK）细胞的制作方法

中胚层杀伤(mk)细胞
技术领域
1.本发明涉及中胚层杀伤(mk)细胞及其在治疗方法中的用途，特别是用于治疗癌症。


背景技术：

2.中胚层细胞来源于许多组织，并且作为其它细胞类型的支持结构。例如，骨髓由造血细胞和间充质细胞组成。先前已经描述和表征了两种主要的间充质细胞类型，即在骨髓中发现的(i)间充质干细胞(msc)及其前体和(ii)间充质前体细胞(mpc)。间充质干细胞(msc)是多能的成体干细胞。msc分化形成骨骼组织中发现的不同特化细胞。例如，它们可以分化为软骨细胞(软骨细胞体)、骨细胞(成骨细胞)和脂细胞(脂肪细胞)。
3.msc已经用于多种治疗方法，如治疗年龄相关性黄斑变性(age
‑
related macular degeneration，amd)和心肌梗塞。一旦施用于受试者，msc通常会迁移(或归巢)至受损组织，并通过旁分泌信号传导以及促进受损组织中邻近细胞的存活、修复和再生而发挥其治疗效果。
4.有证据表明，msc可能具有某些免疫抑制性质和免疫增强性质。因此，msc可用于操纵免疫应答，从而治疗疾病。然而，目前的治疗方法通常涉及msc亚型的混合物的输注，其中大多数msc亚型不具备所需的免疫调节性质。这需要使用高细胞剂量，其可能导致脱靶副作用和体积相关的副作用。此外，msc通常从骨髓中获得，因此难以获得此方法所需的大量细胞。
5.申请人还公开了其它中胚层祖细胞，即中胚层谱系的祖细胞(pml)、免疫调节祖(imp)细胞和免疫肿瘤学中胚层祖(iomp)细胞。pml在pct/gb2012/051600(公布为wo 2013/005053)中公开。imp细胞在pct/gb2015/051673(公布为wo 2015/189587)中公开。iomp细胞在pct/gb2016/052447(公布为wo 2017 025729)中公开。


技术实现要素：

6.本发明涉及一种先前尚未鉴定或分离的新的细胞类型——中胚层杀伤(mk)细胞。这种mk细胞在其组成、功能和特性方面与msc、mpc、pml、imp细胞和iomp细胞截然不同，其赋予增强的细胞毒性和调节自然杀伤(mk)细胞的能力。mk细胞能够直接杀死癌细胞，即癌细胞的细胞毒性。mk细胞能够引发/激活nk细胞(即增加nk细胞的增殖和/或细胞毒活性)。mk优选能够将免疫细胞吸引至炎症位点。mk细胞以nk细胞命名，因为它显示出类似的自然杀伤特性，但它是由中胚层细胞工程化而来的组织，如骨髓。这种mk细胞在组成、功能和特性方面与nk细胞截然不同。
7.令人惊奇地，发明人已鉴定了具有特异性标记物表达模式的新的中胚层杀伤(mk)细胞。特别地，所述mk细胞表达cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277。所述mk细胞可以表达cd16和cd96。所述mk细胞不表达cd34和cd45。所述mk细胞可以不表达cd56。
8.本发明所述mk细胞可以从单核细胞(mnc)中分离，如骨髓mnc或外周血mnc。所述mk
细胞能够在体外和体内增加nk细胞的细胞毒活性。mk细胞本身能够在体外和体内杀死癌细胞。这显示在实施例中。
9.因此，本发明提供了一种中胚层杀伤(mk)细胞，其中，所述细胞表达可检测水平的cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277，并且其中，所述细胞不表达可检测水平的cd34和cd45。
10.本发明还提供了一种中胚层杀伤(mk)细胞，其中，所述细胞表达可检测水平的cd16、cd96、cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277，并且其中，所述细胞不表达可检测水平的cd34、cd45和cd56。
11.本发明还提供：
12.‑
两种或更多种本发明所述的mk细胞的群体；
13.‑
本发明所述的mk细胞的群体，其中，所述群体中超过约15％的细胞表达可检测水平的cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277，并且其中，所述群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34和cd45；
14.‑
本发明所述的mk细胞的群体，其中，所述群体中超过约15％的细胞表达可检测水平的cd16、cd96、cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277，并且其中，所述群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34、cd45和cd56；
15.‑
mk细胞的群体，其中
16.(i)所述群体中至少约20％的细胞表达可检测水平的cd112，
17.(ii)所述群体中至少约80％的细胞表达可检测水平的cd137l，
18.(iii)所述群体中至少约20％的细胞表达可检测水平的cd178，
19.(iv)所述群体中至少约50％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
20.(v)所述群体中至少约50％的细胞表达可检测水平的cd277，
21.并且其中
22.(a)所述群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，并且
23.(b)所述群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd45。
24.‑
mk细胞的群体，其中
25.(i)所述群体中至少约15％的细胞表达可检测水平的cd16，
26.(ii)所述群体中至少约50％的细胞表达可检测水平的cd96，
27.(iii)所述群体中至少约20％的细胞表达可检测水平的cd112，
28.(iv)所述群体中至少约80％的细胞表达可检测水平的cd137l，
29.(v)所述群体中至少约20％的细胞表达可检测水平的cd178，
30.(vi)所述群体中至少约50％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
31.(vii)所述群体中至少约50％的细胞表达可检测水平的cd277，
32.并且其中
33.(a)所述群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，
34.(b)所述群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd45，并且
35.(c)所述群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd56。
36.‑
一种药物组合物，包含：(a)本发明所述mk细胞的群体和(b)药学上可接受的载体或稀释剂；
37.‑
一种生成本发明所述mk细胞的群体的方法，包括：(a)在诱导单核细胞(mnc)分化为免疫调节祖(imp)细胞的条件下培养mnc，(b)在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养imp细胞；
38.‑
一种生成本发明所述mk细胞的群体的方法，包括：在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养imp细胞；
39.‑
一种引发nk细胞的群体的体外方法，包括：在增加nk细胞的活性的条件下，将所述nk细胞的群体与本发明所述的mk细胞的群体一起孵育；
40.‑
一种使用本发明所述方法生成的引发的nk细胞的群体；
41.‑
一种药物组合物，包含：(a)本发明所述的引发的nk细胞的群体和(c)药学上可接受的载体或稀释剂；
42.‑
一种引发nk细胞的群体的体内方法，包括：在增加受试者的nk细胞的活性的条件下向受试者施用本发明所述的mk细胞的群体或本发明所述的药物组合物；以及
43.‑
一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：向受试者施用(a)本发明所述的mk细胞的群体，(b)本发明所述的引发的nk细胞的群体，(c)本发明所述的mk细胞的群体和nk细胞的群体，或(d)本发明所述的药物组合物。
附图说明
44.图1示出与imp002和imp004相比，mk002和mk004显示出对k562(慢性骨髓性白血病)和rpmi
‑
8226(浆细胞骨髓瘤)的显著增加的细胞毒性(n＝3；t检验)。
45.图2示出用mk002和mk004孵育显著增加nk细胞对k562(慢性骨髓性白血病)和rpmi
‑
8226(浆细胞骨髓瘤)的细胞毒性(n＝3；t检验)。mk002＝用mk002引发的nk细胞系。mk004＝用mk004引发的nk细胞系。
46.图3示出了用mk004孵育显著增加原代nk细胞对rpmi
‑
8226(浆细胞骨髓瘤)和u266(浆细胞骨髓瘤)的细胞毒性(n＝3；t检验)。mk004＝用mk004引发的原代nk细胞。
47.图4示出了培养中的本发明的mk细胞(mk002)。
48.图5示出了由本发明的mk细胞在未处理和用ifn
‑
γ(非配对t检验不显著)或tnf
‑
α(非配对t检验)处理时分泌的groa的量。每个柱表示来自5个批次的数据(平均值
±
sem；n＝1)。
49.图6示出由本发明的mk细胞在未处理和用ifn
‑
γ或tnf
‑
α处理时分泌的il
‑
12的量(非配对t检验不显著)。每个柱表示来自5个批次的数据(平均值
±
sem；n＝1)。
50.图7示出由本发明的mk细胞在未处理和用ifn
‑
γ(非配对t检验)或tnf
‑
α(非配对t检验不显著)处理时分泌的il
‑
2ra的量。每个柱表示来自5个批次的数据(平均值
±
sem；n＝1)。
51.图8示出由本发明的mk细胞在未处理和用ifn
‑
γ或tnf
‑
α(非配对t检验)处理时分泌的il
‑
8的量。每个柱表示来自4个批次的数据(mkpc的数据未包括在内，因为它与标准曲线不相关；平均值
±
sem；n＝1)。
52.图9示出由本发明的mk细胞在未处理和用ifn
‑
γ或tnf
‑
α(非配对t检验不显著)处
理时分泌的可溶性trail的量。每个柱表示来自5个批次的数据(平均值
±
sem；n＝1)。
53.图10示出由本发明的mk细胞在未处理和用ifn
‑
γ或tnf
‑
α(非配对t检验不显著)处理时分泌的il
‑
6的量。每个柱表示来自所有5个批次的数据(平均值
±
sem；n＝1)。
54.图11示出(a)对照小鼠，(b)用未处理的本发明的mk细胞处理的小鼠，(c)用ifn
‑
γ处理的本发明的mk细胞处理的小鼠或(d)用tnf
‑
α处理的本发明的mk细胞处理的小鼠的气囊中存在的nk细胞的百分比(mk006；平均值
±
sem；n＝5；非配对t检验)。
55.图12示出(a)对照小鼠，(b)用未处理的本发明的mk细胞处理的小鼠，(c)用ifn
‑
γ处理的本发明的mk细胞处理的小鼠或(d)用tnf
‑
α处理的本发明的mk细胞处理的小鼠的气囊中存在的单核细胞的百分比(mk006；平均值
±
sem；n＝5；非配对t检验)。
56.图13示出用mk002和mk004孵育显著增加原代nk细胞对k562(慢性骨髓性白血病)的细胞毒性(平均值
±
sem；n＝3；非配对t检验)。
57.图14示出测试的所有批次的mk细胞均显示出对mcf7的细胞毒性(平均值
±
sem；n＝2)。
58.图15示出与单培养(mc)相比，通过与rpmi
‑
8226共培养(cc)6小时、12小时或24小时后mk004表达的gzmb mrna的量的倍数变化(平均值
±
sd；对于mc和cc在每个时间点n＝2；非配对t检验)。
59.图16示出与单培养(mc)相比，通过与rpmi
‑
8226共培养(cc)6小时、12小时或24小时后mk004表达的gzmh mrna的量的倍数变化(平均值
±
sd；对于mc和cc在每个时间点n＝2；非配对t检验)。
60.图17示出与单培养(mc)相比，通过与rpmi
‑
8226共培养(cc)6小时、12小时或24小时后mk004表达的gzmm mrna的量的倍数变化(平均值
±
sd；对于mc和cc在每个时间点n＝2；非配对t检验)。
61.图18示出与单培养(mc)相比，通过与rpmi
‑
8226共培养(cc)6小时、12小时或24小时后mk004表达的gzma mrna的量的倍数变化(平均值
±
sd；对于mc和cc在每个时间点n＝2；非配对t检验)。
62.图19示出与单培养(mc)相比，通过与rpmi
‑
8226共培养(cc)6小时、12小时或24小时后mk004表达的gzmk mrna的量的倍数变化(平均值
±
sd；对于mc和cc在每个时间点n＝2；非配对t检验)。
63.图20示出与单培养(mc)相比，通过与rpmi
‑
8226共培养(cc)6小时、12小时或24小时后mk004表达的穿孔素mrna的量的倍数变化(平均值
±
sd；对于mc和cc在每个时间点n＝2；非配对t检验)。
64.图21示出在未处理(a)或用0.5mm egta(b)、1.0mm egta(c)或2.0mm(d)处理24小时的情况下，mk002、mk004和mk006对mcf7的细胞毒性(e:t＝5.1；24小时)(平均值
±
sem；n＝3；非配对t检验)。
65.图22示出在未处理(a)或用乱序/非靶向(nt)sirna(a)、针对cd178/fasl的特异性sirna(b)或针对cd253/trail的特异性sirna(d)处理48小时的情况下，mk004和mk006对mcf7的细胞毒性(e:t＝5.1；24小时)(平均值
±
sem；n＝3；非配对t检验)。
chem.2017年7月7日；292(27):11413
‑
11422)。该标记物的表达也将mk细胞与msc区分开来。该标记物的表达可以通过用ifn
‑
γ处理/刺激来增加。
79.cd137l(也称为4
‑
1bb l)参与nk细胞引发/激活(zhang等j immunother.2011年3月；34(2):187
–
195.)。
80.cd178(也称为fasl和cd95l)参与nk细胞的细胞毒性(zamai等j exp med.1998年12月21日；188(12):2375
–
2380)。该标记物的表达也将mk细胞与msc区分开来。该标记物的表达可以通过用ifn
‑
γ和/或肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)处理/刺激来增加。
81.cd253(也称为trail和tnfsf10)参与nk细胞的细胞毒性(zamai等j exp med.1998年12月21日；188(12):2375
–
2380)。该标记物的表达也将mk细胞与iomp细胞区分开来。
82.实施例15中的结果表明，cd253形成本发明的mk细胞为细胞毒性的机制的一部分。
83.cd277(也称为bt3.1和嗜乳脂蛋白sf3 a1)调节免疫细胞功能(messal等eur j immunol.2011年12月；41(12):3443
‑
54)。该标记物的表达也将mk细胞从iomp细胞、imp和msc中区分开来。
84.cd34(也称为hpca1)为一种关键的mnc标记物。该标记物的表达的缺失将mk细胞与mnc区分开来。
85.cd45(也称为lca)为一种关键的mnc标记物。该标记物的表达的缺失也将mk细胞从mnc和nk细胞中区分开来。
86.cd56(也称为ncam)为一种关键的nk细胞标记物(zamai等j exp med.1998年12月21日；188(12):2375
–
2380)。该标记物的表达的缺失将mk细胞与nk细胞区分开来。
87.本发明的mk细胞具有许多优点。这里将总结关键的优点。然而，进一步的优势根据下面的论述将成为显而易见的。
88.本发明的mk细胞可以有利地用于治疗受试者的疾病。例如，mk细胞可以用于治疗受试者的癌症。
89.本发明的mk细胞可以通过它们的直接作用来治疗疾病。例如，mk细胞可以通过接触依赖性细胞裂解杀死癌细胞。优选地，mk细胞通过接触依赖性细胞裂解杀死肿瘤细胞。mk细胞还可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)诱导癌细胞死亡。
90.本发明的mk细胞可以调节免疫应答。换言之，mk细胞可以具有免疫调节效果。例如，mk可以在体外或体内增加nk细胞的活性(特别是细胞毒性)。例如，mk细胞可以用于在体外生成引发的或活化的nk细胞的群体。引发的或活化的nk细胞可以用于治疗受试者的疾病，如癌症。引发的或活化的nk细胞可以单独地或与mk细胞联合施用给受试者。mk细胞还可以引发或激活受试者的内源性nk细胞。
91.本发明的mk细胞的一个关键优点在于它们是中胚层细胞，它们通常在体内是安全的。有充分的证据表明以与本发明的mk细胞相似(但不同)的方式生成的imp细胞(同种异体中胚层细胞)在人类受试者中是安全的(anastasiadis等j cardiovasc transl res.2016年6月；9(3):202
‑
13)。mk细胞为细胞毒性的，但预计不会诱导其它细胞毒性细胞疗法的任何副作用，如嵌合抗原受体
‑
t(car
‑
t)细胞。特别地，mk细胞预计不会诱导细胞因子释放综合征(crs；也称为细胞因子风暴)、巨噬细胞活化综合征(mas)和脱靶效应。
92.如下文更详细讨论的，mk细胞由取自个体(如人类个体)的单核细胞(mnc)生成，如骨髓mnc。由于mk细胞是由mnc生成的，它们可以容易地生成(如从骨髓中)并且对于待治疗
的受试者可以是自体的，从而避免受试者引起的免疫排斥的风险。
93.原则上，可以从单个个体中生成无限数量的mk细胞，这是因为可以得到各种mnc样本(即各种骨髓样本)。从单个个体中生成大量的mk细胞当然是可能的。因此可以大量制备本发明的mk细胞。
94.本发明的mk细胞在临床相关条件下生成，例如，在没有痕量内毒素和其它环境污染物以及动物制品(如胎牛血清)的情况下。这使得本发明的mk细胞特别适合施用于受试者。
95.在任何其它疗法，例如化学疗法或放射疗法开始之前，可以从取自受试者的单个样本生成本发明的大量mk细胞的群体。因此，本发明的mk细胞能够避免这些治疗的任何不利作用。
96.本发明的mk细胞能够快速制备。mk细胞能够在少于34天，如在约33天、约32天、约31天、约30天、约29天、约28天、约27天、约26天或约25天内由mnc生成。mk细胞也能够被冷冻和细胞储存且在使用时进行解冻。
97.由mnc生成mk细胞避免了使用源自人类胚胎干细胞(hesc)的间充质干细胞msc所涉及的道德和伦理影响。
98.本发明的mk细胞通常由人类mnc生成。因此，本发明的mk细胞通常为人类的。上文和下文讨论的标记物通常为人类标记物。可替代地，可以由来自其它动物或哺乳动物的mnc生成mk细胞，如来自商业养殖的动物，如马、牛、羊或猪，来自实验室动物，如小鼠或大鼠，或来自宠物，如猫、狗、兔或豚鼠。
99.可以使用本领域已知的标准方法，包括谱系限制标记物的表达、结构和功能特征，将本发明的mk细胞鉴定为中胚层杀伤细胞。mk细胞将表达可检测水平的已知为mk细胞特征的细胞表面标记物。这些将在下文中讨论。
100.本发明的mk细胞不是干细胞。特别地，它们不是msc。它们是祖细胞，因为它们在体外复制/自我更新。虽然它们能够在适当的体外条件下被迫分化，如分化为软骨细胞或骨细胞，但是它们通常不会在体内分化。本发明的mk细胞优选通过以下而具有其抗癌效果：(i)直接作用，如接触依赖性细胞裂解或adcc，(ii)免疫应答或免疫细胞活性(即免疫调节效果)的调节，并且特别是引发/激活nk细胞，以及(ii)将免疫细胞吸引到癌症位点，特别是nk细胞和单核细胞。未处理的本发明的mk细胞(即未用ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α处理的本发明的mk细胞)通常具有效果(i)和(ii)。用ifn
‑
γ处理的本发明的mk细胞通常具有效果(i)、(ii)和(iii)。与此相反，干细胞通常通过分化为替代组织来治疗疾病。
101.本发明的mk细胞通常以纺锤形形态为进行表征。mk细胞通常是成纤维细胞样的，即它们有具有几个细长细胞突起的小细胞体。细胞的直径通常为约10μm至约20μm。这如图4所示。
102.本发明的mk细胞通过它们的标记物表达模式与已知细胞区分开来。mk细胞表达可检测水平的cd16、cd96、cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277。mk细胞优选表达可检测水平的cd16、cd96、cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277。与已知细胞(如iomp细胞、imp细胞和msc)相比，mk优选地表达增加量的这些标记物。与那些细胞相比，mk细胞优选地表达增加量的所有标记物。这能够通过在相同条件下使用相同技术将本发明的mk中的标记物的表达水平/量与已知细胞中的表达水平/量进行比较来确定。如下文更详细讨论的，与iomp细胞、
imp细胞和msc的群体相比，mk细胞的群体中表达mk标记物的细胞百分比增加。如上文所讨论的，iomp和imp细胞是本领域已知的(并且关于这些细胞的数据呈现在实施例中)。合适的msc是可商购的。用于比较的msc优选为人类msc。人类msc可以从ltd、osirisinc.或商购获得。人类msc优选从获得。这种细胞用于实施例中的比较。msc可以来源于上文讨论的任何动物或哺乳动物。
103.mk细胞不表达可检测水平的cd34和cd45。mk细胞优选不表达可检测水平的cd34、cd45和cd56。mk细胞优选不表达可检测水平的(a)cd45ra、(b)cd45rb和(c)cd45ro中的一种或多种，如(a)，(b)，(c)，(a)和(b)，(a)和(c)，(b)和(c)，或(a)、(b)和(c)。
104.本领域已知的标准方法可以用于确定上文(和下文)讨论的各种标记物的可检测表达或增加的表达。合适的方法包括但不限于免疫细胞化学、免疫测定、流式细胞术(如荧光激活细胞分选(facs))，以及聚合酶链反应(pcr)(如逆转录pcr(rt
‑
pcr))。合适的免疫测定包括但不限于蛋白质印迹、酶联免疫测定(elisa)、酶联免疫吸附斑点测定(elispot测定)、酶扩大免疫测定技术、放射性过敏原吸附(rast)测试、放射免疫测定、放射性结合测定和免疫荧光法。蛋白质印迹、elisa和rt
‑
pcr都是定量的，因此能够用于测量各种标记物(如果存在)的表达水平。实施例中公开了高通量facs(ht
‑
facs)的使用。优选使用流式细胞术、facs或ht
‑
facs进行本文公开的任何标记物的表达或增加的表达。用于本文讨论的所有各种标记物的抗体和荧光标记的抗体是可商购的。
105.本发明的mk细胞优选不表达可检测水平的cd14。cd14为一种关键的mnc标记物。该标记物的表达的缺失将mk细胞与mnc区分开来。
106.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd25(也称为il
‑
2r
α
、tac和p55)。该标记物的表达也将mk细胞从iomp细胞、imp和msc中区分开来。该标记物的表达可以通过用ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α处理/刺激来增加。
107.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd136(也称为msp
‑
r和ron)。该标记物的表达也将mk细胞从iomp细胞、imp和msc中区分开来。该标记物的表达可以通过用ifn
‑
γ处理/刺激来增加。
108.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd155(也称为pvr)。cd155参与nk细胞引发/激活(chan等j immunol,2010年1月15日,184(2)902
‑
911)。
109.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd183(也称为cxcr3)。cd183参与癌症中的nk积累(wendel等cancer res.2008年10月15日；68(20):8437
‑
45)。该标记物的表达也将mk细胞从iomp细胞、imp和msc中区分开来。该标记物的表达可以通过用ifn
‑
γ处理/刺激来增加。
110.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd205(也称为dec
‑
205)。该标记物的表达也将mk细胞从iomp细胞、imp和msc中区分开来。该标记物的表达可以通过用ifn
‑
γ处理/刺激来增加。
111.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd332(也称为fgfr2、bek和kgfr)。cd332(也称为fgfr2、bek和kgfr)调节免疫细胞功能(messal等eur j immunol.2011年12月；41(12):3443
‑
54)。该标记物的表达也将mk细胞从iomp细胞、imp和msc中区分开来。该标记物的表达可以通过用ifn
‑
γ处理/刺激来增加。
112.本发明的mk细胞(a)优选不表达可检测水平的cd102和/或cd127。本发明的mk细胞
(b)优选不表达可检测水平的cd104。本发明的mk细胞(c)优选不表达可检测水平的cd50、cd62e、cd62l和cd62p中的一种或多种，以及优选所有cd50、cd62e、cd62l和cd62p。本发明的mk细胞可以为(a)，(b)，(c)，(a)和(b)，(b)和(c)，(a)和(c)，或(a)、(b)和(c)。该标记物表达模式也将mk细胞与pml区分开来。本文(包括下表1或2)对(i)cd50、(ii)cd62e、(iii)cd62l和(iv)cd62p中的一种或多种的所有引用可以指(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(i)和(ii)，(i)和(iii)，(i)和(iv)，(ii)和(iii)，(ii)和(iv)，(iii)和(iv)，(i)、(ii)和(iii)，(i)、(ii)和(iv)，(i)、(iii)和(iv)，(ii)、(iii)和(iv)，或(i)、(ii)、(iii)和(iv)。cd50、cd102和cd127的表达的缺失也将mk细胞与msc区分开来。
113.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd328。cd328(也称为siglec
‑
7(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素
‑
7))不由cd56阴性的nk细胞表达，cd56阴性的nk细胞代表在健康个体中少量发现的并且在慢性感染hiv
‑
1和hcv的个体中发现水平升高的异常的nk细胞亚群(brunetta,e.等(2009)blood 114,3822
–
3830)。因此，cd328的表达也将mk细胞与cd56阴性的nk细胞区分开来。
114.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的一种或多种nk激活受体和/或一种或多种nk抑制受体。激活和抑制受体可以是以下参照nk细胞所讨论的任何受体。
115.在激活受体方面，本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd158d(也称为kir2dl4)、cd158i(也称为kir2ds4)、cd160(也称为by55)、cd314(也称为nkg2d和klr)和cd337(也称为nkp30和ly117)中的一种或多种，优选所有cd158d、cd158i、cd160、cd314和cd337。本发明的mk细胞优选表达可检测水平的cd159c(也称为nkg2c)。
116.在抑制受体方面，本发明的mk细胞优选表达可检测水平的(a)cd158b2(也称为kir2dl3)、(b)cd158f(也称为kir2dl5)和(c)cd159a(也称为nkg2a)中的一种或多种，优选所有(a)cd158b2、(b)cd158f和(c)cd159a。该细胞可以表达可检测水平的(a)，(b)，(c)，(a)和(b)，(b)和(c)，(a)和(c)，或(a)、(b)和(c)。
117.本发明的mk细胞优选不表达可检测水平的cd159c(也称为nkg2c)。本发明的mk细胞优选不表达可检测水平的(a)cd244、(b)cd335和(c)cd352中的一种或多种，如(a)，(b)，(c)，(a)和(b)，(b)和(c)，(a)和(c)，或(a)、(b)和(c)。本发明的mk细胞优选不表达可检测水平的(a)cd244、(b)cd335和(c)cd352(以任何定义的方式)和cd159c中的一种或多种。这些标记物的表达的缺失将mk细胞与nk细胞区分开来。
118.本发明的mk细胞优选不表达cd140a。本发明的mk细胞优选不表达(i)cdh6、(ii)cd129、(iii)cd200和(iv)cd271中的一种或多种。该mk细胞优选不表达(i)至(iv)的任何数量与组合，如(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(i)和(ii)，(i)和(iii)，(i)和(iv)，(ii)和(iii)，(ii)和(iv)，(iii)和(iv)，(i)、(ii)和(iii)，(i)、(ii)和(iv)，(i)、(iii)和(iv)，(ii)、(iii)和(iv)，或(i)、(ii)、(iii)和(iv)。
119.本发明的mk细胞不是msc。msc的典型标记物的表达模式在zhao等,stem cells&regenerative medicine,springer science 2011(10.1007/978
‑1‑
60761
‑
860
‑
7_12)的表1中列出。mk细胞优选表达可检测水平的cd11b、cd11c、cd49d、cd51、cd86、cd106、cd117、cd202b和cd309中的一种或多种，如它们中的2、3、4、5、6、7或8种或更多种。mk细胞优选表达可检测水平的cd11b、cd25、cd49d、cd51、cd86、cd106、cd117、cd202b和cd309。mk细胞优选表达可检测水平的cd11b、cd11c、cd25、cd49d、cd51、cd86、cd106、cd117、cd202b和cd309。mk细
胞优选表达可检测水平的一种或多种trail受体，mk细胞优选表达可检测水平的cd261、cd262、cd263和cd264中的一种或多种，如它们中的2种或3种或更多种。mk细胞优选表达可检测水平的cd261、cd262和cd264。mk细胞优选表达可检测水平的cd261、cd262、cd263和cd264。mk细胞优选不表达可检测水平的cd184、cd195、cd197和cd282中的一种或多种，如它们中的2种或3种或更多种。mk细胞优选不表达可检测水平的cd184、cd195、cd197和cd282。
120.mk细胞优选表达可检测水平的一种或多种toll样受体(tlr)，特别是tlr3、tlr4、tlr6、tlr8、tlr9和tlr10。mk细胞优选表达可检测水平的cd283、cd284、cd286、cd288、cd289和cd290中的一种或多种，如它们中的2、3、4、5种或更多种。
121.本发明的mk细胞优选表达可检测水平的一种或多种颗粒酶。颗粒酶为丝氨酸蛋白酶家族，其由细胞毒性的t淋巴细胞和nk细胞表达并参与它们的细胞毒性。在含有颗粒酶的细胞与受感染的或转化的靶细胞之间形成受体介导的偶联物后，颗粒酶通过内吞作用进入靶细胞并诱导细胞凋亡(trapani,j.a.granzymes:a family of lymphocyte granule serine proteases.genome biol 2,综述3014.1(2001)doi:10.1186/gb
‑
2001
‑2‑
12
‑
综述3014)。本发明的mk细胞优选表达可检测水平的(a)颗粒酶b(gzmb)、(b)颗粒酶h(gzmh)、(c)颗粒酶m(gzmm)、(d)颗粒酶a(gzma)和(e)颗粒酶k(gzmk)中的一种或多种，如(a)；(b)；(c)；(d)；(e)；(a)和(b)；(a)和(c)；(a)和(d)；(a)和(e)；(b)和(c)；(b)和(d)；(b)和(e)；(c)和(d)；(c)和(e)；(d)和(e)；(a)、(b)和(c)；(a)、(b)和(d)；(a)、(b)和(e)；(a)、(c)和(d)；(a)、(c)和(e)；(a)、(d)和(e)；(b)、(c)和(d)；(b)、(c)和(e)；(b)、(d)和(e)；(c)、(d)和(e)；(a)、(b)、(c)和(d)；(a)、(b)、(c)和(e)；(a)、(b)、(d)和(e)；(a)、(c)、(d)和(e)；(b)、(c)、(d)和(e)；以及(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。mk细胞对一种或多种颗粒酶的表达可以通过将mk细胞暴露于癌细胞(如本文所述的任何癌细胞)而增加。本发明的mk细胞优选表达穿孔素(prf1)。穿孔素是一种形成孔的溶细胞蛋白，其发现于细胞毒性的t淋巴细胞和nk细胞的颗粒中(osi
ń
ska i,popko k,demkow u.perforin:an important player in immune response.cent eur j immunol.2014；39(1):109
–
115.doi:10.5114/ceji.2014.42135)。mk细胞对穿孔素的表达可以通过将mk细胞暴露于癌细胞(如本文所述的任何癌细胞)而增加。上述任何方法均可用于检测一种或多种颗粒酶和/或穿孔素的表达。实施例13和14中的结果表明一种或多种颗粒酶和/或穿孔素在mk细胞毒性中的至少部分作用。
122.本发明的mk细胞通常能够对癌细胞具有细胞毒性效果(即能够杀死癌细胞)。本发明的mk细胞具有细胞毒性效果的能力可以使用本领域已知的标准测定法来测量。本发明优选使用铬
‑
51(
51
cr的)释放测定法，其测量mk细胞裂解后从细胞(如癌细胞)释放的
51
cr。mk细胞可以与癌细胞一起孵育，如下文和实施例中所讨论的。本发明还优选使用铕(eu3 )释放测定法。更详细地论述了合适的癌症。
123.本发明的mk细胞通常还分泌多种细胞因子和其它分子，其有助于其细胞毒性和nk引发功能。可以使用本领域已知的方法测量细胞因子和其它分子。合适的方法包括但不限于酶联免疫测定(elisa)和流式细胞术。一种特定方法是可从life商购获得的测定。
124.mk细胞优选分泌可检测水平的(a)趋化因子(c
‑
x
‑
c基序)配体1(cxcl1也称为groa)，(b)白细胞介素
‑
12(il
‑
12)，(c)可溶性il
‑
2受体(il
‑
2ra)，(d)il
‑
8，(e)可溶性trail和(f)il
‑
6中的一种或多种。mk细胞可以分泌可检测水平的所有(a)至(f)。可以如上
immunology,第10卷,2014
‑
第12期)。
133.cxcl10(ip
‑
10)参与单核细胞、巨噬细胞、t细胞、nk细胞和树突细胞的化学吸引，促进t细胞与内皮细胞的粘附，抗肿瘤活性和骨髓集落形成的抑制和血管生成(dufour等2002,journal of immunology.168(7):3195
–
204；and angiolillo等,1995,the journal of experimental medicine.182(1):155
–
62)。
134.mk细胞优选分泌可检测水平的白细胞介素
‑
6(il
‑
6)、il
‑
8、趋化因子(c
‑
c基序)配体2(ccl2；单核细胞趋化蛋白
‑
1；mcp
‑
1)和趋化因子(c
‑
c基序)配体5(ccl5；基于活化调节，正常t细胞表达和分泌；rantes)中的一种或多种。mk细胞可以分泌任何数量的这些因子和这些因子的任何组合。mk细胞优选分泌所有这些标记物。
135.本发明的mk细胞可以分泌可检测水平的(i)血管内皮生长因子(vegf)，(ii)转化生长因子β(tgf
‑
β)，(iii)胰岛素样生长因子
‑
1(igf
‑
1)，(iv)成纤维细胞生长因子(fgf)，(v)肿瘤坏死因子α(tnf
‑
α)，(vi)ifn
‑
γ和(vii)白细胞介素
‑
1α(il
‑
1α)中的一种或多种。可以如上所述测量这些标记物的可检测分泌。
136.在上面给出的(i)至(vii)的定义中，可以分泌(i)至(vii)中的一种或多种的任何组合。例如，对于(i)至(vii)的每个定义，mk细胞可以分泌可检测水平的(i)；(ii)；(iii)；(iv)；(v)；(vi)；(vii)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)和(v)；(i)和(vi)；(i)和(vii)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；(ii)和(vi)；(ii)和(vii)；(iii)和(iv)；(iii)和(v)；(iii)和(vi)；(iii)和(vii)；(iv)和(v)；(iv)和(vi)；(iv)和(vii)；(v)和(vi)；(v)和(vii)；(vi)和(vii)；(i)、(ii)和(iii)；(i)、(ii)和(iv)；(i)、(ii)和(v)；(i)、(ii)和(vi)；(i)、(ii)和(vii)；(i)、(iii)和(iv)；(i)、(iii)和(v)；(i)、(iii)和(vi)；(i)、(iii)和(vii)；(i)、(iv)和(v)；(i)、(iv)和(vi)；(i)、(iv)和(vii)；(i)、(v)和(vi)；(i)、(v)和(vii)；(i)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)和(iv)；(ii)、(iii)和(v)；(ii)、(iii)和(vi)；(ii)、(iii)和(vii)；(ii)、(iv)和(v)；(ii)、(iv)和(vi)；(ii)、(iv)和(vii)；(ii)、(v)和(vi)；(ii)、(v)和(vii)；(ii)、(vi)和(vii)；(iii)、(iv)和(v)；(iii)、(iv)和(vi)；(iii)、(iv)和(vii)；(iii)、(v)和(vi)；(iii)、(v)和(vii)；(iii)、(vi)和(vii)；(iv)、(v)和(vi)；(iv)、(v)和(vii)；(iv)、(vi)和(vii)；(v)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)和(iv)；(i)、(ii)、(iii)和(v)；(i)、(ii)、(iii)和(vi)；(i)、(ii)、(iii)和(vii)；(i)、(ii)、(iv)和(v)；(i)、(ii)、(iv)和(vi)；(i)、(ii)、(iv)和(vii)；(i)、(ii)、(v)和(vi)；(i)、(ii)、(v)和(vii)；(i)、(ii)、(vi)和(vii)；(i)、(iii)、(iv)和(v)；(i)、(iii)、(iv)和(vi)；(i)、(iii)、(iv)和(vii)；(i)、(iii)、(v)和(vi)；(i)、(iii)、(v)和(vii)；(i)、(iii)、(vi)和(vii)；(i)、(iv)、(v)和(vi)；(i)、(iv)、(v)和(vii)；(i)、(iv)、(vi)和(vii)；(i)、(v)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)、(iv)和(v)；(ii)、(iii)、(iv)和(vi)；(ii)、(iii)、(iv)和(vii)；(ii)、(iii)、(v)和(vi)；(ii)、(iii)、(v)和(vii)；(ii)、(iii)、(vi)和(vii)；(ii)、(iv)、(v)和(vi)；(ii)、(iv)、(v)和(vii)；(ii)、(iv)、(vi)和(vii)；(ii)、(v)、(vi)和(vii)；(iii)、(iv)、(v)和(vi)；(iii)、(iv)、(v)和(vii)；(iii)、(iv)、(vi)和(vii)；(iii)、(v)、(vi)和(vii)；(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(vi)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(v)和(vi)；(i)、(ii)、(iii)、(v)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iv)、(v)和(vi)；(i)、(ii)、(iv)、(v)和(vii)；(i)、(ii)、(iv)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、
(iii)、(iv)、(v)和(vi)；(i)、(iii)、(iv)、(v)和(vii)；(i)、(iii)、(iv)、(vi)和(vii)；(i)、(iii)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)；(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vii)；(ii)、(iii)、(iv)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)、(v)、(vi)和(vii)；(ii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vi)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(ii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(i)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)；或(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和(vii)。(i)至(vii)的组合可从该列表中独立地选择。
137.本发明的mk细胞优选分泌可检测水平的ifn
‑
γ。ifn
‑
γ表达或分泌可以使用上述方法确定。
138.如下文更详细讨论的，mk细胞能够引发/激活nk细胞(即增加nk细胞的增殖和/或细胞毒性活性)。
139.本发明的mk细胞优选能够迁移到受试者的特定组织。换言之，当将细胞施用于患有疾病(如癌症)的受试者时，细胞能够迁移或归巢到所需的一个或多个组织。该组织可以是正常存在于健康受试者中的组织。可替代地，该组织可以是肿瘤。mk细胞的这种迁移能力是有利的，因为它意味着细胞能够通过标准途径进行输注，例如静脉内输注，然后将靶向疾病位点。细胞不必被递送到患病组织。
140.特定组织可以是上文讨论的任何组织。这不仅适用于迁移，而且适用于如上文和下文更详细讨论的粘附、反迁移、增殖、抗肿瘤效果、免疫调节效果、促炎效果和抗炎效果。
141.本发明的mk细胞用以迁移至患病组织的能力可以使用本领域已知的标准测定法来测量。合适的方法包括但不限于基因组逆转录聚合酶链反应(具有或不具有报告基因的rt
‑
pcr)和标记技术。可替代地，本发明的mk细胞可以用感兴趣的染料(如荧光染料)染色，并且可以通过来自染料的信号在受试者中进行监测。这样的方法是本领域的常规方法。
142.迁移(或归巢)通常通过测量到达受损组织的细胞数量来确定。也可以通过观察肺(而不是受损组织)中积聚的细胞数量来间接测量。
143.本发明的mk细胞优选能够粘附至受试者的特定患病组织。粘附(adherence)与附着(adhesion)测定是本领域已知的(humphries,methods mol biol.2009；522:203
‑
10)。
144.本发明的mk细胞优选能够通过血管内皮迁徙至受试者的特定患病组织。迁徙(transmigration)测定是本领域已知的(muller and luscinskas,methods enzymol.2008；443:155
–
176)。
145.本发明的mk细胞优选能够将免疫细胞吸引或化学吸引至炎症位点。本发明的mk细胞更优选能够将免疫细胞吸引或化学吸引至癌症或肿瘤。本发明的mk细胞优选能够诱导免疫细胞迁移至炎症、癌症或肿瘤部位。本发明的mk细胞优选为促炎的。优选地，具有任何这些吸引/化学吸引/促炎效果的mk细胞正在或已经用ifn
‑
γ处理。上文讨论的用于测量细胞迁移或移动的任何方法都可以用于测量免疫细胞的吸引/化学吸引/迁移。免疫细胞可以是淋巴细胞(如t细胞、b细胞或nk细胞)、中性粒细胞或单核细胞/巨噬细胞。免疫细胞优选为nk细胞和/或免疫细胞。
146.本发明的mk细胞优选为自体的。换言之，该细胞优选来源于将向其施用细胞的受试者。可替代地，mk细胞优选为同种异体的。换言之，该细胞优选来源于不同的受试者/供体
或来源于与将向其施用细胞的受试者在免疫学上相容的受试者/供体。
147.本发明的mk细胞可以是分离的，基本上分离的，纯化的或基本上纯化的。如果mk细胞完全不含任何其它成分，如培养基、本发明的其它细胞或其它细胞类型，那么mk细胞为分离的或纯化的。如果将mk细胞与不会干扰其预期用途的载体或稀释剂(如培养基)混合，那么mk细胞为基本上分离的。可替代地，如下所述，本发明的mk细胞可以存在于生长基质中或固定在表面上。
148.可以使用包括基于抗体的技术在内的多种技术分离本发明的mk细胞。基于单克隆抗体与存在于mk细胞上的那些表面标记物(见上文)的结合，可以使用阴性和阳性选择技术以分离细胞。因此，mk细胞可以使用任何基于抗体的技术进行分离，包括荧光激活细胞分选(facs)和磁珠分离法。
149.如下文更详细讨论的，mk细胞可以离体处理。因此，可以用治疗剂或诊断剂装载或转染该细胞，然后在本发明的方法中治疗性地使用。
150.本发明的群体
151.本发明还提供了本发明的mk细胞的群体。本发明还提供了本发明的两种或更多种mk细胞的群体。mk细胞可以是上文定义的那些细胞中的任何一种。群体中可能存在任意数量的细胞。本发明的群体可以包括至少约5,000个细胞，如至少约6,000个细胞、至少约7,000个细胞、至少约8,000个细胞、至少约9,000个细胞、至少约10,000个细胞、至少约20,000个细胞、至少约30,000个细胞、至少约40,000个细胞、至少约50,000个细胞、至少约100,000个细胞、至少约200,000个细胞或至少约250,000个细胞。本发明的群体优选包括至少约5
×
105个本发明的mk细胞。群体更优选包括至少约1
×
106个，至少约2
×
106个，至少约2.5
×
106个，至少约5
×
106个，至少约1
×
107个，至少约2
×
107个，至少约5
×
107个，至少约1
×
108个或至少约2
×
108个本发明的mk细胞。在某些情况下，群体可以包括至少约1.0
×
107个，至少约1.0
×
108个，至少约1.0
×
109个，至少约1.0
×
10
10
个，至少约1.0
×
10
11
个或至少约1.0
×
10
12
个本发明的mk细胞或甚至更多。
152.包括本发明的mk细胞的群体可以包括除了本发明的mk细胞之外的其它细胞。然而，群体中至少约70％的细胞优选为本发明的mk细胞。更优选地，群体中至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的细胞优选为本发明的mk细胞。在一个优选实施方式中，群体中至少约70％、至少约75％、至少约80％或至少约85％的细胞为mk细胞，表达上文定义的阳性mk标记物而不表达上文定义的阴性mk标记物。在另一个优选实施方式中，群体中至少约90％的细胞为mk细胞，表达上文定义的阳性mk标记物而不表达上文定义的阴性mk标记物。在另一个优选实施方式中，群体中至少约95％的细胞为mk细胞，表达上文定义的阳性mk标记物而不表达上文定义的阴性mk标记物。
153.本发明还提供了本发明的mk细胞的群体，其中，群体中超过约15％的细胞表达可检测水平的cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277，并且其中，群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34和cd45。在这些群体中，群体中超过约15％的细胞(或上文讨论的任何％)可以表达可检测水平的如由本发明的mk细胞可检测地表达的上述特异性标记物。类似地，约5％或更少的(或上文讨论的任何较低的％)可以表达可检测水平的如不被本发明的mk细胞可检测地表达的上述特异性标记物。这些群体可以包含以上述任何数量的细胞。表1列出了本发明的特定群体。
154.表1—本发明的优选群体(其中，“一种或多种”是参照特异性标记物如上所定义的，该定义适用于与表中那些标记物相关的术语的使用；*＝相关群体的左栏中的标记物的组合)
155.156.157.158.[0159][0160]
在上文讨论的和表1中列出的群体中，群体中约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、约40％或更多、约45％或更多、约50％或更多、约55％或更多、约60％或更多、约65％或更多、约70％或更多、约75％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％的细胞优选表达可检测水平的相关标记物(特别是表1的第2列中的标记物)。在上文讨论的和表1中列出的群体中，群体中约60％或更多的细胞更优选表达可检测水平的相关标记物(特别是表1的第2列中的标记物)。在上文讨论的和表1中列出的群体中，群体中约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％或更多的细胞更优选表达可检测水平的相关标记物(特别是表1的第2列中的标记物)。在上文讨论的和表1中列出的群体中，群体中约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、或约0.5％或更少的细胞可以表达可检测水平的相关标记物(特别是表1的第3列中的标记物)。
[0161]
本发明还提供了本发明的mk细胞的群体，其中，群体中超过约15％的细胞表达可检测水平的cd16、cd96、cd112、cd137l、cd178、cd253和cd277，并且其中，群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34、cd45和cd56。在这些群体中，群体中超过约15％的细胞(或上文讨论的任何百分数％)可以表达可检测水平的如由本发明的mk细胞可检测地表达的上述特异性标记物。类似地，约5％或更少的(或上文讨论的任何较低的百分数％)可以表达可检测水平的如不被本发明的mk细胞可检测地表达的上述特异性标记物。这些群体可以包含以上述任何数量的细胞。表2列出了本发明的特定群体。
[0162]
表2
‑
本发明的优选群体(其中，“一种或多种”是参照特异性标记物如上所定义的，该定义适用于与表中那些标记物相关的术语的使用；*＝相关群体的左栏中的标记物的组合)
[0163]
[0164]
[0165]
[0166][0167]
在上文讨论的和表2中列出的群体中，群体中约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、约40％或更多、约45％或更多、约50％或更多、约55％或更多、约60％或更多、约65％或更多、约70％或更多、约75％或更多、约80％或更多、约85％或更
多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％的细胞优选表达可检测水平的相关标记物(特别是表2的第2列中的标记物)。在上文讨论的和表2中列出的群体中，群体中约60％或更多的细胞更优选表达可检测水平的相关标记物(特别是表2的第2列中的标记物)。在上文讨论的和表2中列出的群体中，群体中约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％或更多的细胞更优选表达可检测水平的相关标记物(特别是表2的第2列中的标记物)。在上文讨论的和表2中列出的群体中，群体中约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、或约0.5％或更少的细胞可以表达可检测水平的相关标记物(特别是表2的第3列中的标记物)。
[0168]
本发明还提供了mk细胞的特定群体。本发明提供了mk细胞的群体，其中
[0169]
(i)群体中至少约20％(如至少约25％、至少约27％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约61％或至少约62％)的细胞表达可检测水平的cd112，
[0170]
(ii)群体中至少约80％(如至少约90％、至少约95％、至少约96％或至少约97％)的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0171]
(iii)群体中至少约20％(如至少约21％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％)的细胞表达可检测水平的cd178，
[0172]
(iv)群体中至少约50％(如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约92％或至少约93％)的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0173]
(v)群体中至少约50％(如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％或至少约97％)的细胞表达可检测水平的cd277，
[0174]
并且其中
[0175]
(a)群体中约5％或更少(如约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少或约0.5％或更少)的细胞表达可检测水平的cd34，并且
[0176]
(b)群体中约5％或更少(如约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少或约1％或更少)的细胞表达可检测水平的cd45。
[0177]
本发明还提供了mk细胞的群体，其中
[0178]
(i)群体中至少约15％(如至少约18％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约65％或至少约66％)的细胞表达可检测水平的cd16，
[0179]
(ii)群体中至少约50％(如至少约58％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％或至少约86％)的细胞表达可检测水平的cd96，
[0180]
(iii)群体中至少约20％(如至少约25％、至少约27％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约61％或至少约62％)的细胞表达可检测水平的cd112，
[0181]
(iv)群体中至少约80％(如至少约90％、至少约95％、至少约96％或至少约97％)的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0182]
(v)群体中至少约20％(如至少约21％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％)的细胞表达可检测水平的cd178，
[0183]
(vi)群体中至少约50％(如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约92％或至少约93％)的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0184]
(vii)群体中至少约50％(如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％或至少约97％)的细胞表达可检测水平的cd277，
[0185]
并且其中
[0186]
(a)群体中约5％或更少(如约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少或约0.5％或更少)的细胞表达可检测水平的cd34，
[0187]
(b)群体中约5％或更少(如约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少或约1％或更少)的细胞表达可检测水平的cd45，并且
[0188]
(c)群体中约5％或更少(如约4％或更少或约3％或更少)的细胞表达可检测水平的cd56。
[0189]
优选地，其中，以下一项或多项，或更优选地以下所有：
[0190]
——群体中约10％或更少(如约9％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少或约1％或更少)的细胞表达可检测水平的cd14；
[0191]
——群体中至少约5％(如至少约7％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约54％)的细胞表达可检测水平的cd25；
[0192]
——群体中至少约10％(如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约69％、至少约70％或至少约80％)的细胞表达可检测水平的cd136；
[0193]
——群体中至少约90％(如至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％)的细胞表达可检测水平的cd155；
[0194]
——群体中至少约20％(如至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约51％)的细胞表达可检测水平的cd183；
[0195]
——群体中至少约10％(如至少约15％、至少约20％、至少约30％或至少约32％)的细胞表达可检测水平的cd205；
[0196]
——群体中至少约9％(如至少约10％、至少约20％、至少约25％或至少约29％)的细胞表达可检测水平的cd332；
[0197]
——群体中约2％或更少(如约1％或更少或约0.5％或更少)的细胞表达可检测水平的cd102；
[0198]
——群体中约2％或更少(如约1％或更少或约0.5％或更少)的细胞表达可检测水平的cd127；
[0199]
——群体中约10％或更少(如约9％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少或约1％或更少)的细胞表达可检测水平的cd104；
[0200]
——群体中约60％或更少(如约50％或更少、约46％或更少、约30％或更少或约20％)的细胞表达可检测水平的cd126；
[0201]
——群体中至少约15％(如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％，或至少约95％)的细胞表达可检测水平的cd126；
[0202]
——群体中约3％或更少(如约2％或更少或约1％或更少)的细胞表达可检测水平的cd62e；
[0203]
——群体中约5％或更少(如约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少或约0.5％或更少)的细胞表达可检测水平的cd62l；
[0204]
——群体中约1％或更少(如约0.5％或更少)的细胞表达可检测水平的cd62p；
[0205]
——群体中至少约30％(如至少约33％、至少约40％、至少约50％、至少约55％或
至少约59％)的细胞表达可检测水平的cd158d；
[0206]
——群体中至少约22％(如至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约61％)的细胞表达可检测水平的cd158i；
[0207]
——群体中至少约30％(如至少约40％、至少约45％、至少约50％或至少约51％)的细胞表达可检测水平的cd160；
[0208]
——群体中至少约40％(如至少约45％、至少约48％、至少约50％或至少约54％)的细胞表达可检测水平的cd314；
[0209]
——群体中至少约30％(如至少约35％、至少约40％或至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约72％)的细胞表达可检测水平的cd337；
[0210]
——群体中至少约6％或至少约10％的细胞表达可检测水平的cd159c；
[0211]
——群体中至少约7％(如至少约10％、至少约15％、至少约20％或至少约23％)的细胞表达可检测水平的cd158b2；
[0212]
——群体中至少约30％(如至少约40％、至少约41％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约87％)的细胞表达可检测水平的cd158f；并且
[0213]
——群体中至少约8％(如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约51％)的细胞表达可检测水平的cd159a。
[0214]
优选地，其中，群体中约3％或更少(如约2.5％或更少)的细胞表达可检测水平的cd159c。
[0215]
本发明的特定群体可以参照表1或2中所示的标记物的任何组合如上定义。
[0216]
本发明还提供了基于实施例3中的mk002和mk004的本发明的特定群体。本发明优选提供了mk细胞的群体，其中
[0217]
(i)群体中至少约62％的细胞表达可检测水平的cd112，
[0218]
(ii)群体中至少约97％的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0219]
(iii)群体中至少约60％的细胞表达可检测水平的cd178，
[0220]
(iv)群体中至少约93％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0221]
(v)群体中至少约97％的细胞表达可检测水平的cd277，
[0222]
并且其中
[0223]
(a)群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，并且
[0224]
(b)群体中约4％或更少的细胞表达可检测水平的cd45。
[0225]
本发明优选提供了mk细胞的群体，其中
[0226]
(i)群体中至少约66％的细胞表达可检测水平的cd16，
[0227]
(ii)群体中至少约86％的细胞表达可检测水平的cd96，
[0228]
(iii)群体中至少约62％的细胞表达可检测水平的cd112，
[0229]
(iv)群体中至少约97％的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0230]
(v)群体中至少约60％的细胞表达可检测水平的cd178，
[0231]
(vi)群体中至少约93％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0232]
(vii)群体中至少约97％的细胞表达可检测水平的cd277，
[0233]
并且其中
[0234]
(a)群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，
[0235]
(b)群体中约4％或更少的细胞表达可检测水平的cd45，并且
[0236]
(c)群体中约3％或更少的细胞表达可检测水平的cd56。
[0237]
优选地，其中，以下一项或多项，或更优选地以下所有：
[0238]
——群体中约9％或更少的细胞表达可检测水平的cd14；
[0239]
——群体中至少约54％的细胞表达可检测水平的cd25，
[0240]
——群体中至少约80％的细胞表达可检测水平的cd136；
[0241]
——群体中至少约99％的细胞表达可检测水平的cd155；
[0242]
——群体中至少约51％的细胞表达可检测水平的cd183；
[0243]
——群体中至少约32％的细胞表达可检测水平的cd205；
[0244]
——群体中至少约29％的细胞表达可检测水平的cd332；
[0245]
——群体中约2％或更少的细胞表达可检测水平的cd102；
[0246]
——群体中约2％或更少的细胞表达可检测水平的cd127；
[0247]
——群体中约9％或更少的细胞表达可检测水平的cd104；
[0248]
——群体中约46％或更少的细胞表达可检测水平的cd126，或群体中至少约45％的细胞表达可检测水平的cd126；
[0249]
——群体中约3％或更少的细胞表达可检测水平的cd62e；
[0250]
——群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd62l；
[0251]
——群体中约1％或更少的细胞表达可检测水平的cd62p；
[0252]
——群体中至少约59％的细胞表达可检测水平的cd158d；
[0253]
——群体中至少约61％的细胞表达可检测水平的cd158i；
[0254]
——群体中至少约40％的细胞表达可检测水平的cd160；
[0255]
——群体中至少约54％的细胞表达可检测水平的cd314；
[0256]
——群体中至少约72％的细胞表达可检测水平的cd337；
[0257]
——群体中至少约10％的细胞表达可检测水平的cd159c；
[0258]
——群体中至少约23％的细胞表达可检测水平的cd158b2；
[0259]
——群体中至少约87％的细胞表达可检测水平的cd158f；并且
[0260]
——群体中至少约51％的细胞表达可检测水平的cd159a。
[0261]
本发明的特定群体可以参照表1或2中所示的标记物的任何组合定义。该群体最优选地具有表7中所示的mk002的标记物表达模式。
[0262]
本发明优选提供了mk细胞的群体，其中
[0263]
(i)群体中至少约27％的细胞表达可检测水平的cd112，
[0264]
(ii)群体中至少约97％的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0265]
(iii)群体中至少约21％的细胞表达可检测水平的cd178，
[0266]
(iv)群体中至少约93％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0267]
(v)群体中至少约96％的细胞表达可检测水平的cd277，
[0268]
并且其中
[0269]
(a)群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，并且
[0270]
(b)群体中约1％或更少的细胞表达可检测水平的cd45。
[0271]
本发明优选提供了mk细胞的群体，其中
[0272]
(i)群体中至少约18％的细胞表达可检测水平的cd16，
[0273]
(ii)群体中至少约58％的细胞表达可检测水平的cd96，
[0274]
(iii)群体中至少约27％的细胞表达可检测水平的cd112，
[0275]
(iv)群体中至少约97％的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0276]
(v)群体中至少约21％的细胞表达可检测水平的cd178，
[0277]
(vi)群体中至少约93％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0278]
(vii)群体中至少约96％的细胞表达可检测水平的cd277，
[0279]
并且其中
[0280]
(a)群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，
[0281]
(b)群体中约1％或更少的细胞表达可检测水平的cd45，并且
[0282]
(c)群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd56。
[0283]
优选地，其中，以下一项或多项，或更优选地以下所有：
[0284]
——群体中约1％或更少的细胞表达可检测水平的cd14；
[0285]
——群体中至少约7％的细胞表达可检测水平的cd25，
[0286]
——群体中至少约69％的细胞表达可检测水平的cd136；
[0287]
——群体中至少约99％的细胞表达可检测水平的cd155；
[0288]
——群体中至少约20％的细胞表达可检测水平的cd183；
[0289]
——群体中至少约15％的细胞表达可检测水平的cd205；
[0290]
——群体中至少约9％的细胞表达可检测水平的cd332；
[0291]
——群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd102；
[0292]
——群体中约2％或更少的细胞表达可检测水平的cd127；
[0293]
——群体中约2％或更少的细胞表达可检测水平的cd104；
[0294]
——群体中约20％或更少的细胞表达可检测水平的cd126，或群体中至少约19％的细胞表达可检测水平的cd126；
[0295]
——群体中约1％或更少的细胞表达可检测水平的cd62e；
[0296]
——群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd62l；
[0297]
——群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd62p；
[0298]
——群体中至少约33％的细胞表达可检测水平的cd158d；
[0299]
——群体中至少约22％的细胞表达可检测水平的cd158i；
[0300]
——群体中至少约51％的细胞表达可检测水平的cd160；
[0301]
——群体中至少约48％的细胞表达可检测水平的cd314；
[0302]
——群体中至少约35％的细胞表达可检测水平的cd337；
[0303]
——群体中约2.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd159c；
[0304]
——群体中至少约7％的细胞表达可检测水平的cd158b2；
[0305]
——群体中至少约41％的细胞表达可检测水平的cd158f；并且
[0306]
——群体中至少约8％的细胞表达可检测水平的cd159a。
[0307]
本发明的特定群体可以参照表1或2中所示的标记物的任何组合定义。该群体最优选地具有表7中所示的mk004的标记物表达模式。
[0308]
本发明优选提供了mk细胞的群体，其中
[0309]
(i)群体中至少约46％的细胞表达可检测水平的cd112，
[0310]
(ii)群体中至少约91％的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0311]
(iii)群体中至少约65％的细胞表达可检测水平的cd178，
[0312]
(iv)群体中至少约88％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0313]
(v)群体中至少约96％的细胞表达可检测水平的cd277，
[0314]
并且其中
[0315]
(a)群体中约1.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，并且
[0316]
(b)群体中约4.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd45。
[0317]
本发明优选提供了mk细胞的群体，其中
[0318]
(i)群体中至少约34％的细胞表达可检测水平的cd16，
[0319]
(ii)群体中至少约83％的细胞表达可检测水平的cd96，
[0320]
(iii)群体中至少约46％的细胞表达可检测水平的cd112，
[0321]
(iv)群体中至少约91％的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0322]
(v)群体中至少约65％的细胞表达可检测水平的cd178，
[0323]
(vi)群体中至少约88％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0324]
(vii)群体中至少约96％的细胞表达可检测水平的cd277，
[0325]
并且其中
[0326]
(a)群体中约1.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，
[0327]
(b)群体中约4.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd45，并且
[0328]
(c)群体中约1％或更少的细胞表达可检测水平的cd56。
[0329]
优选地，其中，以下一项或多项，或更优选地以下所有：
[0330]
——群体中约4％或更少的细胞表达可检测水平的cd14；
[0331]
——群体中至少约43％的细胞表达可检测水平的cd25，
[0332]
——群体中至少约79％的细胞表达可检测水平的cd136；
[0333]
——群体中至少约99％的细胞表达可检测水平的cd155；
[0334]
——群体中至少约39％的细胞表达可检测水平的cd183；
[0335]
——群体中至少约46％的细胞表达可检测水平的cd205；
[0336]
——群体中至少约23％的细胞表达可检测水平的cd332；
[0337]
——群体中约1.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd102；
[0338]
——群体中至少约6％的细胞表达可检测水平的cd127；
[0339]
——群体中至少约16％的细胞表达可检测水平的cd104；
[0340]
——群体中至少约54％的细胞表达可检测水平的cd126；
[0341]
——群体中约4％或更少的细胞表达可检测水平的cd62e；
[0342]
——群体中至少约11％的细胞表达可检测水平的cd62l；
[0343]
——群体中约2.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd62p；
[0344]
——群体中至少约37％的细胞表达可检测水平的cd158d；
[0345]
——群体中至少约44％的细胞表达可检测水平的cd158i；
[0346]
——群体中至少约78％的细胞表达可检测水平的cd160；
[0347]
——群体中至少约76％的细胞表达可检测水平的cd314；
[0348]
——群体中至少约49％的细胞表达可检测水平的cd337；
[0349]
——群体中至少约14％的细胞表达可检测水平的cd159c；
[0350]
——群体中至少约21％的细胞表达可检测水平的cd158b2；
[0351]
——群体中至少约48％的细胞表达可检测水平的cd158f；并且
[0352]
——群体中至少约34％的细胞表达可检测水平的cd159a。
[0353]
本发明的特定群体可以参照表1或2中所示的标记物的任何组合定义。该群体最优选地具有表11中所示的ifn
‑
γ处理的mk004的标记物表达模式。
[0354]
本发明优选提供了mk细胞的群体，其中
[0355]
(i)群体中至少约23％的细胞表达可检测水平的cd112，
[0356]
(ii)群体中至少约79％的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0357]
(iii)群体中至少约30％的细胞表达可检测水平的cd178，
[0358]
(iv)群体中至少约77％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0359]
(v)群体中至少约82％的细胞表达可检测水平的cd277，
[0360]
并且其中
[0361]
(a)群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，并且
[0362]
(b)群体中约2％或更少的细胞表达可检测水平的cd45。
[0363]
本发明优选提供了mk细胞的群体，其中
[0364]
(i)群体中至少约16％的细胞表达可检测水平的cd16，
[0365]
(ii)群体中至少约45％的细胞表达可检测水平的cd96，
[0366]
(iii)群体中至少约23％的细胞表达可检测水平的cd112，
[0367]
(iv)群体中至少约79％的细胞表达可检测水平的cd137l，
[0368]
(v)群体中至少约30％的细胞表达可检测水平的cd178，
[0369]
(vi)群体中至少约77％的细胞表达可检测水平的cd253，并且
[0370]
(vii)群体中至少约82％的细胞表达可检测水平的cd277，
[0371]
其中
[0372]
(a)群体中约0.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd34，并且
[0373]
(b)群体中约2％或更少的细胞表达可检测水平的cd45，
[0374]
并且其中
[0375]
群体中约10％或更少的细胞表达可检测水平的cd56，或群体中至少约10％的细胞表达可检测水平的cdcd56。
[0376]
优选地，其中，以下一项或多项，或更优选地以下所有：
[0377]
——群体中约2％或更少的细胞表达可检测水平的cd14；
[0378]
——群体中至少约12％的细胞表达可检测水平的cd25，
[0379]
——群体中至少约52％的细胞表达可检测水平的cd136；
[0380]
——群体中至少约99％的细胞表达可检测水平的cd155；
[0381]
——群体中至少约19％的细胞表达可检测水平的cd183；
[0382]
——群体中至少约11％的细胞表达可检测水平的cd205；
[0383]
——群体中至少约9％的细胞表达可检测水平的cd332；
[0384]
——群体中约1.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd102；
[0385]
——群体中约5％或更少的细胞表达可检测水平的cd127；
[0386]
——群体中约3.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd104；
[0387]
——群体中至少约18％的细胞表达可检测水平的cd126；
[0388]
——群体中约1.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd62e；
[0389]
——群体中约3.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd62l；
[0390]
——群体中约2％或更少的细胞表达可检测水平的cd62p；
[0391]
——群体中至少约24％的细胞表达可检测水平的cd158d；
[0392]
——群体中至少约18％的细胞表达可检测水平的cd158i；
[0393]
——群体中至少约52％的细胞表达可检测水平的cd160；
[0394]
——群体中至少约39％的细胞表达可检测水平的cd314；
[0395]
——群体中至少约31％的细胞表达可检测水平的cd337；
[0396]
——群体中约3.5％或更少的细胞表达可检测水平的cd159c；
[0397]
——群体中至少约9％的细胞表达可检测水平的cd158b2；
[0398]
——群体中至少约33％的细胞表达可检测水平的cd158f；并且
[0399]
——群体中至少约9％的细胞表达可检测水平的cd159a。
[0400]
本发明的特定群体可以参照表1或2中所示的标记物的任何组合定义。该群体最优选地具有表11中所示的tnf
‑
α处理的mk004的标记物表达模式。
[0401]
在上文讨论的任何群体中，群体中约5％或更少(如约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少或约1％或更少)的细胞优选表达(a)cd45ra、(b)cd45rb和(c)cd45ro中的一种或多种，如(a)，(b)，(c)，(a)和(b)，(a)和(c)，(b)和(c)，或(a)、(b)和(c)。
[0402]
在上文讨论的任何群体中，群体中约5％或更少(如约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少或约1％或更少)的细胞优选表达cd140a，如在它们的表面上。在上文讨论的任何群体中，群体中约5％或更少(如约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少或约1％或更少)的细胞优选表达(i)cdh6、(ii)cd129、(iii)cd200和(iv)cd271中的一种或多种，如(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(i)和(ii)，(i)和(iii)，(i)和(iv)，(ii)和(iii)，(ii)和(iv)，(iii)和(iv)，(i)、(ii)和(iii)，(i)、(ii)和(iv)，(i)、(iii)和(iv)，(ii)、(iii)和(iv)，或(i)、(ii)、(iii)和(iv)。
[0403]
这些优选群体中的细胞可以进一步表达可检测水平的关于本发明的mk的上述任何标记物。这些优选群体中的细胞可以具有上述mk细胞的任何有利特性。
[0404]
在以上任何实施方式中，其中参照表达某些标记物的细胞的百分比％来定义群体，群体优选包括至少约5,000个细胞，如至少约6,000个细胞，至少约7,000个细胞，至少约8,000个细胞，至少约9,000个细胞，至少约10,000个细胞，至少约20,000个细胞，至少约30,000个细胞，至少约40,000个细胞，至少约50,000个细胞，至少约100,000个细胞，至少约200,000个细胞，至少约250,000个细胞或至少约500,000个细胞。群体更优选包括至少约5000个细胞，至少约50,000个细胞或至少约250,000个细胞。这些群体可以包含任何数量的上述细胞。
[0405]
本发明的任何群体优选分泌可检测水平的(a)趋化因子(c
‑
x
‑
c基序)配体1(cxcl1也称为groa)，(b)白细胞介素
‑
12(il
‑
12)，(c)可溶性il
‑
2受体(il
‑
2ra)，(d)il
‑
8，(e)可溶性trail和(f)il
‑
6中的一种或多种。mk细胞可以分泌可检测水平的上述(a)至(f)的任何组
合和排列。本发明的任何群体优选分泌可检测水平的il
‑
15和/或cxcl10(ip
‑
10)。该群体优选分泌可检测水平的il
‑
15和/或cxcl10(ip
‑
10)与上述(a)groa、(b)白细胞介素
‑
12(il
‑
12)、(c)il
‑
2ra、(d)il
‑
8、(e)可溶性trail和(f)il
‑
6中的一种或多种的组合。
[0406]
本文公开的细胞的任何群体都可以在使用前用其它细胞稀释。例如，该群体可以与受试者的血液、mnc、msc、nk细胞、pml、imp细胞、iomp细胞或其组合结合。
[0407]
本发明的群体有利于如上所述的治疗方法。生成包含大量本发明的安全mk细胞的群体的能力是本发明的关键优点之一。本发明允许用细胞的群体治疗受试者，该细胞能够有效地迁移到感兴趣的组织并且一旦在那里就具有抗肿瘤效果。这允许使用低细胞剂量，并且避免与car
‑
t细胞相关的副作用和体积相关的副作用。
[0408]
本发明的群体优选为同源的。换言之，群体中的所有imp细胞优选在基因型和表型上是相同的。该群体优选为如上定义的自体的或同种异体的。
[0409]
然而，群体也可以是半同种异体的(semi
‑
allogeneic)。半同种异体的群体通常由来自两个或更多个受试者的mnc生成。换言之，群体中的所有细胞优选在基因方面相同或在基因方面足够相同。因为本发明的mk细胞可以来自受试者，因此它们对于待治疗的受试者可以是自体的。
[0410]
本发明的群体可以是分离的，基本上分离的，纯化的或基本上纯化的。如果群体完全不含任何其它成分，如培养基和其它细胞，那么群体为分离的或纯化的。如果将群体与不会干扰其预期用途的载体或稀释剂(如培养基)混合，那么群体为基本上分离的。下面更详细地讨论其它载体和稀释剂。基本上分离的或基本上纯化的群体不包含除了本发明的mk细胞之外的细胞。在一些实施方式中，如下所述本发明的群体可以存在于生长基质中或固定在表面上。
[0411]
群体通常在体外培养。培养细胞的技术是本领域技术人员众所周知的。细胞可以在37℃、5％co2的标准条件下在无血清培养基中培养。细胞优选在低氧条件下与血小板裂解物一起培养，如下文更详细讨论的。细胞可以在任何合适的烧瓶或容器中培养，包括多孔平板，如标准6孔板。这种板可以从fisher scientific、vwr供应商、nunc、starstedt或falcon商购获得。孔通常具有约1ml至约4ml的容量。
[0412]
可以改变容纳或培养群体的烧瓶、容器或孔，以促进mk细胞的处理。例如，可以例如通过包括生长基质改变烧瓶、容器或孔以促进细胞的培养。可以改变烧瓶、容器或孔以允许mk细胞附着或允许mk细胞固定在表面上。一个或多个表面可以涂覆有细胞外基质蛋白，如层粘连蛋白或胶原蛋白或任何其它结合至细胞并将它们固定或捕获在表面上的捕获分子。
[0413]
可以使用本文所述的任何技术对群体进行离体修饰。例如，该群体可以被转染或加载治疗剂或诊断剂。然后该群体可以用于下文更详细讨论的治疗方法。
[0414]
生成本发明mk细胞的方法
[0415]
本发明还提供了一种生成本发明的群体的方法。该方法包括在诱导单核细胞(mnc)分化为imp细胞的条件下培养mnc(步骤(a))。此步骤公开于pct/gb2015/051673(公开为wo 2015/189587)中。该方法然后涉及在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养imp细胞(步骤(b))。mk细胞具有关于本发明的细胞的上文所讨论的标记物表达
谱。可以使用常规技术(如实施例中公开的)收获细胞并冷冻或立即使用。
[0416]
单核细胞(mnc)和分离它们的方法是本领域已知的。mnc优选为从骨髓中分离的原代mnc。mnc可以优选为外周血mnc(pbmc)，如淋巴细胞、单核细胞和/或巨噬细胞。可以使用亲水性多糖(如)从骨髓或血液中分离mnc。例如，可以使用(一种可商购的密度介质)分离mnc，如实施例中公开的。
[0417]
在该方法的所有步骤中，细胞均在37℃、5％co2的标准条件下在无血清培养基中培养。
[0418]
如pct/gb2015/051673(公开为wo 2015/189587)中所述，在步骤(a)中，mnc通常在具有表5所列组分的无核苷的最低必需培养基(minimum essential medium，mem)alpha(thermofisher；产品代码：32561
‑
102)中培养以形成imp细胞。mem可以从包括thermofisher和sigma
‑
aldrich在内的各种来源商购获得。步骤(a)优选包括在诱导mnc分化为imp细胞的条件下在缺乏核糖核苷和脱氧核糖核苷的培养基中培养单核细胞(mnc)。核糖核苷和脱氧核糖核苷可以是下面讨论的任何一个。
[0419]
步骤(a)中的培养基优选还包含肝素和/或青霉素/链霉亲和素(p/s)。步骤(a)中的培养基补充有血小板裂解物。步骤(a)优选包括：在诱导mnc分化为imp细胞的条件下在缺乏核糖核苷和脱氧核糖核苷且包含血小板裂解物的培养基中培养单核细胞(mnc)。核糖核苷和脱氧核糖核苷可以是以下讨论的任何一种。血小板裂解物是指通过裂解这些血小板而释放出来的血小板中含有的天然生长因子的组合。裂解可以通过化学方式(即cacl2)、渗透方式(使用蒸馏水)或通过冷冻/解冻过程完成。血小板裂解物可以来自全血，如美国专利no.5,198,357中所述。血小板裂解物优选如pct/gb12/052911(公开为wo 2013/076507)中所述制备。血小板裂解物优选通过在每个冷冻阶段使用液氮的4次冷冻/解冻循环制备。血浆裂解物优选为人血浆裂解物。培养基优选包含按体积计约20％或更少的血小板裂解物，如按体积计约15％或更少或按体积计约10％或更少。培养基优选包含按体积计约5％至约20％的血小板裂解物，如按体积计约10％至约15％。培养基优选包含按体积计约10％的血小板裂解物。
[0420]
本发明的方法的步骤(a)通常包括培养mnc足够的时间以诱导mnc分化为imp细胞。该足够的时间通常为约15天至约25天，优选约18、19、20、21、22、23或24天。细胞可以传代并在约8天后更换培养基。当细胞几乎汇合时，该细胞可以再次传代并在约另外的4、5或6天后(总共约12、13或14天)更换培养基。然后可以在几乎汇合约6、7或8天后(总共约18至22天)收获imp细胞。
[0421]
步骤(a)通常包括在允许mk细胞粘附的条件下培养mnc。允许细胞粘附的不同尺寸的培养瓶和6孔、12孔、24孔和96孔板，可从各种来源商购获得，如和
[0422]
在步骤(a)中，mnc优选在低氧条件下培养。低氧条件是指在大气中存在的低于20.95％的氧气。mnc优选在低于约20.5％的氧气(o2)下培养，如低于约20％、低于约19％、低于约18％、低于约17％、低于约16％、低于约15％、低于约14％、低于约13％、低于约12％、低于约11％、低于约10％、低于约9％、低于约8％、低于约7％、低于约6％、低于约5％、低于约4％、低于约3％、低于约2％或低于约1％的氧气(o2)。mnc可以在约0％至约19％的o2下培养，如约1％至约15％的o2，约2％至约10％的o2或约5％至约8％的o2。mnc最优选在约16％至
约19％的o2下培养。上面引用的％的氧气(或％的o2)的数字涉及培养过程中的孵育箱内气体中氧气的体积百分比。该方法通常在不主动向细胞供应氧气的孵育箱中实施。即使孵育箱没有主动供应氧气，大气中仍然会有氧气存在。这通常为约16％至约19％。该方法可以包括在约16％至约19％的氧气(o2)下培养细胞。专门的缺氧孵育箱可以用于进一步降低氧气水平。
[0423]
在步骤(a)中，mnc最优选在血小板裂解物存在下并在低氧条件下培养。
[0424]
在步骤(a)中，mnc分化为imp细胞。这描述于pct/gb2015/051673(wo 2015/189587)中。imp细胞表达可检测水平的mic a/b、cd304(神经纤毛蛋白1)、cd178(fas配体)、cd289(toll样受体9)、cd363、(鞘氨醇
‑1‑
磷酸受体1)、cd99、cd181(c
‑
x
‑
c趋化因子受体1型；cxcr1)、表皮生长因子受体(egf
‑
r)、cxcr2和cd126。imp细胞通常也表达可检测水平的cd29、cd44、cd73、cd90、cd105和cd271，并且不表达可检测水平的cd14、cd34和cd45。上面讨论的步骤(a)的任何培养条件都能够用于将mnc分化为imp细胞，培养条件包括血小板裂解物、粘附和低氧中的任一种，优选包括所有。
[0425]
在步骤(b)中，该方法优选还包括在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养imp细胞。一种或多种核糖核苷优选为(i)腺嘌呤核苷、(ii)胞嘧啶核苷、(iii)鸟嘌呤核苷和(iv)尿嘧啶核苷中的一种或多种。一种或多种脱氧核糖核苷优选为(i)2'脱氧腺嘌呤核苷、(ii)2'脱氧胞嘧啶核苷盐酸盐、(iii)2'脱氧鸟嘌呤核苷和(iv)胸腺嘧啶脱氧核苷中的一种或多种。在这两种情况下，培养基可以包含(i)至(iv)的任何数量和组合，如(i)，(ii)，(iii)，(iv)，(i)和(ii)，(i)和(iii)，(i)和(iv)，(ii)和(iii)，(ii)和(iv)，(iii)和(iv)，(i)、(ii)和(iii)，(i)、(ii)和(iv)，(i)、(iii)和(iv)，(ii)、(iii)和(iv)，或(i)、(ii)、(iii)和(iv)。该培养基优选包含腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、2'脱氧腺嘌呤核苷、2'脱氧胞嘧啶核苷盐酸盐、2'脱氧鸟嘌呤核苷和胸腺嘧啶脱氧核苷。步骤(b)中的培养基优选还包含l
‑
谷氨酰胺，而非l
‑
丙氨酰
‑
l
‑
谷氨酰胺。
[0426]
在步骤(b)中，该方法更优选还包括在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为mk细胞的条件下，在包含表6中所列组分并包含血小板裂解物的培养基中培养imp细胞。包含表6中所列组分的培养基优选为实施例中使用的具有核苷的mem alpha(thermofisher；产品代码：12571
‑
063)。
[0427]
步骤(b)通常需要约6、7或8天。一旦mk细胞几乎汇合，就可以收获mk细胞。步骤(a)和(b)通常总共需要约24天至约30天，如约25、26、27、28或29天。步骤(b)可以包括将mk细胞培养约6、7或8天，传代(重新接种)mk细胞并将它们培养另外约2、3、4、5、6、7或8天。在这种情况下，步骤(a)和(b)通常总共需要约24天至约34天，如约25、26、27、28、29、30、31、32或33天。
[0428]
上文针对步骤(a)讨论的关于血小板裂解物和低氧条件的任何实施方式同样适用于步骤(b)。步骤(b)中使用的血小板裂解物优选如在pct/gb12/052911(公开为wo 2013/076507)中所述制备。血小板裂解物优选通过在每个冷冻阶段使用液氮的4次冷冻/解冻循环制备。步骤(b)中的培养基优选还包含肝素和/或青霉素/链霉亲和素(p/s)。
[0429]
步骤(b)可以还包括用ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α补充培养基。可以使用任何量的ifn
‑
γ，如约100ug/ml至约1000ug/ml。培养基优选补充有500ug/ml。可以使用任何量的tnf
‑
α，如约
1ng/ml至约100ng/ml。培养基优选补充有10ng/ml。步骤(b)优选还包括用ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α补充培养基，持续24小时/一天。步骤(b)更优选还包括用ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α补充培养基，持续24小时/一天，然后在收获mk细胞之前从培养基中去除ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α，持续2天。例如，如果步骤(b)需要约6天，则其优选包括在第4天用ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α补充培养基并在第5和6天去除ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α。如果步骤(b)包括培养mk细胞约6天，传代(重新接种)mk细胞并将它们培养另外约6天，则其优选包括在第10天用ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α补充培养基并在第11和12天去除ifn
‑
γ和/或tnf
‑
α。本领域技术人员可以将此概念应用于上述步骤(b)的其它时序。
[0430]
本发明还提供了一种生成本发明的mk细胞的群体的方法，其仅包括步骤(b)。该方法包括在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养imp细胞。上述所有实施方式同样适用于该方法。
[0431]
从上文的讨论可以清楚地看出，本发明的方法是在临床相关条件下进行的，即在没有痕量内毒素和其它环境污染物的情况下，如脂多糖、脂肽和肽聚糖等。这使得本发明的mk细胞特别适合施用于受试者。
[0432]
mnc优选从受试者或同种异体供体获得。本发明还提供了一种生成本发明的群体的方法，其适合施用于受试者，其中该方法包括(a)在诱导mnc分化为imp细胞的条件下培养从受试者获得的mnc，以及(b)在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为适合施用于受试者的mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养imp细胞。本发明还提供了一种生成适合施用于受试者的本发明的群体的方法，其中该方法包括在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为适合施用于受试者的mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养来源于受试者的imp细胞。该群体对于受试者将是自体的，因此在植入时不会被排斥。本发明还提供了一种本发明的群体，其适合施用于受试者并以这种方式生成。
[0433]
可替代地，本发明还提供了一种生成适合施用于受试者的本发明的群体的方法，其中该方法包括(a)在诱导mnc分化为imp细胞的条件下培养从不同的受试者获得的mnc，以及(b)在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为适合施用于受试者的mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养imp细胞。本发明还提供了一种生成适合施用于受试者的本发明的群体的方法，其中该方法包括在低氧条件下和在允许imp细胞粘附并分化为适合施用于受试者的mk细胞的条件下，在包含一种或多种核糖核苷、一种或多种脱氧核糖核苷和血小板裂解物的培养基中培养来源于不同的受试者的imp细胞。该群体对于受试者将为同种异体的。有充分证据表明同种异体的中胚层细胞在人类受试者中是安全的(anastasiadis等j cardiovasc transl res.2016年6月；9(3):202
‑
13)。本发明还提供了一种本发明的群体，其适合施用于受试者并以这种方式生成。
[0434]
体外方法
[0435]
本发明的mk细胞或群体可以用于调节免疫细胞的活性的体外方法。具体地，本发明提供了一种引发nk细胞的群体的体外方法，包括：在增加nk细胞的活性的条件下，将nk细
胞的群体与本发明的mk细胞的群体一起孵育。该方法优选增加nk细胞的细胞毒活性。测量细胞毒性的方法公开于上文。该方法可以进一步增加nk细胞的增殖。换言之，引发优选包括增加nk细胞的细胞毒性和/或增殖。可以在孵育期间或之后评估nk细胞的活性。
[0436]
该方法还可以包括将mk细胞和nk细胞与引发/激活nk细胞的试剂(如白细胞介素
‑
18(il
‑
8))一起孵育。其它此类试剂是本领域已知的。
[0437]
nk细胞的群体可以包含任何数量的nk细胞，包括上文参照本发明的mk细胞所讨论的任何数量。
[0438]
nk细胞通常为颗粒状淋巴细胞。这可以使用标准显微镜技术来确定。nk细胞的直径通常为约10μm至约30μm，如直径为约14μm至约20μm。
[0439]
nk细胞优选在其表面上表达低但可检测水平的cd56(也称为cd56
暗
(cd56
dim
))。nk细胞可以在其表面上表达可检测水平的cd56(也称为cd56
亮
(cd56
bright
))。
[0440]
nk细胞优选在其表面上表达可检测水平的cd16(也称为cd16
亮
)。nk细胞可以在其表面上表达低但可检测水平的cd16(也称为cd16
暗
)。
[0441]
nk细胞优选在其表面上不表达可检测水平的cd3(也称为cd3
‑
)。
[0442]
nk细胞优选在其表面上不表达可检测水平的tcr(也称为tcr
‑
)。nk细胞优选在其表面上不表达可检测水平的tcrαβ。nk细胞优选在其表面上不表达可检测水平的tcrγδ。
[0443]
nk细胞优选为cd56
暗
/cd16
亮
，并且更优选为cd56
暗
/cd16
亮
/cd3
‑
/tcr
‑
。
[0444]
nk细胞可以是cd56
亮
/cd16
暗
，并且更优选为cd56
亮
/cd16
暗
/cd3
‑
/tcr
‑
。
[0445]
nk细胞通常还在其表面上表达可检测水平的一种或多种激活受体。激活受体结合至存在于感染或转化细胞上的靶标配体并激活nk细胞。在本发明的上下文中，通过这些受体的nk细胞的激活可以对应于细胞增殖和/或细胞毒活性的增加。这两者都可以使用本领域的标准方法来测量。激活受体可以刺激或增加nk细胞的增殖和/或细胞毒活性，如当它与其靶标配体结合时。下表3汇总了可以由nk细胞表达的一种或多种激活受体及其靶标配体。
[0446]
表3
‑
nk激活受体基因、它们的受体产物和这些受体产物识别的靶标配体(hla＝人类白细胞抗原)
[0447]
[0448][0449]
nk细胞可以在其表面上表达可检测水平的任何数量和任何组合的这些激活受体。在这种情况下，可检测水平意指超过5％的nk细胞的群体表达相关受体。
[0450]
nk细胞通常还在其表面上表达可检测水平的一种或多种抑制受体。抑制受体在与其靶标配体结合时抑制nk细胞的激活。下表4汇总了可以由nk细胞表达的一种或多种抑制受体及其靶标配体。
[0451]
表4
‑
nk抑制受体基因、它们的受体产物和这些受体产物识别的靶标配体(hla＝人类白细胞抗原)
[0452][0453]
nk细胞可以在其表面上表达可检测水平的任何数量和任何组合的这些抑制受体。在这种情况下，可检测水平意指超过5％的nk细胞的群体表达相关受体。
[0454]
nk细胞优选为人类的。nk细胞来源于上述任何动物。人类nk细胞通常来源于人类受试者。人类nk细胞可以以任何方式衍生。人类nk细胞可以从人类受试者的外周血中分离。这样处理的方法是本领域已知的。例如，白血球/白细胞可以从外周血中分离，而nk细胞可基于其表面上的标记物分离或选择。可以使用上文讨论的任何标记物，如cd56
亮
/cd3
‑
。从外周血中分离的白血球/白细胞可以进行免疫磁珠选择。
[0455]
nk细胞可以从cd34

造血祖细胞生成。cd34

造血祖细胞可以从外周血或骨髓中分离。可替代地，cd34

造血祖细胞是可商购的，例如从promocell购得。cd34

造血祖细胞能够使用白细胞介素
‑
15(il
‑
15)分化为nk细胞。
[0456]
nk细胞可以来源于人诱导多能干(ips)细胞。可以基于一种或多种用于诱导多能性的转录因子的存在来鉴定此类细胞。此类转录因子包括但不限于oct
‑
3/4、sox1、sox2、
sox3、sox15、sox18、klf2、klf4、c
‑
myc、n
‑
myc、l
‑
myc、nanog、lin28和glis1。此类细胞还可以包括用于递送此类转录因子的机制的证据。
[0457]
nk细胞可以是自体的。换言之，该细胞可以来源于将向其施用细胞的受试者。nk细胞优选为同种异体的。换言之，该细胞优选来源于不同的受试者。自体nk细胞或同种异体nk细胞对人类受试者的施用已有充分的记录。
[0458]
然后可以使用本领域已知的方法体外培养分离的nk细胞。白细胞介素
‑
2(il
‑
2)可以用于诱导nk细胞的分化和增殖。抗cd3抗体也可以用于增加il
‑
2引起的nk细胞体外扩增。因此，nk细胞可以在包含il
‑
2和任选的抗cd3抗体的培养基中培养。这种抗体是本领域技术人员可获得的。培养基还可以包含il
‑
15。该培养基还可以包含il
‑
1、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
12和肿瘤坏死因子(tnf)中的一种或多种。
[0459]
nk细胞可以与辅助细胞一起培养，以提供额外的信号来促进增殖。合适的辅助细胞包括但不限于辐照ebv转化的淋巴母细胞样细胞(lymphoblastoid cell)、hfwt(wilm瘤衍生细胞系)和bcr
‑
abl1慢性骨髓性白血病细胞系k652。
[0460]
nk细胞可以是nk细胞系，如nk
‑
92(gong；jh,maki；g,klingemann；hg,characterization of a human cell line(nk
‑
92)with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells,leukaemia,第8卷，第4期,1994,第658
‑
658页)或khyg
‑
1(yagita；m,huang；cl,umehara；h,matsuo；y,tabata；r,miyake；m,konata；y,takatsuki；k,a novel natural killer cell line(khyg
‑
1)from a subject with aggressive natural killer cell leukemia carrying a p53 point mutation,leukaemia,第14卷，第5期,2000,第922
‑
930页)。
[0461]
mk细胞和nk细胞可以孵育持续任何时间段。该时间段可以是从约30秒到约3天的任何时间。例如，该时间段可以是约30秒、约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约8小时、约12小时、约1天、约2天或约3天。mk细胞和nk细胞优选孵育持续一天。
[0462]
mk细胞和nk细胞可以在插入物中孵育。mk细胞和nk细胞可以在mk细胞培养基(见上文)或nk细胞培养基(见上文)中孵育。
[0463]
引发的nk细胞
[0464]
本发明还提供了使用本发明引发/激活的nk细胞的群体。引发的nk细胞的活性增加。nk细胞的细胞毒活性优选增加。上文公开了测量它的方法。nk细胞的增殖可以增加。nk细胞可以是上文讨论的任何细胞。引发的nk细胞的群体可以包含任何数量的nk细胞，包括上文参照本发明的mk细胞所讨论的任何数量。
[0465]
体内方法
[0466]
本发明的mk细胞或群体可以用于调节免疫细胞的活性的体内方法。具体地，本发明提供了一种引发nk细胞的群体的体内方法，包括：在增加受试者的nk细胞的活性的条件下，向受试者施用本发明的mk细胞的群体或包含mk细胞的群体的本发明的药物组合物。细胞的剂量、药物组合物的剂量和给药途径在下面更详细地讨论。
[0467]
nk细胞可以如上所述从受试者中提取并分离。该方法优选增加nk细胞的细胞毒活性。测量它的方法公开于上文。该方法可以增加nk细胞的增殖。
[0468]
药物组合物与施用
[0469]
本发明还提供了一种药物组合物，包含：(a)本发明的mk细胞的群体和(b)药学上可接受的载体或稀释剂。mk细胞的群体可以是上文讨论的任何一种。药物组合物还可以包含nk细胞的群体。nk细胞可以是上文讨论的任何一种，包括上文讨论的未引发的nk细胞的群体或本发明的引发的nk细胞的群体。mk细胞和nk细胞可以以任何比例存在。mk细胞和nk细胞优选以大约相等的比例存在，例如约1：约1。其它比例，包括但不限于约1：约2，约1：约3，约1：约5，约1：约10，约1：约20，约1：约50，约1：约100或更多，也被本发明所设想。上文和下文讨论了合适的细胞数。
[0470]
本发明还提供了一种药物组合物，包含：(a)本发明的引发的nk细胞的群体和(c)药学上可接受的载体或稀释剂。引发的nk细胞的群体可以是上文讨论的任何一种。药物组合物还可以包含本发明的mk细胞的群体。该细胞可以是上文讨论的任何比例。
[0471]
可以使用任何合适的方法配制本发明的各种组合物。可以使用制药领域的常规方法进行细胞与标准药学上可接受的载体和/或赋形剂的配制。制剂的确切性质将取决于若干因素，包括待施用的细胞和所需的给药途径。合适的制剂类型在remington's pharmaceutical sciences，第19版，mack publishing company，宾夕法尼亚东部，美国中有完整描述。
[0472]
可以配制细胞以使得它们可以通过任何途径给药。合适的途径包括但不限于静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、心内膜心肌的、心外膜心肌的、心室内、冠状动脉内、逆行冠状窦的、动脉内、心包内、骨内或肺内途径。细胞也可以直接施用于感兴趣的组织，如肝、肾或肺组织。可以将细胞直接施用至肿瘤中。
[0473]
组合物可以与生理学上可接受的载体或稀释剂一起制备。通常，此类组合物被制备为细胞的液体悬浮液。细胞可以与药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如为水、盐水、右旋糖、甘油、类似物及其组合。
[0474]
此外，如果需要，本发明的药物组合物可以含有少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂和/或增强效力的佐剂。该组合物优选包含人血清白蛋白。
[0475]
一种合适的载体或稀释剂为plasma
‑
lyte这是一种用于静脉内施用的无菌、无热原的等渗溶液。每100ml含有：526mg氯化钠，usp(nacl)；502mg葡萄糖酸钠(c6h11nao7)；368mg三水乙酸钠，usp(c2h3nao2
·
3h2o)；37mg氯化钾，usp(氯化钾)；以及30mg氯化镁，usp(mgcl2
·
6h2o)。它不含抗菌剂。用氢氧化钠调节ph值。ph值为7.4(6.5至8.0)。
[0476]
mk细胞可以包含在一种或多种脂质体和/或一种或多种微泡内。合适的脂质体是本领域已知的。合适的脂质体公开于，例如akbarzadeh等nanoscale research letters 2013,8:102和meghana等international journal of pharmaceutical and chemical sciences,2012,1(1):1
‑
10。下文参照微泡讨论用于形成脂质体的合适的脂质。
[0477]
微泡、它们的形成和生物医学用途是本领域已知的(例如sirsi和borden,bubble sci eng technol.2009年11月；1(1
‑
2):3
–
17)。微泡为直径小于1毫米且直径大于1微米的气泡。本发明中使用的微泡的直径优选为8μm或更小，如7μm或更小的直径，6μm或更小的直径，5μm或更小的直径，4μm或更小的直径，3μm或更小的直径或2μm或更小的直径。微泡可以由任何物质形成。微泡的一般组成为由壳稳定的气核。该气核可以包含空气或重气，如全氟化碳、氮气或全氟丙烷。重气水溶性较差，所以不太可能从微泡中泄漏而导致微泡溶解。具
有重气核的微泡通常在循环中持续更长时间。该壳可以由任何材料形成。壳材料优选包含蛋白质、表面活性剂、脂质、聚合物或其混合物。
[0478]
细胞可以以与剂量制剂相容的方式施用并且以这样的量将是治疗有效的。施用量取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统的能力和修复所需的程度。需要施用的细胞的精确的量可以取决于执业医师的判断并且可以是每个受试者所特有的。
[0479]
可以将任何合适数量的细胞施用于受试者。例如，可以按每kg受试者至少约0.2
×
106、约0.25
×
106、约0.5
×
106、约1.5
×
106、约4.0
×
106或约5.0
×
106个细胞施用。例如，可以施用至少约105、约106、约107、约108、约109个细胞。作为指导，待施用的本发明的细胞数可以是约105至约109，优选约106至约108。通常，将多达约2
×
108个细胞施用于每个受试者。可以施用上文参照本发明的群体所讨论的任何具体数字。
[0480]
在施用或存在细胞的这种情况下，培养基可以存在以促进细胞的存活。在某些情况下，本发明的细胞可以以冷冻等分试样提供，并且如dmso的物质可以存在以促进冷冻期间的存活。此类冷冻细胞通常会被解冻，然后置于缓冲液或培养基中用于维持或施用。特定的冷冻保存培养基也可以商购获得，如商购自biolife solutions的并且有证据表明，这些培养基中包含的细胞能够在解冻后直接施用于受试者。
[0481]
药物、方法和治疗用途
[0482]
本发明的mk细胞可以用于人体或动物体的治疗方法。因此，本发明提供了本发明的mk细胞、本发明的mk细胞的群体或本发明的药物组合物，用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。
[0483]
本发明的引发的nk细胞可以用于人体或动物体的治疗方法。本发明提供了本发明的引发的nk细胞的群体或本发明的药物组合物，用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。
[0484]
本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括：向受试者施用(a)本发明的mk细胞的群体，(b)本发明的引发的nk细胞的群体或(c)本发明的药物组合物。本发明提供了用于治疗受试者的癌症的(a)本发明的mk细胞的群体，(b)本发明的引发的nk细胞的群体或(c)本发明的药物组合物。本发明提供了(a)本发明的mk细胞的群体，(b)本发明的引发的nk细胞的群体或(c)本发明的药物组合物在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
[0485]
mk细胞的群体可以是上文讨论的任何一种。nk细胞的群体可以是上文讨论的任何一种。该药物组合物可以是上文讨论的任何一种并且可以包括(i)本发明的mk细胞的群体，(ii)本发明的引发的nk细胞的群体，(iii)本发明的mk细胞的群体和(任何)nk细胞的群体或(iv)本发明的mk细胞的群体和本发明的引发的nk细胞的群体。
[0486]
癌症可以是任何癌症。癌症可以是恶性肿瘤(carcinoma)、肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤或白血病。优选地，癌症为肛门癌、胆道癌(胆管癌)、膀胱癌、血癌、骨癌、肠癌、脑肿瘤、乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、内分泌肿瘤、眼癌(如眼黑色素瘤)、输卵管癌、胆囊癌、头和/或颈癌、卡波氏肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴结癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、阴茎癌、原发性腹膜癌、前列腺癌、腹膜假黏液瘤、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓瘤、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、气管癌、不明原发癌、阴道癌、外阴癌或子宫内膜癌。白血病优选为急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、
慢性淋巴细胞性白血病或慢性髓性/骨髓性白血病。淋巴瘤优选为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。癌症优选为原发性癌症或继发性癌症。癌症优选为慢性骨髓性白血病或浆细胞骨髓瘤。癌症优选为乳腺癌。
[0487]
该方法还可以涉及施用本发明的mk细胞的群体和nk细胞的群体，如本发明的引发的nk细胞的群体两者。在这些情况下，mk细胞和nk细胞可以同时(如在相同的药物组合物中)、依次或分开施用。mk细胞可以在nk细胞之前或之后施用。例如，mk细胞可以在施用nk细胞之前或之后约1天至约28天，如约3天至约25天、约6天至约22天、约9天至约18天或约12天至约15天施用于受试者。mk细胞可以在施用nk细胞之前或之后多达约1天、多达约2天、多达约3天、多达约4天、多达约5天、多达约6天、多达约7天、多达约8天、多达约9天、多达约10天、多达约11天、多达约12天、多达约13天、多达约14天、多达约15天、多达约16天、多达约17天、多达约18天、多达约19天、多达约20天、多达约21天、多达约22天、多达约23天、多达约24天、多达约25天、多达约26天、多达约27天或多达约28天施用于受试者。上文讨论了合适的细胞数量和mk细胞与nk细胞的比例。
[0488]
本发明的mk细胞的群体、nk细胞的群体和/或药物组合物可以一次施用于受试者。可替代地，本发明的mk细胞的群体、nk细胞的群体和/或药物组合物可以施用于受试者至少约两次，如至少约3次、至少约4次、至少约5次、至少约6次、至少约7次、至少约8次、至少约9次或至少约10次。两次之间的间隔可以是约1天至约28天，如约3天至约25天、约6天至约22天、约9天至约18天或约12天至约15天。优选地，两次之间的间隔约为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。
[0489]
在所有情况下，mk细胞和/或nk细胞优选来源于受试者或同种异体的供体。从受试者得到mk细胞和nk细胞应确保细胞本身不会被受试者的免疫系统排斥。供体和接受者之间的任何差异最终都会导致mk细胞和nk细胞的清除，但在它们已经至少部分治疗疾病之前不会被清除。
[0490]
本发明涉及向受试者施用治疗有效数量的mk细胞和/或nk细胞。治疗有效数量是减轻疾病的一种或多种症状的数量。治疗有效数量优选为治疗疾病的数量。上文更详细地讨论了合适数量的细胞。
[0491]
mk细胞和/或nk细胞可以施用于任何合适的受试者。受试者通常为人类受试者。受试者可以是上述任何动物或哺乳动物。
[0492]
受试者可以是婴儿、青少年或成人。受试者可以已知患有疾病或疑似患有疾病。受试者可以对相关疾病易感或有风险。例如，受试者可以在基因上易患癌症。
[0493]
本发明可以与其它治疗疾病的措施和物质结合使用。在某些情况下，mk细胞和/或nk细胞可以与旨在治疗疾病或减轻疾病的症状或提供疼痛缓解的其它物质同时、依次或分开施用。mk细胞和/或nk细胞可以与现有的疾病治疗联合使用，例如可以简单地与此类治疗混合。因此，本发明可以用于提高现有的疾病治疗的功效。
[0494]
混合组合物
[0495]
本发明的一种或多种mk细胞可以形成包含一种或多种生物相容性纤维和一种或多种本发明的mk细胞的混合组合物的一部分。该一种或多种生物相容性纤维可以是pct/gb2015/051672(公开为wo 2015/189586)中公开的那些中的任一种。混合组合物还可以包含一种或多种nk细胞，如一种或多种本发明的引发的nk细胞。
[0496]
一种或多种本发明的mk细胞可以形成pct/gb2015/051672(公开为wo 2015/189586)中公开的混合组合物的一部分，并且优选作为这种组合物的一部分施用于受试者。具体地，本发明提供了一种混合组合物，其包含：
[0497]
(a)一种或多种生物相容性纤维；
[0498]
(b)一种或多种本发明的mk细胞；和
[0499]
(c)一种或多种生物相容性组分，其(i)将一种或多种mk细胞附着于一种或多种纤维和/或嵌入一种或多种mk细胞和一种或多种纤维和/或(ii)能够将组合物附着至组织。该混合组合物还可以包含一种或多种nk细胞，如一种或多种本发明的引发的nk细胞。
[0500]
以下实施例说明本发明。
[0501]
实施例
[0502]
实施例1
‑
骨髓和mk细胞的扩增(批次clxr
‑
h
‑
17
‑
002rg)
[0503]
将人骨髓样品用hank缓冲盐溶液稀释，并在ficoll
‑
paque上分层，以通过离心分离单核细胞(mnc)。然后将mnc重新悬浮在hank缓冲盐溶液中，并使用0.4％台盼蓝排除试验进行计数以评估细胞活力。将细胞接种(第0天)在具有含有青霉素
‑
链霉素、血小板裂解物和肝素的无核苷mem alpha glutamax(thermofisher；产品代码：32561
‑
102)的培养瓶中，并在37℃、5％co2下孵育。该补充培养基与pct/gb2012/051600(公开为wo 2013/005053)和pct/gb2015/051673(公开为wo 2015/189587)的实施例中使用的相同。
[0504]
在这些实施例中，在所有情况下，如pct/gb2012/051600(公开为wo 2013/005053)和pct/gb2012/052911(公开为wo 2013/076507)中所描述生成血小板裂解物：在每个冷冻阶段使用液氮的4次冷冻/解冻循环。
[0505]
表5
‑
无核苷的mem alpha glutamax的制剂(thermofisher；产品代码：32561
‑
102、32561
‑
029、32561
‑
037或32561
‑
094，取决于国家)
[0506]
[0507][0508]
在第8天，细胞传代(重新接种)并更换培养基。在第12天，细胞传代(重新接种)并更换培养基。
[0509]
在第19天，细胞为imp细胞(pct/gb2015/051673的主题；wo 2015/189587)，并用含有青霉素
‑
链霉素、血小板裂解物和肝素的具有核苷的新培养基mem alpha(thermofisher；产品代码：12571
‑
063；见以下组分)传代(重新接种)，并在37℃、5％co2下孵育。6天后(第25天)，细胞为mk细胞(见图4)，并根据生产商的说明使用细胞解离溶液收获。将细胞在补充有10％二甲亚砜的培养基中冷冻保存至
‑
80℃，并储存于液氮中供以后使用。从该批次(clxr
‑
h
‑
17
‑
002rg)生成的mk细胞称为mk002。
[0510]
表6
‑
具有核苷的mem alpha(thermofisher；产品代码：12571
‑
063、12571
‑
048、12571
‑
071或12571
‑
089，取决于国家)。阴影行显示该组分与表5中无核苷的mem alpha glutamax(thermofisher；产品代码：32561
‑
102、32561
‑
029、32561
‑
037或32561
‑
094，取决于国家)中的组分不同的地方。两种培养基之间某些组分的含量也不同。
[0511]
[0512][0513]
实施例2
‑
骨髓和mk细胞的扩增(批次clxr
‑
h
‑
17
‑
004)
[0514]
使用不同的骨髓样品(并因此不同的批号)重复以上实施例1，仅在细胞传代(重新接种)的时间上有一些差异。将人类mnc(如实施例1中制备的)接种(第0天)在具有含有青霉素
‑
链霉素、血小板裂解物和肝素的αmem glutamax的培养瓶中，并在37℃、5％co2下孵育。如pct/gb2012/051600(公开为wo 2013/005053)中所描述生成血小板裂解物：在每个冷冻阶段使用液氮的4次冷冻/解冻循环。
[0515]
在第8天，细胞传代(重新接种)并更换培养基。在第14天，细胞传代(重新接种)并更换培养基。
[0516]
在第21天，细胞为imp细胞(pct/gb2015/051673的主题；wo 2015/189587)，并用新培养基(含有青霉素
‑
链霉素、血小板裂解物和肝素的具有核苷的mem alpha(thermofisher；产品代码：12571
‑
063；见上述组分))传代(重新接种)，并在37℃、5％co2下孵育。6天后(在第27天)，细胞为mk细胞，并根据生产商的说明使用细胞解离溶液收获。将细胞在补充有10％二甲亚砜的培养基中冷冻保存至
‑
80℃，并储存于液氮中供以后使用。从该批次(clxr
‑
h
‑
17
‑
004)生成的mk细胞称为mk004。
[0517]
实施例3
‑
ht
‑
facs分析
[0518]
高通量荧光激活细胞分选(ht
‑
facs)分析是一种高通量筛选平台，其能够快速表征悬浮细胞的细胞表面表型，目前面板中有～380个细胞表面标记物。此平台经过了广泛验证，并且已经在多种类型的人体组织和细胞上实施。该面板由排列在96孔板中的～380种人类细胞表面特异性抗体组成。
[0519]
目的是确定本发明的人类mk细胞的表面抗原表达谱。将2个批次的mk细胞(mk002和mk004)解冻并接种到实施例1和2中定义的含有具有核苷的补充mem alpha(thermofisher；产品代码：12571
‑
063)的培养瓶中。细胞生长5天，在第2天更换培养基。为了收集细胞，去除培养基并用pbs洗涤细胞两次。用5ml 0.25％的胰蛋白酶处理细胞直至分离。添加培养基(8ml)以灭活胰蛋白酶并收集细胞。细胞以400g离心5分钟。将细胞沉淀(pellets)重新悬浮(单细胞悬浮液)在总共5ml的hbss中(减去钙/镁的hank平衡盐溶液，补充有2mm edta和1％bsa)。通过使用排除染料(0.2％台盼蓝)，将样品的一份等分试样(10μl)用于确定活细胞的总数。
[0520]
将100μl样品装入每个孔中(每孔约40,000个细胞，确保在facs中收集10,000至20,000个项目)。样品在用bd高通量采样器(自动采样器)升级的bd facsdiva中运行。使用flowjo软件进行流式细胞术数据的分析。结果以图形和包含每种抗体的阳性细胞百分比的excel电子表格提供。
[0521]
表7
‑
显示表达每种细胞表面标记物的细胞的百分比的ht
‑
facs分析结果(*呈现了来自pct/gb2016/052447(公开为wo2017025729)的iomp细胞、imp细胞和bm
‑
msc(lonza)的相应数据)
[0522]
[0523]
[0524]
[0525]
[0526]
[0527]
[0528]
[0529]
[0530][0531]
实施例4
‑
mk细胞毒性
[0532]
对于mk细胞毒性，将2个批次的mk细胞(mk002和mk004)解冻并接种到实施例1和2中定义的含有具有核苷的补充mem alpha(thermofisher；产品代码：12571
‑
063)的6孔板中，一式三份。细胞在收获前生长3天(如实施例1和3中所述)。将mk细胞用cr释放测定培养基(aim)洗涤并在cr释放测定培养基中重新悬浮，然后接种在96孔板上，以10:1的所需e:t比暴露于靶细胞k562(慢性骨髓性白血病)和u266(浆细胞骨髓瘤)。将板应用于标准的4小时cr释放测定以评估杀伤活性。如pct/gb2015/051673；wo 2015/189587中所述制备与mk002和mk004相同批次的imp细胞(使用与实施例1和2相同的方法，除了在最后的培养步骤中补充αmem glutamax没有被具有核苷的补充mem alpha替代外)并将其用作对照。细胞毒性结果如图1所示。与imp细胞相比，mk细胞显示出显著增加的细胞毒性。
[0533]
实施例5
‑
nk细胞的mk引发
[0534]
为了nk引发，将2个批次的mk细胞(mk002和mk004)解冻并一式三份接种在实施例1和2中定义的含有具有核苷的补充mem alpha(thermofisher；产品代码：12571
‑
063)的6孔板中。细胞生长2天，然后去除培养基，并用温热的hbss冲洗细胞单层一次。将nk特异性培养基(gm.1或x
‑
vivo 10)添加到单层中。将nk细胞添加到放置在孔内的transwell插入物中，并且将单独培养的nk细胞用作对照。将板孵育1天。收获nk细胞，用cr释放测定培养基(aim)
洗涤并在cr释放测定培养基中重新悬浮，然后接种在96孔板上，以10:1的所需e:t比暴露于靶细胞k562(慢性骨髓性白血病)、rpmi
‑
8226(浆细胞骨髓瘤)和u266(浆细胞骨髓瘤)。将板应用于标准的4小时cr释放测定以评估杀伤活性。nk引发结果在图2和3中示出。mk细胞引发了nk细胞并增加了它们的细胞毒性。
[0535]
实施例6
‑
mnc和c14、cd34和cd45
[0536]
使用流式细胞术评估来自批次clxr
‑
h
‑
17
‑
002rg和clxr
‑
h
‑
17
‑
004的mnc对cd14、cd34和cd45的表达。用nucleocounter对细胞计数，并以1％bsa/pbs溶液制备以具有2
×
105个细胞/25μl。使用以下试剂。
[0537]
表8
‑
流式细胞术试剂
[0538]
试剂生产商产品编号分子生物学用水sigma
‑
aldrichw4502
‑
1l抗体：cd45 per&d systems来自试剂盒：fmc002同型对照：pe igg1小鼠r&d system来自试剂盒：fmc002抗体：cd34 percpbdref:345803同型对照：percp小鼠igg1
‑
kbd550672抗体：cd14 fitcbd pharmingen555397同型对照：fitc igg2abd pharmingen555573nucleocassetteschemometec941
‑
00015ml fac管falcon35205450ml离心管vwr21008
‑
178
[0539]
表9
‑
批次002的汇总结果
[0540]
抗体％mnccd14 13.2％cd34 6.17％cd45 77.3％
[0541]
表10
‑
批次004的汇总结果
[0542]
抗体％mnccd14 7.59％cd34 5.1％cd45 81.5％
[0543]
实施例7
‑
ifn
‑
γ和tnf
‑
α处理的mk细胞的ht
‑
facs分析
[0544]
使用mk004重复实施例3，并在生长5天中的第2天更换培养基时向培养基中加入500ug/ml ifn
‑
γ或10ng/ml tnf
‑
α。用ifn
‑
γ或tnf
‑
α处理1天后，再次更换培养基以去除ifn
‑
γ或tnf
‑
α。在第5天，如实施例3中所述收集并测试细胞。本发明的特异性标记物的结果显示在下表11中。
[0545]
表11
‑
显示在ifn
‑
γ或tnf
‑
α刺激后表达每种细胞表面标记物的mk004细胞的百分比的ht
‑
facs分析的结果。未处理的值取自实施例3。
[0546]
[0547]
[0548][0549]
实施例8
‑
来自额外批次的mk细胞的生成
[0550]
使用如下3个额外批次重复实施例1和2(批次根据其来源的骨髓样本进行编号或命名)：
[0551]
‑
clxr
‑
h
‑
17
‑
001rg生成mk001
[0552]
‑
clxr
‑
h
‑
17
‑
006rg生成mk006
[0553]
‑
pc生成mkpc。
[0554]
实施例9
‑
mk细胞的分泌组(secretome)分析
[0555]
目的为确定本发明的人类mk细胞的分泌组谱。将5个不同批次的mk细胞(mk001、mk002、mk004、mk006和mkpc)解冻并接种到实施例1和2中定义的含有具有核苷的补充mem alpha(thermofisher；产品代码：12571
‑
063)的培养瓶中。细胞生长5天，在第2天更换培养基(未处理的)。在替代实施例中，当在第2天更换培养基时，向培养基中加入500ug/ml ifn
‑
γ或10ng/ml tnf
‑
α(ifn
‑
γ处理的或tnf
‑
α处理的)。用ifn
‑
γ或tnf
‑
α处理1天后，再次更换培养基以去除ifn
‑
γ或tnf
‑
α。
[0556]
在所有情况下，在第5天收集条件培养基。使用(基于珠的)细胞因子谱(人类48
‑
plex格式)测量每个样品中groa、il
‑
12、il
‑
2ra、il
‑
8、可溶性trail和il
‑
6的水平。将样品加入至含有与针对每种细胞因子/趋化因子或生长因子的抗体偶联的磁珠的96孔板中。从每个孔中捕获荧光信号并确定浓度。
[0557]
将实验完成一次。所有5个批次的结果(平均值
±
sem)在图5
‑
10中示出(除了上面图例中描述的图8以外)。本发明的mk细胞分泌可检测水平的所有测试的细胞因子。ifn
‑
γ
刺激显著增加了il
‑
2ra的分泌并显著降低了il
‑
8的分泌。tnf
‑
α刺激显著增加了groa和il
‑
8的分泌。
[0558]
实施例10
‑
用于气囊模型的卡拉胶
[0559]
目的为使用卡拉胶气囊模型确定本发明的mk细胞将免疫细胞吸引至炎症部位的能力。
[0560]
在麻醉下，在小鼠(免疫活性balb/c)背部注射无菌空气。将小鼠放置4
‑
5天以使得气囊形成，并且如果需要，则将气囊在中间重新充气。将0.5ml的1％卡拉胶(一种炎症诱导剂)注射到每个气囊中并放置若干个小时，以使得炎症反应发展。然后用未处理的本发明的mk细胞、ifn
‑
γ处理的本发明的mk细胞或tnf
‑
α处理的本发明的mk细胞(均来自批次mk006)处理气囊，并且如实施例8和9中所述进行制备。每只小鼠每个气囊接受在0.2ml生理盐水中的100万个mk细胞。未处理对照(仅卡拉胶对照)。
[0561]
通过注射磷酸盐缓冲盐水(pbs)将气囊穿孔，轻揉以混合细胞并用额外的pbs洗涤以提取所有细胞。使用facs分析提取的细胞，并且确定存在的nk细胞和单核细胞的百分比。实验重复五次(每个处理5个气囊)。
[0562]
结果在图11和12中示出。本发明的ifn
‑
γ处理的mk细胞显著增加了气囊中nk细胞和单核细胞的百分比。
[0563]
实施例11
‑
nk细胞的mk引发
[0564]
使用来自批次mk002和mk004的未处理的mk细胞、原代nk细胞和k562(慢性骨髓性白血病)重复实施例5的方法3次(n＝3)。结果在图13中示出。mk细胞引发了原代nk细胞并显著增加了它们的细胞毒性。
[0565]
实施例12
‑
mk细胞毒性
[0566]
对4批不同批次的本发明的mk细胞(mk002、mk004、mk006、mkpc)和乳腺癌细胞系mcf7以10:1的所需e:t比重复实施例4的方法两次(n＝2)。细胞毒性结果在图14中示出。来自所有批次的mk细胞都显示出对mcf7的细胞毒性。
[0567]
实施例13
‑
mk细胞对颗粒酶和穿孔素的表达
[0568]
使用rneasy试剂盒(qiagen)从批次mk004的mk细胞中分离rna。使用cdna合成试剂盒(roche)合成cdna。使用在特定热谱中的颗粒酶b(gzmb)、h(gzmh)、m(gzmm)、a(gzma)和k(gzmk)以及穿孔素的特异性引物以扩增扩增子。扩增子产物在2％凝胶上电泳，并使用etbr检测条带。证实了mk细胞表达gzmb、gzmh、gzmm、gzma和gzmk以及穿孔素(数据未示出)。
[0569]
还使用rneasy试剂盒从来自单独培养的(单培养：mc)批次mk004的mk细胞或与rpmi
‑
8226细胞以10:1的所需e:t比共培养(共培养：cc)6小时、12小时和24小时后的mk细胞中分离出rna。使用cdna合成试剂盒(roche)合成cdna。使用sybr green主混合物检测gzmb、gzmh、gzmm、gzma、gzmk、穿孔素和gadph的定量pcr信号。相对于mc，在cc条件下确定了每个基因表达的倍数变化，并且结果在图15
‑
20中示出(对于mc和cc在每个时间点的每个rna，n＝2)。gzm和穿孔素值归一化为gadph值。研究了每次获得的cc相对于mc的值(cc
‑
mc)。为了获得倍数变化(fc)值，应用了下式：2^(
‑
(cc
‑
mc))。大于1的值表明cc相对于mc增加了基因的表达。如图15
‑
20所示，与rpmi
‑
8226细胞的共培养增加了gzmb、gzmh、gzmm、gzma、gzmk和穿孔素的表达。
[0570]
实施例14
‑
使用egta抑制mk细胞的细胞毒性
[0571]
egta为颗粒胞吐作用的非特异性抑制剂。将来自三批(mk002、mk004和mk006)的mk细胞用不同浓度的egta(0.5mm、1.0mm、2.0mm)预处理24小时，用无菌hbss冲洗并暴露于mcf7细胞(以所需的5:1的e:t比)另外的24小时，并使用铬释放测定(如实施例4和12中所述)评估它们的杀伤活性。如图21所示，egta显著降低了所有三批mk细胞的细胞毒性。这表明颗粒胞吐作用在mk细胞的细胞毒性中至少有部分作用。
[0572]
实施例15
‑
使用sirna抑制mk细胞的细胞毒性
[0573]
使用lipofectamine rnaimax，将来自批次mk004和mk006的mk细胞用25pm的针对cd178/fasl(sifasl)或cd253/trail(sitrail)的特异性sirna或乱序/非靶向(nt)sirna处理。48小时后，使用无菌hbss洗涤细胞并暴露于mcf7细胞(以所需的5:1的e:t比)再持续24小时，并使用铬释放测定(如实施例4和12中所述)评估它们的杀伤活性。分析来自一式三份(每种条件3个孔)。结果在图22中示出。trail的抑制显著降低了mk006的细胞毒性(与乱序/nt sirna相比)，这表明该表面标记物在mk细胞的细胞毒性中的作用。