用于预防或治疗溶酶体贮积症的药物组合物的制作方法

1.本发明涉及一种用于预防或治疗溶酶体贮积症的药物组合物，特别是涉及一种用于预防或治疗溶酶体贮积症的药物组合物，该药物组合物包括石墨烯量子点作为活性成分。
2.本发明要求于2019年1月30日提交的韩国专利申请号10
‑
2019
‑
0011642的优先权和权益，该韩国专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.由于代谢异常导致溶酶体中底物积聚引起的疾病是溶酶体贮积症(lsd)。根据积聚的底物引起的症状，溶酶体贮积症表现为，例如，a、b和c型尼曼
‑
匹克病、ii型戈谢病、法布里病、神经节苷脂贮积症、泰
‑
萨克斯病、桑德霍夫病、克拉伯病和异染性脑白质营养不良。
4.例如，作为最常见的溶酶体贮积症的戈谢病是由糖脂类葡萄糖脑苷脂(也称为糖基神经酰胺)的积聚引起的，并且症状包括疼痛、严重的神经系统并发症、淋巴结和邻近关节肿胀、腹胀、皮肤褐变、贫血、低血小板计数和巩膜上黄色脂肪的沉积。此外，尼曼
‑
皮克病是一种先天性常染色体隐性溶酶体贮积症，其中鞘磷脂在细胞(例如巨噬细胞和神经元)的溶酶体中积聚，并且症状包括神经变性、肝脾肿大和呼吸困难。
5.溶酶体贮积症的原因仍然100％未知，但已知脂质、糖原、糖蛋白或粘多糖代谢所需的单一酶的缺乏是一个主要因素。例如，戈谢病是由葡萄糖脑苷脂酶缺乏引起的，而尼曼
‑
皮克病是由酸性鞘磷脂酶缺乏引起的。如上所述，由于缺陷酶在被称为溶酶体贮积症的各种疾病中是不同的，因此不容易找到普遍适用于溶酶体贮积症的治疗法。
6.因此，已经进行了许多研究以治疗与溶酶体贮积症相关的症状，但尚未开发出对溶酶体贮积症具有共同预防或治疗作用的治疗剂。


技术实现要素：

[技术问题]
[0007]
本发明涉及提供一种用于预防或治疗溶酶体贮积症的药物组合物。
[0008]
然而，本发明所要实现的技术目的不限于上述目的，并且本领域技术人员通过以下描述将清楚地理解未提及的其他目的。[技术方案]
[0009]
本发明的一方面提供了一种用于预防或治疗溶酶体贮积症的药物组合物，该药物组合物包括石墨烯量子点作为活性成分。
[0010]
在本发明的一个实施方案中，溶酶体贮积症可由溶酶体中积聚的底物引起。
[0011]
在本发明的另一实施方案中，石墨烯量子点可以通过与未代谢的底物结合来抑制底物在溶酶体中的积聚或分解先前积聚的底物。
[0012]
在本发明的另一实施方案中，石墨烯量子点可以是氧化石墨烯或还原的氧化石墨
烯的纳米尺寸片段。
[0013]
在本发明的另一实施方案中，石墨烯量子点可以包括选自羧基、酮基、醛基、羟基和环氧基的含氧原子的官能团作为末端官能团。
[0014]
在本发明的另一实施方案中，石墨烯量子点可具有1nm至20nm的长度。
[0015]
在本发明的另一实施方案中，溶酶体贮积症可以是选自庞贝病、戈谢病、法布里病、g
m1
‑
神经节苷脂积聚、泰
‑
萨克斯病、桑德霍夫病、尼曼
‑
皮克病、克拉伯病、法伯病、异染性脑白质营养不良、hurler
‑
scheie综合征、亨特综合征、圣菲利柏综合征a、圣菲利柏综合征b、圣菲利柏综合征c、圣菲利柏综合征d、莫尔奎综合征a、莫尔奎综合征b、maroteaux
‑
lamy综合征、斯赖综合征、α
‑
甘露糖苷贮积症、β
‑
甘露糖苷贮积症、岩藻糖苷贮积症、唾液酸贮积症和辛德勒
‑
神崎病(schindler
‑
kanzaki disease)中的至少一种疾病。
[0016]
在本发明的另一实施方案中，溶酶体贮积症可以是尼曼
‑
皮克病。
[0017]
在本公开的另一实施方案中，该组合物还可包括药学上可接受的载体或赋形剂。
[0018]
本发明的另一方面提供了一种预防或治疗溶酶体贮积症的方法，该方法包括向个体施用包含石墨烯量子点作为活性成分的药物组合物。
[0019]
本发明的又一方面提供了药物组合物用于预防或治疗溶酶体贮积症的用途，该药物组合物包含石墨烯量子点作为活性成分。
[0020]
本发明的又一方面提供了石墨烯量子点在制备用于预防或治疗溶酶体贮积症的药物中的用途。[有益效果]
[0021]
根据本发明的药物组合物包含石墨烯量子点，并且通过利用在石墨烯量子点的表面上生成的负电荷与未代谢的底物结合，表现出抑制底物在溶酶体中积聚或分解先前积聚的底物的效果，因此，可以预防或治疗溶酶体贮积症。
附图说明
[0022]
图1是应用石墨烯量子点来对尼曼
‑
皮克病诱发模型的运动性进行分析的结果。
[0023]
图2是通过应用石墨烯量子点来分析尼曼
‑
皮克病诱导模型的小脑中浦肯野细胞存活的结果。
[0024]
图3是通过应用石墨烯量子点来减少浦肯野细胞中胆固醇沉积的结果。
[0025]
图4是通过应用石墨烯量子点来减少人源细胞中胆固醇沉积的结果。
[0026]
图5是通过应用石墨烯量子点来提高人源细胞的分裂能力的结果。
[0027]
图6是通过应用石墨烯量子点来提高人源细胞的分化能力的结果。
[0028]
图7是石墨烯量子点的血脑屏障(bbb)渗透的结果。
[0029]
图8是生物素附着于石墨烯量子点的反应图。
[0030]
图9是石墨烯量子点的bbb渗透的结果。
[0031]
图10是用于制备石墨烯量子点的反应的示意图。
[0032]
图11是石墨烯量子点和纳米氧化石墨烯的尺寸比较。
[0033]
图12是石墨烯量子点和纳米氧化石墨烯的尺寸比较。
[0034]
图13是石墨烯量子点和纳米氧化石墨烯的拉曼光谱测量的结果。
具体实施方式
[0035]
本发明的用于预防或治疗溶酶体贮积症的药物组合物包括石墨烯量子点作为活性成分。
[0036]
在整个说明书中，术语“石墨烯”是指多个碳原子经由共价键彼此连接以形成多环芳族分子，并且经由共价键连接的碳原子形成6元环作为基本重复单元，但还可包括5元环和/或7元环。
[0037]
在本说明书中，术语“石墨烯量子点(gqd)”是指氧化石墨烯或还原的氧化石墨烯的纳米尺寸片段。
[0038]
在本说明书中，术语“氧化石墨烯”也被称为“氧化石墨烯”并且可以缩写为“go”。详细地，氧化石墨烯可以包括一种其中含有氧原子的官能团(如羧基、羟基或环氧基)结合到石墨烯上的结构，但不限于此。
[0039]
在本说明书中，术语“还原的氧化石墨烯”是指通过还原过程具有降低的氧原子比的氧化石墨烯，并且可以缩写为“rgqd”。
[0040]
在本说明书中，术语“纳米氧化石墨烯”是指平均直径为15nm或更大且平均高度为5nm或更大的纳米级氧化石墨烯，并且可以缩写为“纳米go”。
[0041]
根据本发明的石墨烯量子点各自具有呈现负电荷的表面。详细地，根据本发明的石墨烯量子点可以包括选自羧基、酮基、醛基、羟基和环氧基的含氧原子的官能团作为末端官能团。具体地，石墨烯量子点可以包括呈现负电荷的羧基作为主要官能团。
[0042]
在本发明中，石墨烯量子点可以通过利用在量子点表面上生成的负电荷与未代谢的底物结合来抑制底物在溶酶体中的积聚或分解先前积聚的底物。详细地，石墨烯量子点通过利用在量子点表面上生成的负电荷与以不溶性底物形式积聚的未代谢底物结合，将不溶性底物的特性改变为水溶性，并且石墨烯量子点不仅通过在底物与其结合时离开溶酶体而抑制了底物在溶酶体中的积聚，而且也诱导了先前积聚的底物的分解。
[0043]
在本发明中，溶酶体贮积症(lsd)是指由于代谢异常使脂质、糖原、糖蛋白或粘多糖等底物在溶酶体中积聚而引起的疾病。详细地，溶酶体贮积症可以是选自庞贝病、戈谢病、法布里病、g
m1
‑
神经节苷脂积聚、泰
‑
萨克斯病、桑德霍夫病、尼曼
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皮克病、克拉布病、法伯氏病、异染性脑白质营养不良、hurler
‑
scheie综合征、亨特综合征、圣菲利柏综合征a、圣菲利柏综合征b、圣菲利柏综合征c、圣菲利柏综合征d、莫尔奎综合征a、莫尔奎综合征b、maroteaux
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lamy综合征、斯赖综合征、α
‑
甘露糖苷贮积症、β
‑
甘露糖苷贮积症、岩藻糖苷贮积症、唾液酸贮积症和辛德勒
‑
神崎病中的至少一种疾病，但不限于此。
[0044]
底物在溶酶体中积聚的原因可能有多种。大多数情况下，lsd可能是由溶酶体功能缺陷(具体是由于脂质、糖原、糖蛋白或粘多糖代谢所需的单一酶的缺乏而导致底物在细胞的溶酶体中的积聚)引起的疾病。替代地，lsd可以是由于与细胞内物质运输系统相关的基因异常导致物质运输系统破坏导致底物在溶酶体中积聚而引起的疾病。
[0045]
本发明人进行了深入的研究工作以开发一种能够治疗与溶酶体贮积相关的症状而不管底物积聚的原因的治疗剂，因此已经证实可以通过使用石墨烯量子点分解未代谢的底物来预防或治疗lsd。本发明基于此。
[0046]
在本发明的一个优选实施方案中，溶酶体贮积症可以是尼曼
‑
皮克病。尼曼
‑
皮克病是一种先天性常染色体隐性溶酶体贮积症，其特征是鞘磷脂在细胞(例如巨噬细胞和神
经元)的溶酶体中过度积聚，并损害正常的细胞功能。a型尼曼
‑
皮克病由酸性鞘磷脂酶缺乏引起的，并且是一种快速进展的神经退行性疾病和一种通常导致在2至3岁时死亡的疾病。b型尼曼
‑
皮克病导致肝脾肿大和呼吸困难，并且通常是导致成年早期死亡的较温和的形式。这两种尼曼
‑
皮克病都与酸性鞘磷脂酶(asm)缺乏有关，统称为尼曼
‑
皮克病或asm缺乏症(asmd)。尼曼
‑
皮克病的另一类型，例如c型，不涉及asm基因的突变，也不直接影响asm的功能，而是由npc1和npc2基因突变引起的。在c型尼曼
‑
皮克病中，主要突变基因npc1的蛋白质产物不是酶，而是在内体
‑
溶酶体系统中充当将水不溶性大分子移动通过细胞的转运体。此外，由npc2基因编码的蛋白质是一种存在于溶酶体腔中的结合胆固醇的小蛋白。因此，npc1和npc2基因的突变破坏了细胞内物质的运输系统，从而导致胆固醇和糖脂在溶酶体中的积聚。
[0047]
本发明的石墨烯量子点具有纳米级尺寸，因此可以很容易地通过血脑屏障(bbb)。
[0048]
为此，本发明的石墨烯量子点可具有约1nm至约20nm的平均长度。优选地，平均长度可为1nm至10nm，更优选为1nm至5nm，最优选为1.5nm至4nm，但不限于此。此外，高度可以优选为0.5nm至5nm，更优选为0.5nm至3nm，最优选为1.5nm至2.5nm，但不限于此。
[0049]
在根据本发明一实施方案的gqd通过bbb的实验中，当测量go和gqd的渗透性时，证实了gqd的渗透性显著增加(图7)。此外，在石墨烯量子点的体外bbb渗透性的实验中，将gqd
‑
生物素注射到大鼠腹部，然后用生物素
‑
抗体处理重点实验的大鼠的小脑时，在用gqd
‑
生物素处理的大鼠的小脑中检测到gqd(图9)。
[0050]
此外，发现本发明的石墨烯量子点不会在体内积聚。
[0051]
因此，根据本发明的石墨烯量子点可以有用地用作溶酶体贮积症的治疗剂。
[0052]
根据本发明一实施方案，在通过应用石墨烯量子点分析尼曼
‑
皮克病诱发模型的运动性的实验中，当将gqd腹腔注射入尼曼
‑
皮克病诱发的大鼠并测量运动性时，在进行gqd腹膜内注射的组中观察到运动性的恢复(图1)。此外，作为通过应用石墨烯量子点对尼曼
‑
皮克病诱导模型的小脑中浦肯野细胞的存活分析实验的结果，发现在给药gqd的组中浦肯野细胞的存活率增加(图2)。此外，作为降低浦肯野细胞中胆固醇沉积的效果的分析结果，观察到胆固醇在尼曼
‑
匹克病诱发大鼠的浦肯野细胞(con)中沉积，而在施加gqd的组中沉积症状得到缓解(图3)。此外，在使用诱导神经干细胞(insc)验证在人体中的可用性的实验中，作为在使用来自尼曼
‑
皮克患者的成纤维细胞产生insc后测试gqd对神经元的影响的结果，观察到其中胆固醇沉积在源自患者的insc中的现象，并且观察到显示出与作为相同石墨烯来源材料的go相比的优异的效果(图4)。此外，在人源细胞中测量分裂能力的实验中，证实了来自尼曼
‑
皮克患者的insc的细胞分裂显著减少，并且观察到当应用gqd时，分裂能力得以恢复(图5)，并且证实了来自尼曼
‑
皮克患者的insc中向神经元细胞的分化显著减少，并且观察到了当应用gqd时，与go相比，分化能力得以恢复并显著提高(图6)。
[0053]
在本发明中，术语“药物组合物”是指为了特定目的而施用的组合物。出于本发明的目的，本发明的药物组合物包括石墨烯量子点并治疗或预防溶酶体贮积症，并且可以通过包括其中所涉及的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂来配制。根据本发明的药物组合物包括量为基于组合物总重量的0.1重量％至50重量％的本发明的活性成分。
[0054]
载体、赋形剂和稀释剂的示例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤
维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
[0055]
本发明的药物组合物可根据常规方法配制成口服剂型，如分散剂、颗粒、片剂、胶囊、混悬液、乳剂、糖浆和气雾剂、外用制剂、栓剂，或无菌可注射液型，以便被制备成药物制剂，并且通常可以使用制剂中常用的稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂)来制备。
[0056]
用于口服给药的固体制剂的示例包括片剂、丸剂、分散剂、颗粒和胶囊，并且此类固体制剂可以通过将药物组合物与至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶)混合来制备。此外，除了简单的赋形剂外，还可使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服的液体制剂的示例可以包括混悬液、液体溶液、乳剂和糖浆，并且除了作为常用的简单稀释剂的水和液体石蜡之外，还可以包括各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。
[0057]
肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶液、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶液和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射酯(如油酸乙酯)。作为栓剂的基质，可以使用witepsol、macrogol、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
[0058]
本发明的药物组合物可以根据需要的方法口服或肠胃外(例如静脉内、皮下、腹腔内或局部)给药，具体地，可以肠胃外给药，并且剂量范围根据患者的年龄、性别、体重、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病严重程度而变化。根据本发明的药物组合物的日剂量为约0.1mg/kg至100mg/kg，优选为1mg/kg至30mg/kg，并且可以一天给药一次或数次。
[0059]
除了根据本发明的石墨烯量子点之外，本发明的药物组合物还可以包括表现出相同或相似药效的至少一种活性成分。
[0060]
在本发明中，术语“预防”是指通过施用根据本发明的石墨烯量子点的来抑制溶酶体贮积症或延迟溶酶体贮积症发作的任何作用。
[0061]
在本发明中，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的石墨烯量子点来改善或有益地改变溶酶体贮积症的症状的任何作用。
[0062]
在本发明中，术语“抑制”是指通过施用根据本发明的石墨烯量子点来预防溶酶体贮积症的发作、减轻症状或治疗溶酶体贮积症。
[0063]
在本发明的一个方面，本发明提供一种用于预防或改善溶酶体贮积症的保健功能性食品组合物，该保健功能性食品组合物包含石墨烯量子点作为活性成分。
[0064]
本发明中使用的术语“改善”是指至少减少与所治疗的病症(例如症状)相关的参数的任何作用。
[0065]
根据本发明的保健功能性食品组合物可以将有效成分原样添加到食品中，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当使用。可根据使用目的(用于预防或改善)适当确定活性成分的混合量。保健功能性食品组合物包括载体、稀释剂、赋形剂和添加剂中的至少一种，并配制成选自片剂、丸剂、分散剂、颗粒、粉末、胶囊和液体制剂中的一种。
[0066]
可以添加到本发明的组合物中的食品的示例包括各种食品、粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆、饮料、口香糖、茶、维生素复合物和保健功能性食品。作为本发明可以进一步包括
的添加剂，可以使用选自天然碳水化合物、调味剂、营养素、维生素、矿物质(电解质)、甜味剂(合成甜味剂、天然甜味剂等)、着色剂、填充剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、甘油、醇、碳酸化剂和果浆中的至少一种成分。天然碳水化合物的示例包括一般糖类，例如葡萄糖和果糖等单糖类；麦芽糖和蔗糖等二糖类；以及糊精和环糊精等多糖类，以及木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇等糖醇类。作为甜味剂，可以有利地使用天然甜味剂(索马甜、甜菊提取物(例如，莱鲍迪苷a、甘草甜素等))和合成甜味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
[0067]
此外，根据本发明的组合物可以含有各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂、填充剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。
[0068]
此外，本发明提供了一种预防或治疗溶酶体贮积症的方法，该方法包括向个体施用包含石墨烯量子点作为活性成分的药物组合物。
[0069]
此外，本发明提供了药物组合物用于预防或治疗溶酶体贮积症的用途，该药物组合物包括石墨烯量子点作为活性成分。
[0070]
此外，本发明提供了石墨烯量子点在制备用于预防或治疗溶酶体贮积症的药物中的用途。
[0071]
在本发明中，术语“个体”是指本发明的石墨烯量子点可以给药的对象，并且本发明的药物组合物可以通过各种途径给药至哺乳动物，例如大鼠、小鼠、狗、猫、马、牛和人类，但不限于此。
[0072]
在本发明中，术语“给药”是指通过任何适当的方法向个体提供本发明的预定组合物。
[0073]
在下文中，将通过以下实施例和实验例更详细地描述本发明。然而，以下实施例和实验例仅用于说明目的，而本发明的范围不限于此。
[0074]
实施例1.石墨烯量子点(gqd)的制备
[0075]
gqd是使用热氧化切割技术使用碳纤维作为原材料而生产的(图10)。
[0076]
详细地，将碳纤维加入到其中硫酸和硝酸以3:1的比例混合的溶液中，然后于80℃加热24小时(热氧化过程)。反应完成后，通过透析过程、真空过滤等将其纯化，最后用rotovap得到粉末形式的gqd。由此产生的gqd以具有各种结构尺寸(约1nm至约20nm)的纳米尺寸颗粒的形式获得。
[0077]
实验例1.通过应用石墨烯量子点分析尼曼
‑
皮克病诱导模型的运动性
[0078]
为了分析石墨烯量子点对溶酶体贮积症的治疗效果，将在实施例1中制备的300μg的gqd每周一次经腹腔注射到尼曼
‑
皮克病诱导大鼠中，持续2周至8周。在尼曼
‑
匹克病诱导大鼠的情况下，为了模拟npc1蛋白的突变(这是尼曼
‑
匹克病的最重要致因)，对大鼠进行npc1基因敲除以引起该病，并且大鼠购自jackson laboratories。
[0079]
4周或5周后，初步测量大鼠的运动性，仅选取在旋转棒上向前行走180秒的个体用于本实验，结果如图1所示。
[0080]
如图1所示，当在第6周(1)、第7周(2)和第8周(3)测量运动性时，在gqd注射到腹腔中的组中观察到运动性恢复。
[0081]
实验例2.通过应用石墨烯量子点来分析尼曼
‑
皮克病诱导模型的小脑中浦肯野细
胞的存活率
[0082]
使用免疫细胞化学(icc)对尼曼
‑
皮克病诱导模型的小脑进行染色，其中小脑包括钙结合蛋白，其是一种在浦肯野细胞中特异性表达的蛋白质，并且浦肯野细胞可以使用该蛋白质的抗体进行染色。
[0083]
使用标记识别在浦肯野细胞中特异性表达的钙结合蛋白的抗体的免疫染色方法观察使用icc染色的浦肯野细胞，使用imagej软件(版本1.46r，美国马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院)对细胞数进行定量，并且结果在图2中示出。
[0084]
如图2所示，观察到在给药gqd的组中浦肯野细胞的存活率增加。
[0085]
实验例3.降低浦肯野细胞中胆固醇沉积效果的分析
[0086]
使用菲律宾菌素(filipin)对胆固醇进行染色，以便确定胆固醇在浦肯野细胞中沉积的程度，并使用钙结合蛋白抗体经由icc共染色观察到浦肯野细胞的细胞质中的胆固醇沉积。详细地，将细胞在4％多聚甲醛(pfa)pbs溶液中室温固定15分钟，用0.25％triton x
‑
100(sigma)处理10分钟，并与菲律宾菌素一起室温温育1小时，然后进行dapi(sigma)染色5分钟以对细胞核染色。使用共聚焦显微镜(日本尼康公司的eclipse te200)通过荧光表达观察到了菲律宾菌素的沉积，使用imagej软件(版本1.46r，美国马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院)对表达水平进行定量，并且结果在图3中示出。
[0087]
如图3所示，证实了胆固醇在尼曼
‑
匹克病诱导大鼠的浦肯野细胞(con)中沉积，然而在gqd给药组中沉积症状得到缓解。
[0088]
实验例4.使用诱导神经干细胞(insc)验证在人体中的可用性
[0089]4‑
1.人源细胞中胆固醇沉积的分析
[0090]
使用购自coriell institute的源自尼曼
‑
匹克患者的成纤维细胞(成纤维细胞
‑
gm03123)来产生诱导神经干细胞(insc)，然后测试gqd对神经元的影响。
[0091]
具体地，以与实验例3相同的方式，经由菲律宾菌素染色观察到胆固醇的沉积，使用共聚焦显微镜(日本尼康公司的eclipse te200)观察到荧光表达，使用imagej软件(版本1.46r，美国马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院)对表达水平进行定量，并且结果在图4中示出。
[0092]
如图4所示，证实观察到了胆固醇沉积在源自尼曼
‑
皮克患者的insc中的现象，然而gqd治疗组与氧化石墨烯(go，其是相同的石墨烯衍生材料)治疗组相比显示出优异的效果。
[0093]4‑
2.人源细胞分裂能力的测量
[0094]
(1)证实了源自尼曼
‑
皮克患者的insc中细胞分裂显著减少，并且观察到了当应用gqd时分裂能力恢复(图5)。分裂能力不表达于神经干细胞中，但可以定义为分化神经元中表达的神经丝的表达程度。将细胞在4％多聚甲醛(pfa)pbs溶液中室温固定15分钟，然后用0.25％triton x
‑
100(sigma)处理10分钟以增加渗透性(细胞被透化)。固定的细胞与封闭液(5％正常山羊血清)一起在室温下温育1小时，并与一抗一起于4℃温育过夜。然后，将细胞与用alexa fluor 594(invitrogen)标记的二抗一起温育，并进行dapi(sigma)染色5分钟以对细胞核染色。使用共聚焦显微镜(日本尼康公司的eclipse te200)收集图像。使用imagej软件(1.46r版，美国马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院)对表达水平进行定量。
[0095]
(2)证实了源自尼曼
‑
皮克患者的insc中向神经元细胞的分化显著减少，并且观察到了当应用gqd时，分化能力恢复。同样，证实了与go相比，gqd应用显示出显著改善的分化能力(图6)。
[0096]
实验例5.gqd的血脑屏障(bbb)渗透
[0097]5‑
1.体外bbb测定
[0098]
脑微血管内皮细胞(bmec)和星形胶质细胞用于准备进行使用transwell系统的体外bbb测定，并测量跨上皮电阻(teer)以表明该测定模拟bbb。在该实验中，当测量go和gqd的渗透性时，证实gqd的渗透性显著增加(图7)。
[0099]5‑
2.石墨烯量子点的体内bbb渗透率
[0100]
使生物素附着于gqd以制备可追踪的gqd
‑
生物素(图8)。
[0101]
对于全组织免疫组织化学，将石蜡载玻片的石蜡脱蜡，然后用含5％正常山羊血清的pbs封闭。将切片与生物素一抗一起温育过夜，然后与酶联二抗一起温育，然后进行dapi染色。使用共聚焦显微镜(日本尼康公司的eclipse te200)收集图像。
[0102]
将gqd
‑
生物素注射到大鼠的腹部后，用生物素
‑
抗体处理大鼠的小脑。如图9所示，在注射了gqd
‑
生物素的大鼠的小脑中检测到gqd(由图9中的箭头指示，cb：小脑，bs：脑干)。
[0103]
实验例6.gqd的生成和纳米go的区分
[0104]6‑
1.纳米go的获取
[0105]
原始氧化石墨烯(go)是经由改进的hummer方法合成的。为了制备纳米尺寸的go，将在蒸馏水溶液中获得的go(3mg/ml)进行剧烈的尖端超声处理(tip
‑
sonicated)3小时，然后使用硝酸纤维素膜过滤器(0.45μm,ge healthcare)进行真空过滤。
[0106]6‑
2.使用tem照片的gqd和纳米go之间的长度差
[0107]
将根据制备例而制备的样品分散的溶液(10μg/ml)吸附在涂覆有300目蕾丝碳的铜网格(ted pella,inc.)上30分钟。在成像之前，用几滴蒸馏水清洗该网格并在干燥器中彻底干燥。用高分辨率透射电子显微镜(hr
‑
tem,jem
‑
3010,jeol ltd.)分析制备的样品，并用与显微镜耦合的gatan数码相机(msc
‑
794)收集图像。
[0108]
结果，使用tem图像，测得纳米go的平均长度为28.5
±
9.7nm，而测得gqd的平均长度为2.8
±
1.0nm(图11)。
[0109]6‑
3.使用原子力显微镜(afm)照片的两种物质之间的高度差
[0110]
当使用afm测量这两种物质之间的高度差时，测得纳米go的平均高度为7.1
±
1.8nm，然而测得gqd的平均高度为1.4
±
0.5nm(图12)。
[0111]6‑
4.拉曼光谱测量结果
[0112]
作为拉曼光谱测量的结果，测得纳米go和gqd两者的d和g带(1360和1600cm
‑1)，其是石墨烯基材料的特征。在纳米go的情况下，d带又密又宽，因为包括缺陷位点(图13)。
[0113]
由于这种差异，在体内使用纳米go和gqd时可能出现不同的结果。
[0114]
本技术的上述描述仅用于说明目的，本技术所属领域的普通技术人员将能够理解，在不改变本技术的技术精神或本质特征的情况下，可以容易地修改其他具体形式。因此，应当理解，上述实施方案在所有方面都是说明性的而非限制性的。例如，描述为单一类型的每个组件可以分布式实现，并且同样，描述为分布式的组件也可以组合式实现。
[0115]
本技术的范围由以下所描述的权利要求书而非详细说明所指示，从权利要求书的
含义和范围衍生出的所有变化或修改形式及其等同概念均应理解为包含在本技术的范围内。工业适用性
[0116]
根据本发明的药物组合物包括石墨烯量子点，并且经由通过使用在石墨烯量子点表面上生成的负电荷与未代谢的底物结合来抑制底物在溶酶体中的积聚或分解先前积聚的底物，预期有效地用于预防或治疗溶酶体贮积症。