一种两亲性荧光染料及其合成方法和应用与流程

1.本发明涉及一种两亲性荧光染料及其合成方法和应用。


背景技术：

2.荧光染料技术是目前人类深入探究生命内部各类化学组成、生物分子及组织结构的功能作用，了解人体运行规律的有力武器。荧光染料的开发一般都要求荧光团具有较高的荧光量子效率和较好的生物相容性和稳定性，同时,为了避免生物样品基体中自身荧光的强烈干扰，具有优良性能的生物荧光探针分子的荧光发射波长一般在近红外波段(780～1100nm)，且受周围环境的影响较小。
3.荧光染料一般都具有较大的芳香环，由于疏水作用，相当多的荧光染料难溶于水，致使荧光染料的许多重要优势都没办法在水体系中发挥作用。至今只有少数研究完全解决了水溶性问题，通常采用的方法包括：引入离子型亲水基团、引入中性亲水基团、引入两亲性自组装等。
4.目前常见的荧光染料主要包括花菁类、bodipy类、罗丹明类、卟啉类、荧光素类等。但是，花菁类染料光稳定性表现较差；bodipy类的染料分子的水溶性较低、发色团的波长范围较窄；罗丹明类染料吸收和发射波长离红外区有较大距离，不适用于生物体荧光成像分析；荧光素类荧光效应极易受溶液酸碱度的影响，最大吸收和发射波长较小，样品背景干扰严重，碱性条件下，水溶性太好而脂溶性较差，限制了其在生物体中的应用，stokes位移较小，使得检测方法灵敏度降低。
5.两亲性荧光染料报道最多的是2,6
‑
二苯基
‑4‑
(2,4,6
‑
三苯基吡啶)，虽然分子中存在亲水性的阴阳离子基团，然而其在水溶液中的溶解度仅在10
‑6m左右；walker等人报道了一种两亲性的花菁染料在范德华力和疏水作用力下自聚集形成双壁管状聚集体，亲水的磺酸基朝外，疏水基团在内(j.phys.chem.c,2011,115,2470
‑
2475)；wurthner等报道了一些含多胺的荧光染料，将多胺部分质子化可以得到水溶性极好的染料(chem.eur.j.2010,16,3372
‑
3382)；huang小组设计合成了一种阴离子表面活性剂荧光探针，但是处于疏水链尾端的突光基团在胶束形成过程中会包埋在非极性的内核当中，其荧光各向异性的改变对胶束的生长过程及其敏感(chem.mater.2008,20,3814
‑
3820)；ernst小组报道了一种多轻基取代的功能型荧光表面活性剂，亲水基团是多枝羟基链，发光基团是苝核，疏水基团是两条烷基链(adv.funct.mater.2012,22,3921
‑
3926)。现有的两亲性荧光染料在水中会发生自组装成纳米结构，这种纳米组装体由于尺寸较大，难以穿过细胞膜。
6.综上，现有的荧光染料都具有以下缺点：
7.(1)合成工艺复杂，经常涉及无水无氧的苛刻反应条件。
8.(2)目前常用的亲水修饰基团存在各自的缺陷，离子型修饰基团极易无选择性地与血液及组织结构中存在的各类带电离子和非电中性物质发生强烈结合；中性修饰基团存在分子尺寸不易控制、产物不易分离、染料稳定性差、制备成本高昂、易受带电离子干扰等弊端；两亲性自组装方法则对染料结构要求苛刻。
9.(3)上述修饰方法对于具有大共轭平面的近红外探针水溶性提升效果极为有限。
10.(4)现有的两亲性荧光染料在水中会发生自组装成纳米结构，这种纳米组装体由于尺寸较大，难以穿过细胞膜。
11.所以现有的两亲性荧光染料无法用于活细胞染色。


技术实现要素：

12.本发明针对上述现有技术所存在的不足，提供了一种两亲性荧光染料及其合成方法和应用。
13.荧光素是一种氧杂蒽类结构的染料分子，其最早通过以邻苯二甲酸酐和间苯二酚为底物的傅克酰基化和环化脱水反应获得，它的水溶性较好、同时具有高的摩尔消光系数和量子产率的优点，通过衍生化的方式，修饰荧光素上所连基团，可以改善荧光素的光谱性质和脂溶性，对于开发一种新型的荧光染料分子是极其有意义的，其在酸性与碱性条件下有不同的存在形式。
[0014][0015]
荧光素在酸碱性条件下的变化
[0016]
本发明通过使用常见的pd催化suzuki偶联反应，将苯基引入荧光素中，从而使其达到改性的目的。本发明设计合成的两亲性荧光染料，表观油水分配系数接近1，可以方便的穿过细胞膜，可用于活细胞染色，具有优异的生物应用价值，并且所得染料的最大吸收和发射波长有效地产生了红移，而且具有较高的荧光量子产率。此外，本发明的荧光染料与蛋白质有较强的结合，具有一定的细胞内定位能力。
[0017]
本发明两亲性荧光染料，其结构通式如下所示：
[0018][0019]
上述通式中：r为氢、烷基、烯基、羟基、氨基、酰基、取代或未取代的苯基或其他芳香基。
[0020]
本发明两亲性荧光染料的合成方法，是通过pd催化suzuki偶联反应将苯基引入荧光素中，从而使其达到改性的目的。具体包括如下步骤：
[0021]
将一定量的取代荧光素或荧光素钠盐、催化剂、取代苯硼酸溶解在溶剂中，再加入
溶于二氯甲烷中的醋酸钯，在40摄氏度加热条件，搅拌反应5小时；反应结束后体系冷却至室温，盐酸酸化后，用乙酸乙酯/水体系萃取至有机相，无水硫酸钠干燥，将所得粗产品分离提纯得到目标产物。
[0022]
取代苯硼酸的用量为取代荧光素或荧光素钠盐的4倍及以上当量，醋酸钯的用量为取代荧光素或荧光素钠盐的0.5％及以上当量。
[0023]
所述取代荧光素的结构式如下所示：
[0024][0025]
所述取代苯硼酸的结构式如下所示：
[0026][0027]
上述结构式中：x为碘或溴；r为氢、烷基、烯基、羟基、氨基、酰基、取代或未取代的苯基或其他芳香基。
[0028]
本发明中，pd催化偶联反应以其简便、高效的特性著称，广泛地应用于有机合成的各个领域，本发明通过使用常见的pd催化suzuki偶联反应，使用水、乙醇等五毒低毒溶剂，将苯基引入荧光素中，从而使其达到改性的目的。
[0029]
本发明所用原料易得，仅对底物进行简单修饰，不需要引入各种复杂基团，没有各种长链的烷基或醚键的加入，没有其他阴阳离子的加入，可以避免由于各种复杂基团而引起的不良反应。
[0030]
本发明的合成过程中，反应溶剂可为水、乙醇、四氢呋喃、乙二醇二甲醚、甲苯等适宜suzuki反应的其他溶剂或混合溶剂。
[0031]
本发明的合成过程中，反应所用催化剂可为碳酸钾、碳酸钠等适宜suzuki反应的其他催化剂。
[0032]
本发明的合成过程中，反应所涉及的苯硼酸还可为苯硼酸衍生物或其他芳香体系。
[0033]
本发明两亲性荧光染料的应用，是用于制备生物成像过程中的荧光染料。所述荧光染料能够直接穿过细胞膜进入细胞，实现活细胞染色；此外，所述荧光染料与蛋白质有较强的结合，具有一定的细胞内定位能力。
[0034]
本发明通过pd催化suzuki偶联反应，将苯基引入荧光素中，从而使其达到改性的目的；后续通过表观油水分配系数、荧光偏振法、细胞成像等试验来探究衍生物在生物成像中的应用。
[0035]
本发明设计合成的两亲性荧光染料，在应用中，无需发生两亲性的组装过程，即可实现两亲性要求，表观油水分配系数接近1，表明不论在水相中还是在有机相中，其都有良好的溶解性。因此，本发明设计合成的两亲性荧光染料能够直接穿过细胞膜进入细胞，可用
于活细胞染色。
[0036]
本发明染料的最大吸收和发射波长有效地产生了红移，尽可能减少了外界环境对其影响；荧光偏振实验和与bsa蛋白的结合实验表明，在生物体系中，本发明染料与蛋白质有较强结合，并且蛋白质的加入能有效地提高该分子的荧光强度，具有一定的细胞内定位能力，良好的荧光量子产率和很低的细胞毒性表明其以一种橘黄色荧光的形式展现出了优异的染料性能，因此表其具有优异的生物应用价值。
[0037]
本发明所得染料可直接进入细胞与蛋白质结合，无需附加辅助分子即可完成染色工作。
[0038]
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0039]
1、本发明中，使用常见的pd催化suzuki偶联反应，使用水、乙醇等五毒低毒溶剂，无需采用无水无氧的特殊条件即可达到改性的目的；
[0040]
2、本发明不需要引入各种复杂基团，没有各种长链的烷基或醚键的加入，没有其他阴阳离子的加入，可以避免由于各种复杂基团而引起的不良反应；
[0041]
3、本发明不论在水相中还是在有机相中，其都有良好的溶解性；
[0042]
4、本发明的染料的最大吸收和发射波长有效地产生了红移，尽可能减少了外界环境对其影响；
[0043]
5、本发明染料与蛋白质有较强结合，蛋白质的加入能有效地提高该分子的荧光强度，存在着一定的定位潜力；
[0044]
6、本发明以一种橘黄色荧光的形式展现出了优异的染料性能，表其具有优异的生物应用价值。
附图说明
[0045]
图1是四苯基荧光素的吸收和发射光谱图。从图1中可以看出，四苯基荧光素的最大吸收和发射波长分别为528nm，560nm，相较于荧光素，其吸收波长(480nm)和发射波长(528nm)分别红移了48nm和32nm，相较于四碘荧光素，其吸收(526nm)和发射波长(550nm)分别红移了2nm和10nm。
[0046]
图2(a)不同ph下四苯基荧光素的吸收光谱；(b)不同ph下四苯基荧光素的发射光谱；(c)不同ph下四苯基荧光素的荧光量子产率。从图2中可以看出，在不同ph水溶液中，四苯基荧光素的吸收和发射波长没有明显的变化，但其量子产率呈现出随ph增加而明显增长的趋势，这也符合了该类分子在碱性条件下荧光性质逐渐增强的特性。
[0047]
图3四苯基荧光素的油水分配系数标准曲线。由图3得到拟合标准曲线y＝0.0041x 0.0154。
[0048]
图4四苯基荧光素与bsa蛋白结合的发射光谱图。
[0049]
图5四苯基荧光素与bsa蛋白结合的光谱性质。从图4和图5中可以看出，四苯基荧光素与bsa蛋白结合后，最大吸收波长536nm，最大发射波长556nm。
[0050]
图6四苯基荧光素与bsa蛋白荧光偏振结合曲线。从图6中可以看出，在生物体系中，四苯基荧光素与蛋白质有较强结合，存在着一定的定位潜力
[0051]
图7四苯基荧光素的细胞成像结果。从图7中可以看出，四苯基荧光素以一种橘黄色荧光的形式展现出了优异的染料性能。
具体实施方式
[0052]
以下实施例具体的解释了本发明的内容，包括四苯荧光素的制备方法，四苯荧光素荧光性质检测方法、表观油水分配系数测定方法、荧光偏振法测量四苯基荧光素与蛋白质的相互作用的方法、细胞成像等试验等。
[0053]
1、四苯荧光素的合成
[0054]
本发明四苯荧光素的合成路线如下所示：
[0055][0056]
通式中x为碘或溴，r为氢、烷基、烯基、羟基、氨基、酰基、取代或未取代的苯基或其他芳香基。
[0057]
包括如下步骤：
[0058]
将一定量的取代荧光素或荧光素钠盐、无水碳酸钠、取代苯硼酸溶解在一定量的水和无水乙醇中，再加入溶于二氯甲烷中的醋酸钯，在40摄氏度加热条件，搅拌5小时；将体系冷却至室温，盐酸酸化后，用乙酸乙酯/水体系萃取至有机相，无水硫酸钠干燥后，将所得粗产品分离提纯得到最终产物。
[0059]
实施例1：四苯荧光素的合成
[0060][0061]
在20ml反应瓶中，分别加入88.0mg(0.1mmol)四碘荧光素钠、110.6mg无水碳酸钾、73.1mg苯硼酸，室温条件下分别加入4ml水和4ml无水乙醇，40℃下搅拌，将1mg醋酸钯溶于100μl dcm中，用移液枪将其加入反应瓶中，反应5小时；将体系冷却至室温，盐酸酸化后，用乙酸乙酯/水体系萃取至有机相，无水硫酸钠干燥后，将所得粗产品用柱色谱进行分离提纯，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯，体积比10:1。
[0062]
核磁氢谱数据：1h nmr(cdcl3,400mhz)：δ8.03(d，j＝8.0hz，1h)，7.57(m，2h)，7.38(m，5h)，7.23(m，4h)，7.14(m，6h)，7.07(m，6h)，6.75(s，2h)ppm.
[0063]
实施例2：四4
‑
甲酰基苯荧光素的合成
[0064][0065]
在20ml反应瓶中，分别加入88.0mg(0.1mmol)四碘荧光素、110.6mg无水碳酸钾、120mg4
‑
甲酰基苯硼酸，室温条件下分别加入4ml水和4ml无水乙醇，90℃下搅拌，将2mg醋酸钯溶于100μl dcm中，用移液枪将其加入反应瓶中，反应8小时；将体系冷却至室温，盐酸酸化后，用乙酸乙酯/水体系萃取至有机相，无水硫酸钠干燥后，将所得粗产品用制备薄层色谱进行分离提纯。
[0066]
质谱数据如下：
[0067]
esi
‑
hrms:m/z(％):[m h]

calculatedfor749.1805,found 749.1805.[m na]

calculated for 771.1626,found 771.1620.
[0068]
实施例3：四4
‑
氟苯荧光素的合成
[0069][0070]
在20ml反应瓶中，分别加入88.0mg(0.1mmol)四碘荧光素、110.6mg无水碳酸钾、140mg 4
‑
氟苯硼酸，室温条件下分别加入4ml水和4ml无水乙醇，50℃下搅拌，将1mg醋酸钯溶于100μl dcm中，用移液枪将其加入反应瓶中，反应8小时；将体系冷却至室温，盐酸酸化后，用乙酸乙酯/水体系萃取至有机相，无水硫酸钠干燥后，将所得粗产品用制备薄层色谱进行分离提纯。
[0071]
实施例4：四4
‑
(9h
‑
咔唑
‑9‑
基)苯荧光素的合成
[0072][0073]
在20ml反应瓶中，分别加入88.0mg(0.1mmol)四碘荧光素、110.6mg无水碳酸钾、287.13mg 4
‑
(9h
‑
咔唑
‑9‑
基)苯硼酸，室温条件下分别加入4ml水和4ml无水乙醇，50℃下搅拌，将1mg醋酸钯溶于100μl dcm中，用移液枪将其加入反应瓶中，反应8小时；将体系冷却至室温，盐酸酸化后，用乙酸乙酯/水体系萃取至有机相，无水硫酸钠干燥后，将所得粗产品用
制备薄层色谱进行分离提纯。
[0074]
2、四苯基荧光素荧光性质检测
[0075]
实施例6：
[0076]
取四苯基荧光固体粉末溶于1m pbs溶液中，在酶标仪中测量其吸收和发射光谱。可以得到四苯基荧光素的最大吸收和发射波长分别为528nm，560nm，相较于荧光素，其吸收波长(480nm)和发射波长(528nm)分别红移了48nm和32nm,相较于四碘荧光素，其吸收(526nm)和发射波长(550nm)分别红移了2nm和10nm。根据相对量子产率的计算公式，以荧光素作为标准物，得到四苯基荧光素的荧光量子产率为0.13。
[0077]
实施例7：
[0078]
由于四苯基荧光素在不同ph下，其溶解度与量子产率存在较大差异，测定不同ph下四苯基荧光素的荧光性质。
[0079]
(1)分别配制ph为7.4、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的水溶液，取适量四苯基荧光素溶于其中，超声溶解。
[0080]
(2)分别测量6个样品的光谱性质。
[0081]
可以看到在不同ph水溶液中，四苯基荧光素的吸收和发射波长没有明显的变化，但其量子产率呈现出随ph增加而明显增长的趋势。
[0082]
3、四苯基荧光素表观油水分布系数的测定
[0083]
实施例8：
[0084]
将150ml正辛醇和150ml 1m pbs水溶液混合后，在摇床上25℃，200rpm/min振荡24h，静置2h后，两相分离，分别保存备用。称取四苯基荧光素1.5mg置于50ml容量瓶中，加入正辛醇饱和的1m pbs水溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀后即得。分别取250ul、500ul、1ml、2.5ml、5ml供试样品于10ml的容量瓶中，补加正辛醇饱和的1m pbs水溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀后获得浓度分别为0.75mg/ml、1.2mg/ml、3.25mg/ml、7.5mg/ml、15mg/ml的标准溶液，从低浓度到高浓度分别测定三次此五个标准溶液在528nm处的吸光度，求取平均值后，拟合标准曲线得y＝0.0041x 0.0154。
[0085]
表不同标准溶液吸光度
[0086][0087]
实施例9：
[0088]
量取7ml供试样品与7ml 1m pbs水溶液饱和的正辛醇溶液混合，放置于摇床，25℃，20rpm/min振荡2h,静置1h后取水相测其在528nm的吸光度，由标准曲线得出水相浓度。
[0089]
由公式：
[0090]
p＝c
油相
/c
水相
＝(c
总
‑
c
水相
)/c
水相
[0091]
从而得出lg p＝0.943
[0092]
为了反映物质的细胞穿膜性，通常用该物质在正辛醇
‑
水体系中的表观油水分配系数lg p来表示。由于正辛醇具有与细胞脂膜相近的溶解度参数，所以在正辛醇
‑
水体系中测定的表观油水分配系数能比较客观的反映分子的跨膜性能。一般来说，当分子通过被动扩散渗透时，lg p在0
‑
3范围是最佳的，通过lg p值可以侧面反映出，四苯基荧光素具有良好的细胞跨膜能力。
[0093]
4、荧光偏振法测量四苯基荧光素与蛋白质的相互作用
[0094]
实施例10：四苯基荧光素在与bsa相互作用时的光谱性质
[0095]
(1)用1m pbs水溶液配制一定浓度的四苯基荧光素水溶液和bsa蛋白溶液。
[0096]
(2)分别配制2ml四苯基荧光素溶液母液 2ml 1m pbs水溶液、2ml四苯基荧光素溶液母液 2ml bsa蛋白溶液母液、2ml 1m pbs水溶液 2ml bsa蛋白溶液母液，混匀后孵育15min。
[0097]
(3)分别测定三个样品在530nm激发下的荧光强度(图4)，并测定四苯基荧光素与bsa蛋白混合溶液的吸收和发射光谱(图5)。
[0098]
实施例11：荧光偏振法测定四苯基荧光素与bsa的相互作用
[0099]
(1)取0.3mg四苯基荧光素，加入4.7ml 1m pbs水溶液，配成100mm的四苯基荧光素溶液。
[0100]
(2)取200μl的100mm的四苯基荧光素溶液加入到1800μl 1m pbs水溶液，配制成10mm的四苯基荧光素溶液。
[0101]
(3)取66mg bsa蛋白固体粉末溶于1ml 1m pbs水溶液，配制成1mm的bsa溶液，梯度稀释，分别配成100μm、10μm、1μm、100nm、75nm、50nm、25nm、10nm、1nm、0.1nm、0.01nm蛋白溶液。
[0102]
(4)取100μl 10mm的四苯基荧光素溶液分别与100μl各个浓度bsa蛋白溶液混合，100μl 1m的pbs水溶液分别与100μl各个浓度bsa蛋白溶液混合作为对照，37℃黑暗下孵育15min。
[0103]
(5)530nm波长下激发，560nm波长发射，测其荧光偏振值。
[0104]
(6)利用origin拟合hill方程，计算其ec50值为34.6nm。
[0105]
实施例10、11的数据表明，在生物体系中，四苯基荧光素与蛋白质有较强结合，存在着一定的定位潜力。
[0106]
5、细胞成像实验
[0107]
实施例12：
[0108]
hela细胞以200000/皿的密度种植在3.5cm细胞培养皿中，以含有1％抗生素，10％血清的dmem培养基培养。实验前撤去培养基，以pbs清洗三次，加入含有1％抗生素，10％血清的dmem培养基，或者无血清dmem培养基，125μm浓度的荧光素衍生物，培养半小时。随后，以含有0.01％吐温20的pbs清洗三次，每次5分钟。胰酶消化后，将细胞在含有1％血清，25mm edta的pbs(facs缓冲液)中重悬。在cytoflex流式细胞仪上检测。数据以flowjo软件处理。细胞测试的结果能明显看出四苯基荧光素以一种橘黄色荧光的形式展现出了优异的染料性能。