一种用于肼快速检测的反应型荧光探针的制备方法与流程

1.本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种用于肼快速检测的反应型荧光探针的制备方法。


背景技术：

2.肼(n2h4)因其活性高，在制药和农业行业具有广泛的应用。又因其焓值高，燃烧能产生大量的热和气体，在航空航天行业中，通常被用作火箭推进剂。同时因为它具有很强的亲核性，也可以形成多种衍生物。但是由于其毒性很大且具有很好的水溶性，可以和水以任何体积比混溶，很容易被人体通过口服、经皮或吸入等途径，对肝、肺、肾和神经造成严重损害。根据美国环境保护署(epa)将提纯的肼列为潜在的致癌物，并有阈值限制(10ppb)。同时，一些药物可能会在体内代谢生成肼，从而引起毒性，所以实现对肼的高灵敏度、高选择性的检测技术具有深远的意义。
3.迄今为止，已有多种用于检测肼的技术，例如色谱技术、电化学技术、表面增强拉曼光谱和比色技术等。但是，这些技术通常耗时较长，或者需要严格的样品处理过程。而荧光检测技术因为其操作简单，实时检测及对环境样品和生物学的适应性，引起了广泛的关注。但是能够高效检测肼的探针仍有待发展。探针不仅要能在复杂环境中对肼进行检测，响应时间也要尽可能快，肼识别前后要有明显的颜色变化，最好可以达到裸眼检测，即探针对肼的检测要具有高灵敏度和高选择性。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种裸眼识别的、快速高效的、选择性高、抗干扰性强、检测时间短、生产成本低的检测肼的反应型荧光探针。
5.本发明提供了如下的技术方案：
6.一种用于肼快速检测的反应型荧光探针的制备方法，具体如下，
7.s1、向fecl3·
6h 2
o水溶液中加入粉末状的2
‑
萘酚获得悬浮液，并将悬浮液升温进行充分搅拌，冷却后过滤后，将分离所得固体溶解在ch2cl2中，所得ch2cl2溶液用经洗涤，脱色，干燥，过滤，真空去除溶剂即得固体粗产物，将粗产物在室温下真空干燥，并用甲苯重结晶，得到白色针状的纯1，1
’‑
联
‑2‑
萘酚。
8.s2、将1，1
’‑
联萘酚、k2co3、cucl加入到圆底烧瓶中，室温下加入间二甲苯，加热，充分搅拌使其溶解，待溶液呈透明状后，缓慢加入甲基咪唑，继续加热使其升温反应，反应期间通过tlc监测反应；反应结束后，旋干溶剂，得黄色固体；经洗脱剂，柱层析分离，重结晶，得到黄色粉末状固体pxx
9.s3、在0℃冰水浴下，将s2步骤中合成的pxx完全溶解在dmf后，向该溶液中缓慢滴加pocl3，滴加完成后，升温至室温下反应，再升温继续反应，反应结束，停止加热，待其冷却至室温后，经沉淀，过滤，干燥，重结晶后，即获得目标探针。
10.优选的，s1步骤中，在室温下，在162.17g、0.6mol、0.0024mol/l的fecl3·
6h 2
o水
溶液中加入43.25g，0.3mol的粉末状的2
‑
萘酚，悬浮液升温至50℃搅拌3h。冷却后过滤，将分离所得固体溶解在ch2cl2中。
11.优选的，s1步骤中，所得ch2cl2溶液用蒸馏水洗涤后，通过活性炭脱色，用硫酸镁干燥，过滤除去硫酸镁后，真空去除溶剂即得固体粗产物。
12.优选的，s2步骤中，将1.0047g，3.5mmol的1，1
’‑
联萘酚、0.9696g，7mmol的k2co3、0.1054g，1.05mmol的cucl加入到圆底烧瓶中，室温下加入20ml间二甲苯，加热，充分搅拌使其溶解，待溶液呈透明状后，缓慢加入157μl，2.0mmol的甲基咪唑，继续加热使其升温至120℃，反应20h。
13.优选的，s2步骤中，反应期间通过tlc监测反应，以chcl3为洗脱剂，经柱层析分离，所得固体再用甲苯重结晶，得到黄色粉末状固体pxx。
14.优选的，s3步骤中，在0℃冰水浴下，将上步合成的pxx完全溶解在dmf后，向该溶液中缓慢滴加pocl3，滴加完成后，升温至室温下反应30min，再升温至80℃继续反应3h。
15.优选的，s3步骤中，反应结束，停止加热，待其冷却至室温后，向混合物中加入15g碎冰，充分搅拌，溶液出现黄色沉淀，经过滤，干燥，重结晶后，即获得目标探针。
16.本发明的有益的效果：
17.1、本发明合成pxx所需的原料廉价易得，合成步骤简单，反应选择性和收率都较高。
18.2、本发明的选择pxx作为合成目标荧光探针的母体，然后再修饰，在母体引入可以和肼发生反应的官能团，以使肼发生亲核进攻；肼对醛基进行亲核进攻，发生特异性反应—席夫碱反应，生成腙类化合物，pet效应会导致荧光恢复或增强，可以通过简单的荧光实验识别。
19.3、本发明荧光探针可以实现对肼检测的专一性。
附图说明
20.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
21.图1a为探针在识别肼前后的颜色变化，由黄色变为无色；
22.图1b为探针在识别肼前后的颜色变化，荧光由黄绿色变为蓝色；
23.图2为探针(10μmol)对不同浓度肼(0，10,15,20,25,30,35,40,45,50eq)的荧光滴定光谱(λ
ex
＝415nm，响应时间为30s)；
24.图3a为10μmol探针加入200μmol肼后，荧光发射光谱(λ
ex
＝415nm)在0
‑
240s内随时间的变化；
25.图3b为探针响应时间在λ
ex
＝415nm时516nm处的荧光强度变化，显示了探针对肼的响应速率，在90s左右响应完全；
26.图4a为探针(10μmol)在常见干扰离子(20eq)中的荧光发射光谱变化；
27.图4b为探针(10μmol)在常见干扰离子(20eq)中480nm处的荧光强度对比柱状图；
28.图5a为探针10μm在加入阳离子干扰(20eq)；
29.图5b为探针10μm在加入阴离子离子干扰(20eq)；
30.图5c为含氮小分子干扰下，检测肼前后480nm处的荧光强度对比(λ
ex
＝415nm，响应
时间30s)。
具体实施方式
31.首先，在室温下，向fecl3·
6h 2
o(162.17g，0.6mol，0.0024mol/l)水溶液中加入粉末状的2
‑
萘酚(43.25g，0.3mol)，悬浮液升温至50℃搅拌3h。冷却后过滤，将分离所得固体溶解在ch2cl2中，所得ch2cl2溶液用蒸馏水洗涤三次后，活性炭脱色，用硫酸镁干燥，过滤除去硫酸镁后，真空去除溶剂即得固体粗产物，将粗产物在室温下真空干燥，并用甲苯重结晶，得到白色针状的纯1，1
’‑
联
‑2‑
萘酚。
32.然后，将1，1
’‑
联萘酚(1.0047g，3.5mmol)、k2co3(0.9696g，7mmol)、cucl(0.1054g，1.05mmol)加入到圆底烧瓶中，室温下加入20ml间二甲苯，加热，充分搅拌使其溶解，待溶液呈透明状后，缓慢加入甲基咪唑(157μl，2.0mmol)，继续加热使其升温至120℃，反应20h，期间通过tlc监测反应。反应结束后，旋干溶剂，得黄色固体。以chcl3为洗脱剂，经柱层析分离，所得固体再用甲苯重结晶，得到黄色粉末状固体pxx。
33.最后，在0℃冰水浴下，将上步合成的pxx完全溶解在dmf后，向该溶液中缓慢滴加pocl3，滴加完成后，升温至室温下反应30min，再升温至80℃继续反应3h，停止加热，待其冷却至室温后，向混合物中加入约15g碎冰，充分搅拌，溶液出现黄色沉淀，经过滤，干燥，重结晶后，得到探针。
34.实验分析：
35.将10μm探针dmf溶液200μl，加入1ml 200μmol的肼dmf溶液中，室温下充分反应30s后，和空白组(未加肼的10μmol探针dmf溶液)对照，能明显看到探针与肼反应后溶液颜色由黄色变为几乎无色。在紫外灯照下(325nm)，明显观察到探针与肼反应后溶液由黄绿色荧光变为蓝色荧光，如图1a和1b所示。由此可见，探针作为肼的荧光检测剂灵敏度高，颜色变化明显，响应时间短，效果非常好。
36.在dmf溶液中加入探针母液，配置成浓度为10μmol的溶液，向其中加入不同当量浓度的肼待测液(0，10,15,20,25,30,35,40,45,50eq)，分别测量其荧光滴定光谱，结果如图2所示。
37.根据图2可知，在实验测试中，响应前探针的最大发射峰在530nm，加入肼后，530nm处的发射峰消失，荧光光谱蓝移，在450nm和480nm处出现了两个新的发射峰，并随着肼的不断加入，发射峰的荧光强度也不断增强。再次证明探针对肼具有较高的灵敏度。
38.另外探针的检测极限较低，为11.76μm。
39.25℃条件下在10μmol的探针dmf溶液中，加入肼(200μmol)，30s内探针即可对肼作出响应，响应持续时间长，在室内灯照射下溶液颜色由黄色变为几乎无色，在紫外灯照射下溶液荧光由黄绿色变为蓝色，均可裸眼识别。
40.探针对肼有良好的选择性，加入常见阴阳离子以及含氮亲核小分子后，从图4a和4b可以观察到溶液荧光强度变化并不明显(约为300a.u.)，而在加入肼之后，溶液荧光强度有了明显的变化约为1400a.u.，说明探针对肼有较好的选择性。
41.从竞争性实验结果来看，加入肼之后即使存在干扰物，待测液在480nm处的荧光强度仍然很高，荧光强度增加了3倍以上，说明探针在实验测试的干扰环境中对肼有较好的竞争性，参见图5a、5b和5c。
42.荧光基团的选择，既要满足大共轭π键，又需具有活性位点。查阅大量文献后，我们发现二氧杂蒽嵌蒽(pxx)满足这样的条件，并且合成pxx所需的原料廉价易得，合成步骤简单，反应选择性和收率都较高。因此，我们选择pxx作为合成目标荧光探针的母体，然后再修饰，在母体引入可以和肼发生反应的官能团，以使肼发生亲核进攻；识别基团的选择，识别基团是荧光探针最关键的一部分，探针检测待测物的过程其实是识别基团和待测物发生反应的过程。肼有两个给电子的氮原子，可以和许多有吸电子能力的官能团发生反应，诸如吸电子能力很强的醛基等。肼对醛基进行亲核进攻，发生特异性反应—席夫碱反应，生成腙类化合物。由于pet效应会导致荧光恢复或增强，可以通过简单的荧光实验识别。这表明醛基作为识别基团设计出的荧光探针可以实现对肼检测的专一性。
43.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。