咪唑酮基喹啉化合物及其治疗用途的制作方法

咪唑酮基喹啉化合物及其治疗用途
发明领域
1.本发明提供了atm抑制剂8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮的阻转异构体和氘化衍生物及其药学上可接受的盐和固体形式。这些化合物可用于抑制、调节和/或调整atm激酶的信号转导。本发明还提供了包含本发明的所述阻转异构体、固体形式、药学上可接受的盐和氘化衍生物的组合物，以及在治疗与atm激酶有关的各种障碍（特别是癌症）中使用这些组合物的方法。
[0002]
发明背景丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶atm（共济失调毛细血管扩张症突变激酶）属于具有催化结构域的pikk激酶家族，其与磷酸
‑
肌醇磷脂
‑
3激酶（pi3激酶, pi3k）同源。这些激酶参与多种关键的细胞功能，诸如细胞生长、细胞增殖、迁移、分化、存活和细胞粘附。具体地，这些激酶通过激活细胞周期停滞和dna修复程序（ddr: dna损伤应答）来对dna损伤做出响应。atm是atm基因的产物，并且在通过同源重组和非同源端对端连接（nhej）修复dna双链损伤（dsb：双链断裂）中起关键作用。这类双链损伤具有特别细胞毒性。
[0003]
人类肿瘤的主要特征之一是它们的基因组不稳定性，在大多数癌症中尚不知道dna修复机制的特定缺陷。这种不稳定性代表了化学疗法的治疗起点，所述化学疗法已经主要实施了一段时间。此外，还有一些综合症，其中根本遗传因素是调节对dna双链损伤的应答的基因的功能相关突变的丧失。这包括共济失调毛细血管扩张症，它由有缺陷的atm基因引起。所有这些综合征的一个共同特征是，它们造成极端的辐射敏感性(lavin和shiloh (1997) annu. rev. immunol. 15: 177; rotman和shiloh (1998) hum. mol. genet. 7: 1555，其整个内容特此通过引用并入本文)。因此，atm
‑
缺陷型细胞对导致dna双链体损伤的试剂和其它措施敏感，使atm成为癌症治疗中化学和辐射敏化的有吸引力靶标。
[0004]
总之，atm (共济失调毛细血管扩张症突变激酶)是dna双链断裂修复(其由广泛使用的放疗和化疗诱导)的关键调节剂。atm将广泛的信号传递给包括p53在内的众多下游效应物。未修复的双链断裂会导致检验点应答的激活、细胞周期停滞，并最终导致肿瘤细胞死亡。因此，atm已成为抑制诱导的双链断裂的修复的有吸引力的干预点。
[0005]
化合物渥曼青霉素是在该背景下最初研究的化合物之一，并显示出辐射敏化，这可能尤其归因于atm的抑制。然而，由于体内毒性，它不适合治疗用途。从pi3k抑制剂ly294002的化学结构开始，kudos pharmaceuticals鉴定了atm抑制剂: ku
‑
55933 (2
‑
吗啉代
‑6‑
(噻蒽
‑1‑
基)
‑
4h
‑
吡喃
‑4‑
酮)。使用该化合物，实现了对电离辐射和dna双链损伤化学治疗剂的敏化（hickson, i., 等人(2004), cancer res 64, 9152
‑
9159，其整个内容特此通过引用并入本文）。但是，发现ku
‑
55933不适合体内使用，大概是由于其高亲脂性。随后开发了ku
‑
60019 (2
‑
((2s,6r)
‑
2,6
‑
二甲基吗啉代)
‑
n
‑
(5
‑
(6
‑
吗啉代
‑4‑
氧代
‑
4h
‑
吡喃
‑2‑
基)
‑
9h
‑
噻吨
‑2‑
基)
‑
乙酰胺)和ku
‑
559403 (2
‑
(4
‑
甲基哌嗪
‑1‑
基)
‑
n
‑
[5
‑
(6
‑
吗啉代
‑4‑
氧代吡喃
‑2‑
基)噻吨
‑2‑
基]乙酰胺)，而ku
‑
559403被认为有足够希望进入治疗晚期实体瘤的临床试验。
[0006]
还有其它atm抑制剂支持上述观点，因为它们目前处于临床开发中，例如azd0156、azd1390和m3541，包括涉及它们与放射疗法的组合的临床研究。
[0007]
虽然已经在atm抑制剂领域中取得了很大进展，但仍然需要提供一种化合物，该化合物对atm激酶具有高抑制，而且还具有胜过其它激酶的有益选择性、有益的生物利用度和/或降低的脱靶效应。
[0008]
发明概述有效抑制、调节和/或调整atm激酶的信号转导的小分子的提供是合乎需要的并且是本发明的一个目的。此外合乎需要的是，提供选择性的atm抑制剂，即其对其它激酶没有活性或具有显著更低的活性。此外合乎需要的是，提供atmi抑制剂，其对于引起不希望的副作用的已知靶标显示出有益性能。因此，一个目的是，提供具有降低的脱靶效应和/或相关毒性的化合物。此外，本发明的一个目的是，提供具有良好生物利用度的atm抑制剂。本发明的另一个或替代目的是，提供具有有利固体形式性能（诸如有利的低吸湿性和/或其它物理性能）的atm抑制剂。
[0009]
atm抑制剂8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(化合物y)的阻转异构体和氘化衍生物及其固体形式、药学上可接受的盐和组合物解决了上述至少一个目的和其它目的。
[0010]
本发明的一个方面提供了两种化合物，它们是化合物y的阻转异构体，并且由下式表示：及其药学上可接受的盐。
[0011]
本发明的另一个方面提供了化合物1的固体形式：。
[0012]
另一个方面涉及化合物1的某些特别有利的药学上可接受的盐，尤其是化合物1富
马酸盐、化合物1乙二磺酸盐和化合物1萘磺酸盐，它们在下文中也可以被统称为“化合物1
‑
a”。
[0013]
本发明的另一个方面提供了氘化化合物3、4和5，它们由下式表示：它们由下式表示：或其阻转异构体或药学上可接受的盐。
[0014]
附图简述图1描绘了化合物1的注解1h nmr谱。
[0015]
图2描绘了化合物1的注解
13
c nmr谱。
[0016]
图3描绘了化合物1的注解
19
f nmr谱。
[0017]
图4描绘了化合物1在甲醇中的紫外
‑
可见光光谱。
[0018]
图5描绘了化合物1和2的hplc色谱图。
[0019]
图6描绘了化合物1的制备的流程图。
[0020]
图7描绘了化合物
‑1‑
二苯甲酰基
‑
d
‑
酒石酸盐的晶体结构(a)和其xrpd (b)。
[0021]
图8描绘了化合物
‑2‑
二苯甲酰基
‑
l
‑
酒石酸盐的晶体结构。
[0022]
图9描绘了化合物1及其具体盐的在fassif中的非沉降溶解行为的图。
[0023]
图10描绘了化合物1富马酸盐的固体形式的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0024]
图11描绘了化合物1萘磺酸盐的固体形式的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0025]
图12描绘了化合物1乙二磺酸盐的固体形式的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0026]
图13描绘了化合物1的固体形式a2的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0027]
图14描绘了化合物1的固体形式a1的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0028]
图15描绘了化合物1的固体形式a3的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0029]
图16描绘了化合物1的固体形式nf9的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0030]
图17描绘了化合物1水合物的固体形式h1的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0031]
图18描绘了化合物1水合物的固体形式h2的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0032]
图19描绘了化合物1的固体形式nf19的x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样。
[0033]
图20显示了由辐照(ir)和口服化合物1的伴随施用诱导的强烈肿瘤生长抑制(6 x 5天, 2戈瑞; fadu scchn肿瘤模型)。
[0034]
图21显示了与奥拉帕尼组合的化合物1和比较性atm抑制剂在hbcx
‑
10患者衍生的三重阴性的乳腺癌异种移植物模型中的抗肿瘤活性的体内评价的结果。
[0035]
图22显示了化合物1的形式a2的dsc加热曲线。
[0036]
图23显示了化合物1的形式a2的tga加热曲线。
[0037]
图24显示了化合物1的形式a2的dvs水吸收等温线(25℃)。
[0038]
图25显示了化合物1的形式a1的dsc加热曲线。
[0039]
图26描绘了化合物1的形式a1的tga加热曲线。
[0040]
图27显示了化合物1的形式a3的dvs水吸收等温线(25℃)。
[0041]
图28描绘了化合物1的形式h2 (水合物)的dsc加热曲线。
[0042]
图29显示了化合物1的形式h2(水合物)的tga加热曲线。
[0043]
图30显示了化合物1的形式h2(水合物)的dvs水吸收等温线(25℃)。
[0044]
图31描绘了化合物1富马酸盐(形式nf6)的dsc加热曲线。
[0045]
图32显示了化合物1富马酸盐(形式nf6)的tga加热曲线。
[0046]
图33显示了化合物1富马酸盐(形式nf6)的dvs水吸收等温线(25℃)。
[0047]
图34描绘了化合物1萘磺酸盐(nf7)的dsc加热曲线。
[0048]
图35显示了化合物1萘磺酸盐(nf7)的tga加热曲线。
[0049]
图36描绘了化合物1萘磺酸盐(nf7)的dvs水吸收等温线(25℃)。
[0050]
图37描绘了化合物1乙二磺酸盐(nf8)的dsc加热曲线。
[0051]
图38显示了化合物1乙二磺酸盐(nf8)的tga加热曲线。
[0052]
图39描绘了化合物1乙二磺酸盐(nf8)的dvs水吸收等温线(25℃)。
[0053]
图40显示了处于固体形式s1的化合物1的甲醇化物的xrpd。
[0054]
图41描绘了处于固体形式s2的化合物1的混合水合物/甲醇化物的xrpd。
[0055]
图42显示了处于固体形式s3的化合物1的thf溶剂化物的xrpd。
[0056]
图43描绘了处于固体形式nf11的化合物1的二氧杂环己烷溶剂化物的xrpd。
[0057]
图44显示了处于固体形式nf15的化合物1的氯仿溶剂化物的xrpd。
[0058]
图45描绘了处于固体形式nf16的化合物1的乙酸溶剂化物的xrpd。
[0059]
图46显示了处于固体形式nf18的化合物1的乙酸溶剂化物的xrpd。
[0060]
图47描绘了处于固体形式nf29的化合物1的1,4
‑
二氧杂环己烷溶剂化物的xrpd。
[0061]
图48显示了处于固体形式nf32的化合物1的二氯甲烷溶剂化物的xrpd。
[0062]
图49描绘了处于固体形式nf33的化合物1的nmp (n
‑
甲基
‑2‑
吡咯烷酮)溶剂化物的xrpd。
[0063]
图50显示了处于固体形式nf35的化合物1的乙腈溶剂化物的xrpd。
[0064]
图51描绘了处于固体形式nf36的化合物1的1,4
‑
二氧杂环己烷溶剂化物的xrpd。
[0065]
图52显示了处于固体形式nf37的化合物1的二甲基乙酰胺溶剂化物的xrpd。
[0066]
发明详述国际专利申请wo2016/155844（其整个内容特此通过引用并入）描述了有效地抑制、调节和/或调整atm激酶的信号转导的咪唑酮基喹啉化合物。这样的化合物包括化合物y：。
[0067]
化合物y在wo2016/155844中被命名为实施例4，并且在多种测定和治疗模型中具有活性，证明了相对于pi3kα、pi3kβ、pi3kδ、pi3kγ和mtor对atm激酶的选择性抑制（在酶促和细胞测定中）。
[0068]
本文用于定义化合物的术语通常基于iupac组织关于化合物、且特别是有机化合物的规则。
[0069]
现已令人惊讶地发现，化合物y以两种阻转异构体的形式存在，它们可以被分离并且有益地是稳定的，并且所述阻转异构体表现出惊人的和非常合乎需要的特征。
[0070]
根据一个方面，本发明提供了下述两种化合物，它们是化合物y的阻转异构体：
●8‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(化合物1)和
●8‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(ra)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(化合物2)，及其药学上可接受的盐。
[0071]
化合物1和2由下式表示：
其中化合物1和2的粗体和虚线部分表示吡啶环超出三环所在平面的部分旋转。
[0072]
本领域普通技术人员将理解，本文中使用的术语“阻转异构体”表示由于围绕产生手性轴的单键的受限旋转而产生的立体异构体。还应理解，围绕所述单键的旋转屏障必须足够高以允许分离单一阻转异构体。所述旋转屏障可以例如由与同一分子的其它残基的空间相互作用产生，从而限制围绕所述单键的所述旋转。空间和电子因素都会起作用，并可能彼此补强或抵消。
[0073]
原则上，含有不对称碳原子的手性化合物的利用在药物发现中被充分确立。具体而言，本领域中已知，与外消旋混合物相比，两种手性化合物的外消旋混合物通常由一种活性较高的对映异构体和一种活性较低的对映异构体组成。因而，两种对映异构体中仅一种的利用可以有利于提高化合物的整体效能。
[0074]
但是，阻转异构体（其为仅由于围绕单键的受阻旋转而产生的立体异构体）的利用通常被认为是不希望的。具体地，阻转异构体通常被视作药物发现中的不利因素（liability），因为这些异构体的稳定性取决于由空间张力导致的能量差异或对围绕所述单键的旋转产生障碍的其它因素。与由不对称碳原子产生的手性化合物相比，不可容易地预测阻转异构现象。具体地，通常不可能容易地预测阻转异构体的稳定性。具体地，所述能垒的高度决定了两种相应阻转异构体的互变的时间。因此，生物活性的阻转异构体向对应的其它阻转异构体的互变可以降低其生物活性并引入脱靶效应或其它不希望的效应。因此，只有具有足够高能垒的稳定阻转异构体才可能在药物发现中是合适的。
[0075]
已经令人惊讶地发现，阻转异构体化合物1和化合物2不会显著地互变为各自的其它阻转异构体，即使在超过十年的长时间段（通过计算机模拟确定> 10年的旋转半衰期）和在超过室温的温度以后。阻转异构体的转化温度已被评估为在溶液中超过100℃。这种非常好的稳定性已通过实验得到证实。它使那些阻转异构体容易适用于药物应用、制造、配制并提供足够的贮存期限。
[0076]
化合物1的绝对结构已基于(2s,3s)
‑
二苯甲酰基
‑
d
‑
酒石酸盐以及从固体形式a2的x
‑
射线衍射确定，其将在下面更详细地描述。化合物1的结构已通过光谱法(nmr、ms、ir和uv)、x
‑
射线衍射、元素分析和旋光分析的结果得到证实。化合物1的1h
‑
、
13
c
‑
和
19
f
‑
nmr谱如图1
‑
3所示，紫外
‑
可见光谱如图4所示。化合物1的固体形式a2的xrpd示于图13中。化合物
‑1‑
二苯甲酰基
‑
d
‑
酒石酸盐的晶体结构和xrpd见图7a和b，化合物
‑2‑
二苯甲酰基
‑
l
‑
酒石酸盐的晶体结构见图8。
[0077]
化合物1和2是非常有效的atm激酶抑制剂。如表1所示，与作为化合物1和2的混合物的化合物y相比，化合物1在所有测定中具有明显优越的atm抑制值：表1
。
[0078]
更进一步，所述化合物对相关激酶具有选择性，包括mtor (>30,000 nm)、dna
‑
pk和最值得注意的atr。令人惊讶的是，与化合物y相比，化合物1和2都是atr激酶的效力较低的抑制剂，即在选择性方面更有利。
[0079]
表2
[0080]
虽然就atm抑制而言，化合物2与化合物y并无不同（见表1），但它对atr和dna
‑
pk的选择性明显优于化合物y，如上面表2所示。
[0081]
因此，本发明的化合物可以特别有利地用于选择性地解决特定的dna修复机制，特别是同源重组，其特异性靶向dna双链损伤。
[0082]
选择性atm抑制剂化合物1和2的另一个优点是毒性的降低，特别是与脱靶效应相关的毒性，和因而较高化合物剂量的耐受性。因此，根据本发明的化合物在癌症疗法中开辟了新的可能性，例如，化合物1和2，最优选地化合物1，可用于靶向联合治疗，例如包含强效和选择性atm抑制剂和强效和选择性其它抑制剂，例如atr抑制剂。
[0083]
总的来说，已发现化合物1具有最有益的综合性能。令人惊讶的是，它不仅具有最佳的atm抑制性能，而且具有最佳的微粒体清除值和最低的磷酸二酯酶(pde) 2a1以及pde4a1a和pde4d2抑制。磷酸二酯酶抑制本身与多种药理学作用相关，且pde抑制剂可用作用于治疗多种病症的药物，包括抑郁症、多发性硬化和慢性阻塞性肺疾病，仅举几例，所有这些都将构成在本案中的脱靶效应。还已知pde4抑制与诱发恶心的风险有关，且因此应避免。因此，需要高ic
50
值，即这些脱靶的差抑制。从下表3中显而易见，化合物1的pde4抑制的ic
50
值是化合物y的ic
50
值的约5倍高。
[0084]
表3
[0085]
表4解释了化合物1的其它有利参数，包括约80%的有利高生物利用度以及关于cyp和herg (心脏离子通道)的有利性能，后者指示没有预见到与心脏kv11.1 herg离子通道的安全相关的相互作用。
[0086]
表4
[0087]
进一步令人惊讶地发现，与化合物y相比，化合物1和2在生物缓冲溶液中具有显著提高的溶解度（见下表5）。化合物1的预期缓慢人血浆清除率和高生物利用度有助于适当的低剂量需求。
[0088]
表5
[0089]
关于化合物1或2所描绘的结构意图包括仅在一种或多种同位素富集的原子的存在方面不同的化合物。例如，h、c、n，在每种情况下也包括这些原子的较重同位素。这尤其适用于h，其中可以有利地使用氘或氚，以及适用于
13
c
‑
或
14
c
‑
富集的碳对碳的替换，这也在本发明的范围内。在某些优选的实施方案中，不使用同位素富集的原子，而是使用关于同位素分布处于其天然存在形式的原子。
[0090]
对根据本发明的化合物或盐的提及也应被认为涵盖溶剂化形式，即其溶剂化物，其是指游离形式或盐的溶剂化物。溶剂化物是指惰性溶剂分子在化合物上的加合物，其由于它们的相互吸引力而形成。溶剂化物例如为一水合物或二水合物或醇化物。下面更详细地公开了溶剂化物的示例性实施方案。
[0091]
如上所述，本发明提供了两种稳定的阻转异构体，化合物1和2。这两种阻转异构体的制备通常是基于分离和纯化技术，如将在下面更详细地描述的。本领域技术人员理解，这可能不产生完全纯的产物。但是，本发明提供了基本上不含有化合物2的化合物1和基本上不含有化合物1的化合物2。“基本上不含有”在本发明的上下文中应优选地是指，基本上纯
的化合物1可以含有至多20重量%的化合物2或其盐，优选至多15重量％，更优选至多10重量％，例如至多5重量%、至多2.5重量%、至多1重量%、至多0.5重量%或至多0.1重量%的化合物2或其盐，补至100％的余量由化合物1组成。在一个实施例中，基本上纯的化合物1可以由99重量%的化合物1和1重量%的化合物2组成。反之亦然，同样适用于化合物2，即基本上不含有化合物1的化合物2应优选意指，纯的化合物2可以含有至多20重量%的化合物1或其盐，关于化合物1公开的优选范围通过类推同样适用（反之亦然）。此外，除非另有明确说明，否则分别对化合物1或其盐、或化合物2或其盐的提及应包括所有溶剂化物和固体形式，诸如本文下文进一步公开的那些，即使没有具体提及。
[0092]
在其它实施方案中，本发明提供了基本上不含有杂质的化合物1或2。本文中使用的术语“基本上不含有杂质”是指，该化合物不应含有任何显著量的外来物质。这样的外来物质可以包括残留的化合物1或其盐、残留的化合物2或其盐、残留溶剂或可能从化合物1或2的制备和/或分离产生的任何其它杂质。在某些实施方案中，化合物1可以含有不超过30重量%的外来物质，补至100重量%的余量由化合物1组成，优选地不超过25重量%、不超过20重量%、不超过15重量%、不超过10重量%、不超过7.5重量%、不超过5重量%、不超过1重量%、不超过0.5重量%或不超过0.1重量%。通过类推，相同的示例性实施方案对于化合物2是有效的。并且，和以前一样，除非另有明确说明，否则分别对化合物1或其盐、或化合物2或其盐的提及应包括所有溶剂化物和固体形式，诸如本文下文进一步公开的那些。
[0093]
根据另一个实施方案，相对于hplc色谱图的总面积，化合物1或2分别含有不超过约5.0 hplc面积百分比的总有机杂质，且在某些实施方案中，不超过约3.0 hplc面积百分比的总有机杂质，且在某些实施方案中，不超过约1.5 hplc面积百分比的总有机杂质。在其它实施方案中，相对于hplc色谱图的总面积，化合物1或2含有不超过约1.0 hplc面积百分比的任何单一杂质；不超过约0.6 hplc面积百分比的任何单一杂质，且在某些实施方案中，不超过约0.5 hplc面积百分比的任何单一杂质。例如，对于hplc色谱图，可以使用在实施例3.3中描述的用于分析各种阻转异构体的纯度的方法。再次，除非另有明确说明，否则分别对化合物1或其盐、或化合物2或其盐的提及应当包括所有溶剂化物和固体形式，诸如本文下文进一步公开的那些。
[0094]
根据另一个实施方案，本发明提供了包含有效量的化合物1或其药学上可接受的盐的药物组合物。在一个替代实施方案中，所述药物组合物包含有效量的化合物2或其药学上可接受的盐。根据另一个实施方案，本发明提供了制备本文描述的这样的组合物(例如，可以包括有效量的化合物1或2的组合物)的方法。对化合物1或2的提及应在本发明的上下文中理解为，各种其它阻转异构体的任何量只可以分别达到与“基本上不含有”各种其它阻转异构体、“基本上不含有杂质”或杂质总量的定义一致的量，即计入所述化合物的量，而不是单独存在。这适用于各种盐。如前所述，除非另有具体说明，否则对化合物1或2或其盐的提及应同样包括任何固体形式或溶剂化物，诸如本文下文进一步公开的那些。在示例性实施方案中，化合物1以其游离形式（即非盐形式）包含在药物组合物中。
[0095]
其它实施方案提供了分别使用如本文所述的化合物或组合物或药物组合物或其药学上可接受的盐治疗癌症的方法。根据另一个实施方案，本发明提供了根据本发明的化合物、其药学上可接受的盐或(药物)组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了用于用作药物、尤其是用于治疗癌症的如本文中所述的化合
物或药物组合物。再次，除非另有明确说明，否则对化合物或其盐的提及应包括那些化合物或盐的任何溶剂化物或固体形式，诸如本文下文进一步公开的那些。
[0096]
游离形式和盐根据本发明的化合物可以以其游离形式使用，即如上式所示。例如，已经发现化合物1的游离形式是特别有益的，并且其示例性固体形式，包括优选的固体形式，将在下面更详细地描述。
[0097]
另一方面，本发明还包括这些化合物以其药学上可接受的盐的形式的应用，所述盐可以通过本领域已知的程序从各种有机和无机酸衍生出。根据本发明的化合物的合适的药学上可接受的盐可以通过常规方法制备。可以使用酸将根据本发明的化合物转化为相关的酸加成盐，例如通过使化合物与当量或过量的酸在合适的溶剂（例如，thf或丙酮）中反应，然后将如此形成的饱和溶液冷却结晶。可替换地，可以使用反溶剂结晶或蒸发结晶。
[0098]
根据本发明的化合物、特别是化合物1的合适的药学上可接受的盐的例子包括hcl盐、硫酸盐、甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、乳酸盐，尤其是l
‑
乳酸盐。
[0099]
化合物1的优选盐包括富马酸盐、萘磺酸盐和乙二磺酸盐，它们在下面也可以被统称为化合物1a。
[0100]
化合物1萘磺酸盐可以使用萘磺酸和thf或丙酮作为溶剂从化合物1制备。获得了良好的结晶度。化合物1:萘磺酸盐的优选比例为约1:1。
[0101]
使用乙二磺酸和从丙酮中冷却结晶，可以获得化合物1乙二磺酸盐。化合物1:萘磺酸盐的优选比例为约1:1。获得了良好的结晶度。
[0102]
使用正戊烷作为反溶剂和富马酸作为酸，通过在thf中反溶剂蒸汽扩散可以得到化合物1富马酸盐。化合物1:富马酸盐的比例被证实为约1:0.9。所得的盐具有非常有利的整体物理性能和良好的结晶度。富马酸盐是盐中的一个优选实施方案，部分地由于期望的吸湿性不存在。
[0103]
制备根据本发明的化合物1的富马酸盐、萘磺酸盐和乙二磺酸盐的合适方法的详细实例公开于实施例5中。
[0104]
已经发现，化合物1的这些盐显示出比母体化合物1更快的初始溶解速率。化合物1及其具体盐在fassif缓冲溶液(ph 6.5)中的非沉降溶解行为示例性地描绘在图9中。具有有利溶解行为的盐是化合物1乙二磺酸盐、化合物1富马酸盐和化合物1萘磺酸盐。母体化合物1以各种结晶和溶剂化形式的混合物的形式使用。
[0105]
本领域普通技术人员将理解，来自酸和化合物1的阴离子部分会离子键合以形成化合物1
‑
a。预期化合物1
‑
a可以以多种物理形式存在。例如，化合物1
‑
a可以呈溶液、悬浮液或固体形式。在某些实施方案中，化合物1
‑
a呈固体形式。当化合物1
‑
a呈固体形式时，所述化合物可以是无定形的、结晶的或其混合物。本文中使用的术语“多晶型物”表示化合物或其盐可以在其中结晶的不同晶体结构。
[0106]
在某些实施方案中，化合物1
‑
a是基本上不含有无定形化合物1
‑
a的结晶固体。本文中使用的术语“基本上不含有无定形化合物1
‑
a”是指，所述盐不含有显著量的无定形化合物1
‑
a。在某些实施方案中，存在至少约90重量%的结晶化合物1
‑
a，或存在至少约95重量%的结晶化合物1
‑
a。在本发明的其它实施方案中，存在至少约99重量%的结晶化合物1
‑
a。这些百分比是相对于化合物1
‑
a的绝对重量(100重量%)。
[0107]
在一个示例性实施方案中，本发明提供了化合物1富马酸盐的固体形式，其特征在于与图10中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样，和/或特征在于在其粉末x
‑
射线衍射图样中选自约在以下位置的那些峰的一个或多个峰：
[0108]
化合物1的富马酸盐是无水的。其固体形式也可以被称作富马酸盐
‑
nf6。富马酸盐
‑
nf6的dsc加热曲线、tga加热曲线和dvs水吸收等温线(25℃)描绘于图31、32和33中。下表提供了来自非沉降溶解测量的结果（在fassif中在ph 6.5的非沉降溶解数据，方法描述在实验部分中）：
[0109]
当关于2
‑
θ度值使用时，本文中使用的术语“约”表示所述值
±
0.3 2
‑
θ度(
°2θ
)。在某些实施方案中，“约”表示
±
0.2 2
‑
θ度或
±
0.1 2
‑
θ度，最优选
±
0.2 2
‑
θ度。
[0110]
本文描述的任何固体形式或多晶型物可以特征在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个xrd或xrpd峰(
°2θ
)。本文描述的任何固体形式或多晶型物优选地特征在于至少6个xrd峰(
°2θ
，优选地
±
0.2
°2θ
)。用于表征固体形式或多晶型物的优选峰在各个峰值罗列中用粗体印刷和星号指示。
[0111]
在另一个示例性实施方案中，本发明提供了化合物1萘磺酸盐的固体形式，其特征在于与图11中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样，和/或特征在于在其粉末x
‑
射线衍射图样中选自约在以下位置的那些峰的一个或多个峰
[0112]
化合物1的萘磺酸盐的热和水吸附性能示于图34、35和36中。获得的萘磺酸盐的固体形式也可以被称作萘磺酸盐nf7。此外，溶解行为由以下实验性非沉降溶解数据(fassif, ph 6.5)表示：。
[0113]
在另一个示例性实施方案中，本发明提供了化合物1乙二磺酸盐的固体形式，其特征在于与图12中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样，和/或特征在于在其粉末x
‑
射线衍射图样中选自约在以下位置的那些峰的一个或多个峰：
[0114]
化合物1的乙二磺酸盐的热性能和溶解数据如图37、38和39所示。乙二磺酸盐的固体形式也可以被称作nf8。它是一种无水形式/盐。下表提供了非沉降溶解数据(fassif, ph 6.5)：。
[0115]
与上文关于化合物1和2所阐述的内容一致，本发明提供了化合物1
‑
a或化合物1的其它盐，其基本上不含有化合物2或其盐。在其它实施方案中，还提供了基本上不含有杂质的化合物1
‑
a或化合物1的另一种盐。根据另一个实施方案，相对于hplc色谱图的总面积，化合物1
‑
a或化合物1的任意其它盐含有不超过约5.0 hplc面积百分比的总有机杂质。上文关于“基本上不含有化合物2或其盐”、“不含有杂质”的化合物1和总有机杂质的面积百分比所公开的示例性和优选范围在这里同样适用。通过类推，这同样适用于根据本发明的任何化合物的任何盐，且特别是阻转异构化合物。
[0116]
根据另一个实施方案，本发明提供了包含有效量的化合物1
‑
a的药物组合物。根据另一个实施方案，本发明提供了制备本文描述的这样的组合物(例如，可以包括有效量的化合物1
‑
a的组合物)的方法。其它实施方案提供了分别使用根据本发明的化合物1
‑
a或其组合物治疗癌症的方法。根据另一个实施方案，本发明提供了本文描述的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。化合物1
‑
a可以以与关于化合物1公开的相同量存在于（药物）组
合物中。分别关于组合物中其它阻转异构体或其盐的存在，以上关于化合物1提出的考虑通过类推同样适用。
[0117]
固体形式和溶剂化物根据另一个方面，本发明提供了化合物1或2的固体形式，尤其是化合物1的固体形式。
[0118]
本领域普通技术人员将理解，根据本发明的化合物可以以多种物理形式存在。例如，它们可以呈溶液、悬浮液或固体形式。
[0119]
在某些优选的实施方案中，化合物1呈固体形式。固体形式在本文中通常是优选的，因为它们允许提供固体药物组合物。当化合物1呈固体形式时，所述化合物可以是无定形的、结晶的或其混合物。化合物1的示例性固体形式在下面更详细地描述。
[0120]
根据一个实施方案，本发明提供了作为无定形固体的化合物1。无定形固体是本领域普通技术人员众所周知的，并且通常通过诸如冻干、喷雾干燥或快速沉淀之类的方法制备。
[0121]
在其它实施方案中，化合物1是结晶固体。本文中使用的术语“多晶型物”表示化合物可在其中结晶的不同晶体结构。
[0122]
在某些实施方案中，化合物1是基本上不含有无定形化合物1的结晶固体。本文中使用的术语“基本上不含有无定形化合物1”是指，该化合物不含显著量的无定形化合物1。在某些实施方案中，存在至少约90重量%的结晶化合物1，或存在至少约95重量%的结晶化合物1。在本发明的其它实施方案中，存在至少约99重量%的结晶化合物1。这些百分比是相对于化合物1的绝对重量(100重量%)。在细节上做必要的修正后，这同样适用于本文公开的所有化合物的任何结晶形式或多晶型物的可接受的无定形含量，包括本文关于盐、无水形式、溶剂化物和其它形式描述的那些。
[0123]
根据一个方面，本发明提供了化合物1的固体形式，其为无水化合物1的固体形式，优选结晶性无水化合物1。本文描述了无水化合物1的五种不同多晶型形式。在涉及无水形式和溶剂化物的本节中描述的具体固体形式的上下文中，对化合物1的提及应理解为提及化合物本身，即其游离（非盐）形式。
[0124]
化合物1的第一种无水结晶形式在下文中被称作“形式a2”，并且是特征在于与图13中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射(xrpd)图样的多晶型物，并且已经被发现是非常有利的。
[0125]
根据一个实施方案，形式a2的特征在于在其粉末x
‑
射线衍射图样中选自在约7.3、约9.6、约11.1、约12.0、约12.7和约16.2 2
‑
θ度的那些峰的一个或多个峰。在某些实施方案中，形式a2的特征在于在其粉末x
‑
射线衍射图样中选自在约7.3、约9.6、约12.7、约16.2、约22.6和约25.1 2
‑
θ度的那些峰的两个或更多个峰。在某些实施方案中，形式a2的特征在于在其粉末x
‑
射线衍射图样中选自在约7.3、约9.6、约12.7、约16.2、约22.6和约25.1 2
‑
θ度的那些峰的三个或更多个峰。在某些实施方案中，形式a2的特征在于在其粉末x
‑
射线衍射图样中选自在约7.3、约9.6、约12.7、约16.2、约22.6和约25.1 2
‑
θ度的那些峰的4个、5个或基本上所有的峰。在特定实施方案中，形式a2的特征在于在其x
‑
射线粉末衍射图样中选自在约7.3、9.6、11.1、12.0、12.7、14.7、16.2、17.3、18.9、21.0、22.6和25.1 2
‑
θ度的那些峰的6个或更多个或基本上所有的峰。
[0126]
在一个示例性实施方案中，形式a2可以特征在于在其x
‑
射线粉末衍射(xrpd)图样中选自约在以下位置的那些峰的一个或多个、优选地6个和至多基本上所有的峰：
[0127]
应当理解，上述多晶型形式可以例如通过参考在其各自x
‑
射线衍射(xrd)图样中的任何峰来表征。如前所述，粗体印刷和星号表示可能优选用于表征多晶型物的峰。
[0128]
形式a2可以特征在于上表的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个xrpd峰(
°2θ
)。本文所述的任何多晶型物优选地以至少6个xrd或xrpd峰（
°2θ
，优选地
±
0.2）为特征。
[0129]
形式a2可以任选地特征在于，具有单斜晶系和p21空间群。形式a2可以进一步特征在于其晶胞的以下参数中的一个或多个，如下表所示：
[0130]
化合物1的形式a2具有良好的整体性能，这从其热和水吸收行为进一步明显看出，如dsc加热曲线(图22)、tga加热曲线(图23)和dvs水吸收等温线(在25℃) (图24)所示。例如，形式a2吸附非常少的水(<2%)，即使相对湿度高达100%，且因此优于形式a3。
[0131]
形式a2的另一个优点是其有利的溶解行为，如下表所示，其代表了在不同时间跨度内溶解的形式a2的化合物1的量（在fassif中在ph 6.5的非沉降溶解数据，方法描述在实
验部分中）：。
[0132]
形式a2可以通过从醇中冷却结晶而从化合物1获得，仅举一个例子。合适的方法和反应条件在实施例7中详细描述。
[0133]
例如，具有有利性能的形式a2晶体可以通过受控结晶方法可重现地制备，所述方法包括：a)制备化合物1（例如化合物1水合物，诸如化合物1水合物形式h2）在合适的溶剂（例如醇）中的分散体，b)加热分散体以获得溶液，优选澄清溶液，c)受控冷却溶液，d)添加形式a2的晶种，e)受控冷却含有晶种的溶液，例如以约0.1℃/min的速率。
[0134]
合适的醇和结晶条件，诸如温度，可源自实施例7.1
‑
7.3，其适用于特定实施方案之外。本发明进一步涉及形式a2的无水结晶化合物1，其可通过上述方法或基本上与实施例7.1
‑
7.4中所述的任何方法一致地获得。
[0135]
化合物1的另一种无水结晶形式在下文中被称作“形式a1”并且是特征在于与图14中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样的多晶型物。其制备的合适的方法在实施例7中描述。
[0136]
形式a1可以特征在于在其x
‑
射线粉末衍射图样中选自大约在以下位置的那些峰的一个或多个、优选六个、和至多基本上所有的峰：
[0137]
通过示差扫描量热法(dsc)和热重量分析法(tga)评价化合物1的形式a1的热性能，如图25和26所示。
[0138]
化合物1的第三种无水结晶形式在下文中被称作“形式a3”，并且是特征在于与图15中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样的多晶型物。其制备的合适的方法在实施例7中描述。
[0139]
形式a3可以特征在于在其x
‑
射线粉末衍射图样中选自大约在以下位置的那些峰的一个或多个、优选六个、和至多基本上所有的峰：
[0140]
从图27明显看出，化合物1的形式a3在最高达约70%的相对湿度下显示出非常小的
水吸附。形式a3可以任选地通过如下表7中所列的晶系和晶胞参数进一步表征。下表中给出了形式a3的化合物1在fassif中在ph 6.5的非沉降溶解数据：。
[0141]
化合物1的第四种无水结晶形式在下文中被称作“形式nf9”，并且是特征在于与图16中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样的多晶型物。其制备的合适的方法在实施例7中描述。
[0142]
形式nf9可以特征在于在其x
‑
射线粉末衍射图样中选自大约在以下位置的那些峰的一个或多个、优选地6个和至多基本上所有的峰：
[0143]
在另一个实施方案中，本发明提供了化合物1的水合物，优选化合物1水合物的固体形式，优选结晶化合物1水合物。本文描述了化合物1水合物的两种不同的水合物和多晶型形式。如上所述，在这些具体固体形式的上下文中，对化合物1的提及应理解为提及化合物本身，即其游离（非盐）形式。
[0144]
化合物1水合物的第一种结晶形式在下文中被称作“形式h1”，并且是特征在于与图17中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样的多晶型物。其制备的合适的方法在实施例7中描述。
[0145]
形式h1可以特征在于在其x
‑
射线粉末衍射图样中选自大约在以下位置的那些峰
的一个或多个、优选地6个和至多基本上所有的峰：
[0146]
化合物1水合物的第二种结晶形式在下文中被称作“形式h2”，并且是特征在于与图18中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样的多晶型物。其制备的合适的方法在实施例7中描述。
[0147]
形式h2可以特征在于在其x
‑
射线粉末衍射图样中选自大约在以下位置的那些峰的一个或多个、优选地6个和至多基本上所有的峰：
[0148]
呈结晶形式h2的化合物1水合物可以任选地特征在于具有三斜晶系和p1空间群。形式h2可以特征在于其晶胞的以下参数中的一个或多个，如下表7中所列。
[0149]
形式h2的热和水吸附性能如图28、29和30所示。化合物1的形式h2在fassif (ph 6.5)中的非沉降溶解数据确定如下：。
[0150]
无水化合物1的第五种晶型在下文中被称作“形式nf19”，并且是特征在于与图19中描绘的基本上一致的粉末x
‑
射线衍射图样的多晶型物。其制备的合适的方法在实施例7中描述。
[0151]
形式nf19可以特征在于在其x
‑
射线粉末衍射图样中选自大约在以下位置的那些峰的一个或多个、优选地6个和至多基本上所有的峰：
[0152]
固体形式a1、a3、h1和h2还可以（或作为替代）特征在于具有选自如下表7所示的a、b、c、α、β、γ和v的特定晶系、空间群和/或晶胞参数：表7 形式a1形式a3形式h1形式h2测量温度298k298k298k200k晶系三斜三斜单斜三斜空间群p1p1p21p1a8.940
å
10.553
å
13.206
å
8.542
å
b11.022
å
10.984
å
8.697
å
11.249
å
c12.509
å
11.530
å
20.791
å
13.150
å
α106.1
°
112.8
°
90.0
°
67.3
°
β107.4
°
112.8
°
102.8
°
89.8
°
γ90.1
°
93.7
°
90.0
°
83.3
°
v1125.7
å³
1099.2
å³
2328.0
å³
1156.6
å³
[0153]
本发明也涉及下述溶剂化物形式，它们可以通过从相应溶剂中结晶而容易地制备，但是已经发现与以上形式相比在重要性能方面的优势要小得多：化合物1的甲醇化物(被称作s1的固体形式)，化合物1的混合水合物/甲醇化物(被称作s2的固体形式)，化合物1的thf溶剂化物(被称作s3的固体形式)，众多固体形式的化合物1的1,4
‑
二氧杂环己烷溶剂化物形式(被称作nf11 [来自在室温在1,4
‑
二氧杂环己烷中约26 mg/200
µ
l的无水形式的浆转化实验]、nf29 [来自在50
‑
5℃在1,4
‑
二氧杂环己烷中的冷却结晶实验]、nf36 [来自在室温在1,4
‑
二氧杂环己烷中约52 mg/150
µ
l的无水形式的浆转化实验]的固体形式)，化合物1的氯仿溶剂化物(被称作nf15的固体形式)，呈不同固体形式的化合物1的乙酸溶剂化物形式(被称作nf16 [来自在室温在乙酸中的蒸发结晶实验]、nf18 [来自在50℃在乙酸中的蒸发结晶实验]的固体形式)，化合物1的二氯甲烷(dcm)溶剂化物(被称作nf32的固体形式)，化合物1的nmp (n
‑
甲基
‑2‑
吡咯烷酮)溶剂化物(被称作nf33的固体形式)，化合物1的乙腈溶剂化物(被称作nf35的固体形式)，化合物1的二甲基乙酰胺(dmaa)溶剂化物(被称作nf37的固体形式)。这些溶剂化物的固体形式的xrpd显示在图40
‑
52中，对应的峰列出在下表中：
[0154]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的呈形式a2的化合物1，其为优选固体形式。根据另一个实施方案，本发明提供了制备本文描述的这样的药物组合物（例如，包括有效量的呈形式a2的化合物1的药物组合物）的方法。再另一个实施方案提供了一种使用药物组合物治疗癌症的方法，所述药物组合物含有有效量的如本文中所述的呈形式a2的化合物1。根据另一个实施方案，本发明提供了呈形式a2的化合物1在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了用于用作药物的形式a2，优选地用于治疗癌症。与上文所阐述的内容一致，关于化合物1公开的示例性实施方案、范围、纯度等对于形式a2同样有效。
[0155]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的呈如上所述的无水化合物1或化合物1水合物的固体形式中的任一种的化合物1。根据另一个实施方案，本发明提供了制备本文描述的这样的药物组合物（例如，包括有效量的呈那些固体形式之一的化合物1的药物组合物）的方法。再另一个实施方案提供了使用药物组合物治疗癌症的方法，所述药物组合物含有有效量的呈如本文中所述的固体形式之一的化合物1。根据另一个实施方案，本发明提供了呈如本文中所述的固体形式的化合物1在制备用于治疗癌症
的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了如本文中所述的化合物1的固体形式，其用于用作药物，优选地用于治疗癌症。与上文所阐述的内容一致，关于化合物1公开的示例性实施方案、范围、纯度等对于固体形式同样有效。
[0156]
本发明还涉及如本文中所述的无水化合物1或化合物1水合物的固体形式，其根据实施例7中所述的方法获得或可根据实施例7中所述的方法获得。
[0157]
氘化实施方案根据另一个方面，本发明提供了化合物y的氘化衍生物。根据一个实施方案，本发明提供了：
●ꢀ8‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
(三氘基
‑
甲基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(化合物3)和
●ꢀ1‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
[3
‑
甲基
‑
(三氘基
‑
甲基)吡唑
‑4‑
基]咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(化合物4)。
●ꢀ8‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(化合物5)，及其盐。
[0158]
化合物3、4和5由下式表示：在其它实施方案中，本发明提供了阻转异构体3
‑
a、3
‑
b、4
‑
a、4
‑
b、5
‑
a和5
‑
b：
或其盐。
[0159]
与上面关于化合物1和2阐述的内容一致，本发明提供了基本上不含有各种其它阻转异构体（包括其任何盐）的化合物4
‑
a、5
‑
a、6
‑
a、4
‑
b、5
‑
b、6
‑
b。在其它实施方案中，还提供了基本上不含有杂质的这些化合物。根据另一个实施方案，相对于hplc色谱图的总面积，这些化合物含有不超过约5.0 hplc面积百分比的总有机杂质。上文关于“基本上不含有化合物2或其盐”、“不含有杂质”的化合物1和总有机杂质的面积百分比所公开的示例性和优选范围通过类推在这里同样适用于各种化合物的对应其它阻转异构体。
[0160]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含有效量的化合物3、4或5、其阻转异构体或药学上可接受的盐中的至少一种。根据另一个实施方案，本发明提供
了制备本文描述的这样的药物组合物的方法。再另一个实施方案提供了使用本文描述的药物组合物治疗癌症的方法。根据另一个实施方案，本发明提供了本文描述的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。上面关于化合物1公开的示例性和优选实施方案同样适用于这些化合物。
[0161]
制备根据本发明的化合物1和2可以从化合物y开始制备，该化合物之前已经描述过。如在wo 2016/155884中公开的，根据下述反应顺序可以制备8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(化合物y)：。
[0162]
在实施例1中给出了那些步骤a
‑
e中的每一个的示例性反应条件，以及获得起始化合物的方法。其它合适的反应条件对技术人员来说是容易明白的。
[0163]
然后可以通过与化合物y分离的合适方法获得化合物1和2，其示例性实施方案提供在实施例1、2和3中。
[0164]
使用手性色谱法，包括超临界流体色谱法(sfc)，可以从化合物y开始分离阻转异构体。合适方法的例子在实施例1和3中详细描述。
[0165]
可以对各种不希望的阻转异构体进行外消旋化，例如热外消旋化，以产生用作新起始材料的化合物y，如下面通过一个实施例示意性说明的。
[0166]
在一个替代实施方案中，通过使用光学活性的酸（例如二苯甲酰基酒石酸）结晶，可以从化合物y开始制备化合物1和2。化合物y与光学活性的酸的反应会产生一对阻转异构体盐。化合物1和2的这些盐表现出不同的物理化学性能（例如溶解度、相分布），并可以利用这些差异进行分离。
[0167]
如下面方案所示，在一个实施方案中，使化合物y与光学活性的酸反应，在母液中产生两种盐的混合物，化合物2的盐(l
‑
盐b)首先沉淀并被通过过滤除去，仅在进一步浓缩母液和沉淀后才收集化合物1的相应盐(l
‑
盐a)。然后将化合物1的盐首先转化为其游离形式并分离，并然后与相应的其它光学活性形式的酸反应，得到化合物1的相应盐，其在随后的步骤中转化为具有高光学纯度的游离碱。化合物2可以同时进行外消旋化以得到作为新鲜起始原料的化合物y。
[0168]
在实施例2和图6中提供了合适的制备方案的详细实施例。
[0169]
根据本发明的氘化化合物3、4和5可以如实施例6中详细描述的那样制备，并且阻转异构体、盐、溶剂化物和固体形式基本上如化合物1和2的那些制备。
[0170]
用途在下文中，对“根据本发明的化合物”的任何一般性提及应意味着适用于本发明的化合物的所有实施方案，包括化合物1或2、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或固体形式，并且可以读作“化合物1或2、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或固体形式”。同样地，对根
据本发明的氘化化合物的任何提及应不仅包括化合物3、4或5，而且还包括前述任一种的任何阻转异构体、盐或固体形式。
[0171]
本发明还包括本发明的阻转异构体、其药学上可接受的固体形式、溶剂化物及盐以及氘化的atm抑制剂、其阻转异构体和药学上可接受的盐用于抑制、调节和/或调整atm激酶的信号传递级联的用途，并从而为研究和/或诊断提供新的工具。因此，本发明还涉及根据本发明的化合物（包括其氘化形式）用于抑制atm激酶的用途。术语“抑制”是指，基于根据本发明的特异性化合物的作用的活性的任何降低，通过所述化合物能够如此与靶分子相互作用，以至于可以实现识别、结合和阻断。所述化合物的特征在于对atm激酶的高亲和力。此外，所述化合物是高度选择性的，并因此能够基本上排他地和直接地识别atm激酶。为了用于研究和/或诊断中，氘化化合物，即化合物3、4或5、或其阻转异构体或盐或固体形式被认为是有用的，例如用于测定中。
[0172]
本发明一般涵盖根据本发明的化合物（包括氘化化合物）在治疗由atm激酶的活性引起、介导和/或传播的疾病中的用途。
[0173]
因此，本发明广泛地涉及用作药物的根据本发明的化合物，包括氘化化合物。
[0174]
因此，本发明也涉及用于治疗由atm激酶的活性引起、介导和/或传播的任何疾病的根据本发明的化合物，包括氘化化合物。本发明相应地还涉及根据本发明的化合物(包括氘化化合物)在制备用于治疗由atm激酶的活性引起、介导和/或传播的任何疾病的药物中的用途。换而言之，本发明也公开了用于治疗受atm激酶抑制影响的疾病的根据本发明的化合物，包括氘化化合物。
[0175]
另外，根据本发明的化合物或氘化化合物也可以用作在动物和/或细胞培养模型中或在本技术所提及的临床疾病中测试激酶依赖性信号传递途径的试剂。如本文所讨论的，这些信号传递途径与各种疾病相关。
[0176]
本发明也涉及用于治疗癌症和/或肿瘤的根据本发明的化合物，包括其药学上可接受的盐、溶剂化物、固体和氘化形式；并涉及其在制备用于治疗癌症和/或肿瘤的药物中的用途。
[0177]
本发明还教导了治疗癌症和/或肿瘤的方法，其中将有效量的至少一种根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、氘化或固体形式施用给待治疗的对象。在本发明意义上，优选的对象是人类或动物，特别优选人类。
[0178]
癌症/肿瘤可以特别选自鳞状上皮、膀胱、胃、肾、头、颈、食道、子宫颈、甲状腺、肠、肝、脑、前列腺、泌尿生殖道、淋巴系统、喉、肺、皮肤、血液和免疫系统的癌症/肿瘤，和/或所述癌症可以选自单核细胞性白血病、肺腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。应当理解，癌细胞的敏化应涵盖上述相同癌症和肿瘤的细胞。
[0179]
本发明也涉及一种药物，其包含根据本发明的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物、氘化或固体形式。
[0180]
此外，本发明涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物、氘化或固体形式，任选地与至少一种药学上可接受的赋形剂一起。
[0181]“药物”和“药物组合物”是指可用于治疗患者的任何组合物，所述患者至少暂时地表现出整体病况或患者机体个别部分的病况的病原性改变，优选作为癌症和/或肿瘤的结果。
[0182]
可以根据本发明以任何方式将根据本发明的化合物或药物组合物分别递送到细胞或生物体中，所述方式使得atm激酶能够与在药物组合物中存在的化合物接触，作为其结果诱导应答。可以口服地、透皮地、透粘膜地、经尿道地、阴道地、直肠地、肺地、肠内地和/或胃肠外地施用本发明的药物组合物。选择的施用类型取决于适应症、要施用的剂量、个体的具体参数等。具体地，不同类型的施用可以促进位点特异性的治疗，从而最大限度地减少副作用并降低活性化合物剂量。注射可以是真皮内的、皮下的、肌肉内的或静脉内的。例如，借助所谓的疫苗接种枪或借助于注射器，可以进行施用。也可能将物质作为气雾剂提供，其被生物体（优选人患者）吸入。
[0183]
在优选的实施方案中，口服施用根据本发明的化合物(呈其形式中的任一种)。就患者顺应性而言，口服施用是有利的。因此，药物组合物优选为口服固体药物组合物。
[0184]
根据本发明的化合物（特别是化合物1和2及其固体形式，特别是化合物1或其固体形式）的一个优点在于，由于好的稳定性和高的生物利用度，它们易于使自身配制成口服固体剂型。
[0185]
组合物以合适的剂量和以本身已知的方式使用对应于期望的施用类型的常规固体或液体赋形剂，可以分别制备根据本发明的组合物或药物组合物。因此，本领域技术人员已知的药学上可接受的赋形剂可以基本上形成根据本发明的药物组合物的一部分，其中与活性化合物组合以制备单剂量的赋形剂的量随剂量和施用类型而变化。这样的药学上可接受的赋形剂包括填充剂、稳定剂、络合剂、抗氧化剂、溶剂、粘合剂、润滑剂、盐、缓冲剂、防腐剂、调节剂等。这类赋形剂的例子是水、植物油、苯甲醇、亚烷基二醇、聚乙二醇、kolliphor、三乙酸甘油酯、明胶、碳水化合物例如乳糖或淀粉、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、硬脂酸镁、滑石和凡士林。
[0186]
如上所述，本发明的药物组合物优选用于口服施用。药物组合物通常可以呈片剂、膜片、糖衣丸、锭剂、胶囊剂、丸剂、粉末、颗粒剂、糖浆剂、汁剂、滴剂、溶液剂、分散体、混悬剂、栓剂、乳剂、植入剂、乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂、洗剂、血清、油、喷雾剂、气雾剂、粘附剂、硬膏剂或绷带的形式。口服施用形式优选为片剂、膜片、糖衣丸、锭剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、糖浆剂、汁剂、滴剂、溶液剂、分散体或混悬剂。
[0187]
此外，可以考虑胃肠外药物组合物，例如，栓剂、混悬液、乳剂、植入剂或溶液，优选油性或水性溶液。对于局部应用，根据本发明的化合物可以以常规方式与至少一种药学上可接受的赋形剂（例如微晶纤维素）和任选的其它助剂（例如，润湿剂）一起配制以产生可施用于皮肤的组合物，例如，乳膏剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂、粉剂或乳剂，或产生可施用于皮肤的液体制剂，例如溶液、混悬液、洗剂、血清、油、喷雾剂或气雾剂。
[0188]
药物组合物也可以呈注射溶液的形式。对于注射溶液的制备，可以使用水性介质，例如蒸馏水或生理盐溶液。药物组合物也可以以固体组合物的形式提供，例如以冻干状态，且然后可以通过添加溶解剂（例如，蒸馏水或缓冲剂）制备用于通过注射施用。本领域技术人员熟知制备冻干粉剂的基本原理。
[0189]
根据本发明的化合物在含有至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物中的量可以是0.1
‑
100重量%。重要的是，药物组合物包含有效量的化合物，任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起。简单的药物组合物可以是在硬明胶胶囊中处于固体形式（诸如粉末）的根据本发明的化合物。术语“有效量”或“有效剂量”在本文中可互换使用，且表示对细胞、组织、器官或哺乳动物中的疾病或病理变化（优选癌症和/或肿瘤）具有治疗相关作用的根据本发明的化合物的量。
[0190]
根据本发明的化合物的“治疗有效量”表示，在必要的剂量和时间段内有效的量，当施用给患有atmi调节性或依赖性病症、优选癌症的患者时，其将具有预期的治疗效果，例如，减轻、改善、缓解或消除患者中病症或癌症的一种或多种表现，或治疗患者过程中的任何其它临床结果。治疗有效不一定通过施用一个剂量发生，并且可能仅在施用一系列剂量之后发生。因而，可以在一次或多次施用中施用治疗有效量。这样的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及单独的或组合的根据本发明的化合物在个体中引起期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中根据本发明的化合物的任何毒性或有害作用被治疗有益效果超过的量。
[0191]
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的化合物(或盐、溶剂化物、氘化物或固体)以每个剂量单位5 mg至1 g的剂量施用，例如每个剂量单位10
‑
750 mg，诸如每个剂量单位20
‑
500 mg，诸如每个单位25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350 mg。已经估计化合物1的生物有效剂量是在每天1次25
‑
350 mg的范围内。
[0192]
由于它们对atm激酶具有令人惊讶地强的和/或选择性的抑制（其通过双链dna的修复来调节细胞过程），本发明的化合物可以以有利低剂量施用，同时它们实现与使用效力较低或选择性较低的抑制剂相比类似或甚至更好的生物效能。减少的剂量通常与减少的医学副作用有关。此外，高选择性抑制通常也被不希望的副作用的减少所反映。
[0193]“治疗”病症或患者表示采取步骤以获得有益的或期望的结果，包括临床结果。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：要治疗的疾病（最优选癌症）的一种或多种症状的减轻、改善；疾病程度的减轻；疾病进展的延迟或减慢；疾病状态的改善、减轻或稳定；或其它有益的结果。应当明白，对“治疗”的提及包括预防以及减轻病症的已确定症状。因此，“治疗”状态、障碍或病症包括：(1)预防或延缓在对象中发展的所述状态、障碍或病症的临床症状的出现，所述对象可能患有或易患所述状态、障碍或病症，但尚未经历或显示所述状态、障碍或病症的临床或亚临床症状，(2)抑制所述状态、障碍或病症，即阻止、减少或延迟疾病的发展或其复发（在维持治疗的情况下)或其至少一种临床或亚临床症状，或(3)缓解或减轻疾病，即引起所述状态、障碍或病症或其临床或亚临床症状中的至少一种的消退。在某些实施方案中，“治疗”包括(1)和(2)。
[0194]“肿瘤”当它应用于诊断出癌症或疑似具有癌症的对象时，表示恶性的或潜在地恶性的任何大小的肿瘤或组织团块，并包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。实体瘤是组织的异常生长或团块，通常不含有囊肿或液体区域。不同类型的实体瘤用形成它们的细胞的类型来命名。实体瘤的例子是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病（血液的癌症）通常不形成实体瘤。
[0195]
将化合物“施用”给患者（和该短语的语法等效词）表示直接施用，其可以是由医学专业人员施用给患者，或者可以是自我施用，和/或间接施用，这可能是开处方药的行为。例如，指导患者自我施用药物或为患者提供药物处方的医师在本发明的上下文中应被视为向
患者施用药物。
[0196]
药物或药物制剂的所有以上和另外赋形剂或其它组分是本领域技术人员熟悉的，并且可以在常规实验中进行根据本发明的教导的特殊配制。
[0197]
联合疗法包含根据本发明的化合物的药物和药物组合物，以及这些化合物用于治疗激酶介导的障碍的用途，是尤其是治疗癌症的非常有前途的方案。根据本发明的化合物可以作为单一疗法施用，但优选地，如上所述，与其它疗法（例如化学疗法或放射疗法）联合施用。如上所述，对化合物的提及应包括其任何盐、溶剂化物、氘化或固体形式。
[0198]
atm在dna修复过程中的关键参与以及atm激酶缺乏使哺乳动物细胞变得对辐射更加敏感的证据，使得atm特异性抑制剂能够治疗性用作通过辐照疗法和/或化学疗法(化学疗法优选地旨在诱导dna双链损伤)的癌症（例如，实体瘤）的治疗的一部分。如前面解释的，atm是一种有吸引力的干预措施，以抑制治疗诱导的dsb的修复。因此，根据本发明的化合物以其任何形式与放射疗法和/或破坏dna的化学疗法的组合是非常有利的。
[0199]
因此，本发明涉及根据本发明的化合物和放射疗法(rt)的组合。因此，本发明涉及与放射疗法联合用于治疗癌症和/或肿瘤的本发明的化合物或其药学上可接受的盐或固体形式。换而言之，本发明涉及根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐或固体形式在制备用于与放射疗法联合治疗癌症和/或肿瘤的药物中的用途，以及因此涉及与放射疗法联合施用根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐或固体形式的治疗癌症的方法。本发明进一步涉及用于使癌细胞分别对电离辐射或放射疗法(rt)敏感的根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐或固体形式。
[0200]
已经证实化合物1与临床相关的辐射方案（即放射疗法）联合在体内产生显著的剂量依赖性抗肿瘤应答。实施例8和图20提供了所获得结果的细节。
[0201]
仅举一个例子，合适的施用方案可以包括在一周内（即连续5天，然后是2天停用）分5次（每天每次施用3戈瑞）施用15戈瑞(gy)的rt剂量和在同一天口服施用根据本发明的化合物，这可以重复至少一次。
[0202]
在临床上使用的工业辐照方法优选地包括光子辐照（经典的电磁x
‑
射线/γ辐射）、质子辐照、重离子辐照（离子化的碳）和中子辐照，但不限于此。在本发明意义上的这些放射疗法和其它合适的辐照疗法是本领域技术人员已知的，例如，从herrmann等人(2006) klinische strahlenbiologie [clinical radiation biology], elsevier munich, 第4版, 67
‑
68; bhide和nutting (2010) bmc medicine 8: 25; choi和hung (2010) current urology reports 11(3): 172，其整个内容特此通过引用并入本文)。作为最常见的应用，光子辐照已通过imrt（强度调制的放射疗法）方法和通过成像方法（三维适形放射疗法）在辐照计划和性能方面进行了技术改进，以实现可能最精确的聚焦。
[0203]
根据另一个方面，本发明涉及根据本发明的化合物和dna损伤剂的组合；因此涉及与dna损伤剂联合用于治疗癌症和/或肿瘤的根据本发明的化合物，根据本发明的化合物在制备用于与dna损伤剂联合治疗癌症的药物中的用途，以及涉及施用根据本发明的化合物和dna损伤剂的治疗癌症的方法。如前文一般性解释的，化合物应包括药学上可接受的盐、固体形式和溶剂化物，尤其是与组合物和治疗相关的。
[0204]
根据本发明的dna损伤剂和化合物的施用可以是同时的或依次的。
[0205]
本文中使用的dna损伤剂是能够在细胞（特别优选癌细胞）中诱导dna损伤的试剂，示例性实施方案如下所述。
[0206]
如前面解释的，atm激酶是dna双链断裂(dsb)修复的关键调节剂，所述dsb由广泛使用的癌症治疗剂（诸如电离辐射(ir)和dna损伤剂）诱导。在dsb事件后，atm向包括p53在内的众多下游效应物发出信号。未修复的dsb会导致检验点应答的激活、细胞周期停滞，并最终导致肿瘤细胞死亡。
[0207]
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了包含治疗上有效的根据本发明的化合物和dna损伤剂的药物组合物。
[0208]
适用于组合使用（治疗）（包括药物组合物或试剂盒）的dna损伤剂优选地选自：
●ꢀ
烷化剂，诸如六甲蜜胺、苯达莫司汀、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、异环磷酰胺、英丙舒凡甲苯磺酸盐、洛莫司汀、美法仑、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、尼莫司汀、雷莫司汀、替莫唑胺、塞替派、曲奥舒凡、mechloroetamine、卡波醌、阿帕齐醌、福莫司汀、葡膦酰胺、帕磷酰胺、哌泊溴烷、曲磷胺、尿嘧啶氮芥：
●ꢀ
铂化合物，诸如卡铂、顺铂、依他铂、米立铂水合物、奥沙利铂、洛铂、奈达铂、吡铂、沙铂；
●ꢀ
拓扑异构酶抑制剂，例如伊立替康、sn38、托泊替康、喜树碱、卢比替康、贝洛替康、依托泊苷、柔红霉素、多柔比星、阿柔比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星、佐柔比星、安吖啶；
●ꢀ
聚
‑
(adp
‑
核糖)
‑
聚合酶(parp)抑制剂，例如奥拉帕尼、尼拉帕尼、维利帕尼；
●ꢀ
atr (共济失调毛细血管扩张症和rad3相关的)抑制剂，例如m6620 (vx
‑
970: 3
‑
[3
‑
(4
‑
甲基氨基甲基
‑
苯基)
‑
异噁唑
‑5‑
基]
‑5‑
[4
‑
(丙烷
‑2‑
磺酰基)
‑
苯基]
‑
吡嗪
‑2‑
基胺)、m4344 (vx
‑
803: 2
‑
氨基
‑6‑
氟
‑
吡唑并[1,5
‑
a]嘧啶
‑3‑
甲酸[5'
‑
氟
‑4‑
(4
‑
氧杂环丁烷
‑3‑
基
‑
哌嗪
‑1‑
羰基)
‑
3,4,5,6
‑
四氢
‑
2h
‑
[1,4']联吡啶
‑
3'
‑
基]
‑
酰胺)；azd
‑
6738 (4
‑
[4
‑
[1
‑
[[s(r)]
‑
s
‑
甲基亚氨磺酰基]环丙基]
‑6‑
[(3r)
‑3‑
甲基
‑4‑
吗啉基]
‑2‑
嘧啶基]
‑
1h
‑
吡咯并[2,3
‑
b]吡啶)和2
‑
[(3r)
‑3‑
甲基吗啉
‑4‑
基]
‑4‑
(1
‑
甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑5‑
基)
‑8‑
(1h
‑
吡唑
‑5‑
基)
‑
1,7
‑
萘啶；
●ꢀ
dna
‑
修饰剂，诸如氨柔比星、比生群、地西他滨、米托蒽醌、丙卡巴肼、曲贝替定、氯法拉滨、安吖啶、溴他利星、匹克生琼、拉罗莫司汀；
●ꢀ
抗癌抗生素，诸如博来霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、左旋咪唑、米替福新、丝裂霉素c、罗米地辛、链佐星、戊柔比星、净司他丁、佐柔比星、daunurobicin、普卡霉素、阿柔比星、培洛霉素、吡柔比星；
●ꢀ
α发射体，诸如alpharadin (二氯化
223
ra，xofgio)、
211
at、
213
bi、
225
ac、
227
th；特别优选的是依托泊苷、伊立替康、雷佐生、索布佐生、托泊替康、喜树碱、多柔比星、安吖啶、parp抑制剂和atr抑制剂。
[0209]
在hbcx
‑
10患者衍生的三重阴性的乳腺癌异种移植物模型（在免疫缺陷的雌性小鼠中开发）中证实了与示例性parp抑制剂奥拉帕尼组合的化合物1的效力，其结果显示在图21中。该实验的更多细节在实施例9中描述。
[0210]
本发明还可以作为含有根据本发明的化合物的试剂盒实施。该试剂盒由以下单独包装组成：(a)有效量的根据本发明的化合物和/或其生理盐、溶剂化物或固体形式，和(b)
有效量的其它活性化合物。其它活性化合物优选地是dna损伤剂。
[0211]
试剂盒可以含有合适的容器，例如，盒子或纸箱、单独的瓶子、袋子或安瓿。试剂盒可以含有，例如，单独的安瓿或管形瓶，它们各自含有有效量的根据本发明的化合物和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或固体形式，或有效量的其它活性化合物，诸如呈溶解或冻干形式的dna损伤剂。本发明的试剂盒还可以含有包含书面说明或将用户指向书面说明的物品，其解释了本发明的化合物的操作。
[0212]
总之，应当指出，根据本发明的化合物可以单独使用和/或与其它治疗措施（例如，外科手术干预、免疫疗法、放射疗法和/或化学疗法）联合使用。后者涉及用任何期望的活性化合物（化学或生物，包括nme：新分子实体，nce：新化学实体，和nbe：新生物实体）作为单一疗法和/或靶向/脱靶联合疗法的靶向疗法。
[0213]
在说明书中引用的所有文件在此旨在通过引用的方式以其整体并入本发明的公开内容中。
[0214]
不言而喻，本发明不限于本文所述的具体化合物、药物组合物、用途和方法，因为这些内容可以变化。此外，不言而喻，此处使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的保护范围。如在此在说明书（包括所附权利要求书）中使用的，单数形式的词形式，例如“一个”或“所述”，包括复数形式的等价物，只要上下文没有另外明确指示即可。例如，对“一种化合物”的提及包括单一化合物或多种化合物，它们又可以相同或不同，或者对“一种方法”的提及包括本领域技术人员已知的等效步骤和方法。将主题称为“包含”某些特征应解释为是指，该主题应包括那些特征，但不排除其它特征的存在，只要这些特征不使该主题变得不可行。
[0215]
实验如各种参数和实验结果所证明的，根据本发明的化合物表现出有利的性能。下面提供了用于分析和表征处于其所有形式的根据本发明的化合物的实验方法。
[0216]
测定激酶活性的测量是本领域技术人员熟知的技术。在文献中描述了使用底物例如组蛋白(alessi等人(1996) febs lett. 399(3): 333)或碱性髓磷脂蛋白测定激酶活性的通用试验系统(campos
‑
gonz
á
lez & glenney (1992) jbc 267: 14535)。多种测定系统可用于鉴定激酶抑制剂。在闪烁迫近测定(sorg等人(2002) j biomolecular screening 7: 11)和闪板测定中，使用atp测量作为底物的蛋白或肽的放射性磷酸化。在抑制性化合物的存在下，可检测到放射性信号的减少或根本检测不到放射性信号。此外，同质时间分辨荧光共振能量转移(htr
‑
fret)和荧光偏振(fp)技术可用作测定方法(sills等人(2002) j biomolecular screening 191)。其它非放射性elisa方法使用特异性的磷酸
‑
抗体(磷酸
‑
ab)。磷酸
‑
ab仅结合磷酸化的底物。这种结合可以使用第二过氧化物酶
‑
缀合的抗
‑
绵羊抗体通过化学发光来检测。
[0217]
为了本发明的目的，使用以下测定评估化合物的相关靶向性能：atm激酶测定
‑ꢀ
atm抑制的测定(ic
50 atm)：借助于生化atm激酶测定来确定ic
50
值。所述测定由两个步骤组成：酶促反应和检测步骤。首先，将atm (共济失调毛细血管扩张症突变)蛋白和试验物在不同浓度与添加的底物蛋白p53和atp一起温育。atm介导p53在多个位置的磷酸化，包括在氨基酸s15。借助于
特异性抗体和tr
‑
fret技术，确定磷酸化的p53的量。酶促atm测定作为基于tr
‑
fret(htrf
tm
,cisbiobioassays)的384孔测定进行。在第一步中，将纯化的人重组atm（人atm,全长,genbankidnm_000051，在哺乳动物细胞系中表达）与不同浓度的atm抑制剂一起在测定缓冲液中温育15分钟，且没有试验物的实验作为阴性或中性对照。测定缓冲液包含25mmhepesph8.0、10mmmg(ch3coo)2、1mmmncl2、0.1%bsa和0.01%brij
®
35、5mm二硫苏糖醇(dtt)。使用echo555(labcyte)将试验物溶液分配到微量滴定板中。在第二步中，加入纯化的人重组c
‑
myc
‑
标记的p53（人p53，全长，genbankidbc003596，在sf21昆虫细胞中表达）和atp，并将反应混合物在22℃温育30
‑
35分钟。药理学上有关的测定体积是5μl。在反应混合物的温育期间测定的最终浓度为0.3
‑
0.4nmatm、50
‑
75nmp53和10
µ
matp。通过加入edta终止酶促反应。通过能够实现fret的特异性抗体[用荧光团(fluorophorene)铕(eu)作为供体和d2作为受体进行标记(cisbiobioassays)]来检测作为在有atp存在下atm介导的反应的结果的磷酸化的p53的形成。将2
µ
l含有抗体的停止溶液(12.5mmhepesph8.0、125mmedta、30mm氯化钠、300mm氟化钾、0.1006%吐温
‑
20、0.005%brij
®
35、0.21nm抗
‑
磷酸
‑
p53(ser15)
‑
eu抗体和15nm抗
‑
cmyc
‑
d2抗体)加入反应混合物。通常2小时（1.5至15小时之间）的温育以后，为了产生信号，使用trf模式（和用激光激发）在平板读数器(envision,perkinelmer)中分析平板。在以340nm的波长激发供体铕以后，测量受体d2在665nm和供体eu在615nm的发射荧光。磷酸化的p53的量与发射光的量的商（即在665nm和615nm的相对荧光单位(rfu)）成正比。借助于genedatascreener软件处理测量数据。具体而言，通过借助于非线性回归分析将剂量/作用曲线拟合到数据点来进行ic
50
测定。ic
50
=半数最大抑制浓度atp=腺苷三磷酸tr
‑
fret=时间分辨荧光共振能量转移htrf
®
=同质时间分辨荧光hepes=2
‑
(4
‑
(2
‑
羟基乙基)
‑1‑
哌嗪基)乙磺酸mg(ch3coo)2=醋酸镁mncl2=氯化锰(ii)bsa=牛血清白蛋白edta=乙二胺四乙酸盐trf=时间分辨荧光。
[0218]
缩写在全文中适用，除非相反说明。
[0219]
用于确定在1000
µ
m的atp浓度下的ic50值的测定与上述测定的不同之处仅在于所述atp浓度。
[0220]
细胞pchk2测定：为了鉴定抑制蛋白激酶chk2(检验点激酶2)在氨基酸苏氨酸68处的磷酸化的物质，在hct116细胞中使用了基于免疫荧光的“高含量”分析测定。
[0221]
用于在人结肠癌细胞系hct116中鉴定博来霉素诱导的chk2磷酸化(磷酸
‑
thr68)的抑制剂的基于体外细胞的免疫荧光测定：将hct116细胞以确定的细胞密度接种在384
‑
孔平板内的培养基(dmem高葡萄糖,
2 mm glutamax, 1 mm丙酮酸钠, 10�s)中，并在37℃和10%的co2下温育过夜。第二天，将试验物以确定的浓度范围（1 nm至30
µ
m）与10
µ
m博来霉素组合加入，其中溶剂dmso的浓度保持恒定在0.5%。在37℃和10%的co2下温育4小时以后，将细胞固定（5分钟，4%在pbs中的甲醛），透化（10分钟，0.2%在pbs中的triton x
‑
100），并在封闭非特异性结合位点(10%山羊血清, 1%在pbs中的bsa)以后，与特异性抗
‑
pchk2抗体（cell signalling #2661）一起在4℃温育过夜。使用alexa488
‑
标记的第二抗
‑
兔igg抗体测定pchk2 (thr68)。用碘化丙啶对dna的平行染色能够确定细胞计数。使用高容量成像仪(molecular devices imx ultra)检测pchk2信号，并使用属于该仪器的metaxpress软件进行自动图像分析。确定具有高于定义背景的pchk2信号的细胞核的数目。
[0222]
dmem：dulbecco氏改良的伊格尔培养基；fcs：胎牛血清，pbs：磷酸盐缓冲盐水(缩写在全文中适用，除非另外指出)。
[0223]
此外，其它激酶的作用，特别是抑制作用，以及因此根据本发明的化合物的选择性，可以借助于下述测定来确定：atr/atrip激酶测定通过atr/atrip酶测定来确定ic
50
值。该测定包含两个步骤：酶促反应和检测步骤。首先，将atr/atrip蛋白(共济失调毛细血管扩张症和rad3相关的蛋白/atr相互作用蛋白)、不同浓度的目标化合物、作为底物蛋白的p53和腺苷三磷酸(atp)的混合物在测定缓冲液中温育。atr在ser15和其它残基处磷酸化p53。然后使用特异性抗体和tr
‑
fret测定技术检测磷酸化的p53的量。
[0224]
详细说明：atr/atrip酶测定作为基于tr
‑
fret
‑ꢀ
(htrf
tm
, cisbio bioassays)的384
‑
孔测定进行。在第一步中，将纯化的人重组atr/atrip (人atr，全长，genbank id：nm_001184.3，和人atrip，全长，genbank id af451323.1，在哺乳动物细胞系中共表达）在含有不同浓度的试验化合物或不含试验化合物（作为阴性对照）的测定缓冲液在22℃温育15分钟。测定缓冲液含有25 mm hepes ph 8.0、10 mm mg(ch3coo)2、1 mm mncl2、0.1%bsa、0.01%brij
®
35和5mm二硫苏糖醇(dtt)。echo 555 (labcyte)用于分配化合物溶液。然后，在第二步中，加入纯化的人重组cmyc
‑
标记的p53（人p53, 全长, genbank id: bc003596，在sf21昆虫细胞中表达）和atp，并将反应混合物在22℃温育25
‑
35分钟，通常25分钟。药理学上有关的测定体积是5
µ
l。在反应混合物温育期间测定中的最终浓度为0.3
ꢀ‑ꢀ
0.5 nm（通常0.3 nm）atr/atrip、50 nm p53和0.5
µ
m atp。通过加入edta终止酶促反应。通过使用能够实现fret的特异性抗体[用荧光团铕(eu)作为供体和d2作为受体进行标记(cisbio bioassays)]来检测作为在有atp存在下atr介导的反应的结果的磷酸化的p53的产生。为此目的，将2
µ
l含有抗体的停止溶液(12.5 mm hepes ph 8.0、125 mm edta、30 mm氯化钠、300mm氟化钾、0.006%吐温
‑
20、0.005%brij
®
35、0.21 nm抗
‑
磷酸
‑
p53(ser15)
‑
eu抗体、15 nm抗
‑
cmyc
‑
d2抗体)加入反应混合物中。信号产生2小时以后，使用具有激光激发的trf模式在envision (perkinelmer)微量培养板读数器中分析平板。在340 nm激发供体铕以后，测量受体d2在665 nm和供体eu在615 nm的发射荧光。磷酸化的p53的量与发射光的量的比率（即在665 nm和615 nm的相对荧光单位(rfu)之比）成正比。采用genedata screener软件处理数据。具体而言，通过使用非线性回归分析将剂量
‑
响应曲线拟合到数据点以常见方式确定ic
50
值。
[0225]
关于缩写，参见上面的列表。
[0226]
pchk1细胞测定chk1激酶在atr下游起作用，并在dna损伤检验点控制中起关键作用。chk1的激活涉及ser317和ser345的磷酸化（被视为atr磷酸化/激活的优先靶点），并且响应于dna复制受阻和某些形式的遗传毒性应激而发生。在检验点激活后，在ser 345处的磷酸化会起将chk1定位到细胞核的作用。
[0227]
该测定测量了在用化合物和羟基脲（其由于dntp耗尽而促进叉停滞）处理并使用免疫细胞化学程序和高容量成像后ht29结肠腺癌细胞中chk1 (ser 345)的磷酸化的降低。
[0228]
对于测定，将ht29细胞铺板在培养基(dmem高葡萄糖(无酚磺酞)、2mm glutamax、1mm丙酮酸盐、10�s在greiner 384孔板中, 黑色,
ꢀµ
clear # 781090 (2500个细胞/孔/30 μl)中并在37℃、10%co2和90%rh下温育至少20小时。同时加入稀释的试验化合物(1nm
ꢀ‑ꢀ
30
µ
m终浓度)和羟基脲(3mm终浓度)，并将细胞在37℃温育4小时。用100%meoh (
‑
20℃冷的)固定/透化和用0.2%triton x
‑
100透化以后，使用特异性抗
‑
pchk1抗体(cell signaling，#2348bf)和荧光地标记的第二抗体(alexa fluor
®
488山羊抗
‑
兔f(ab')2片段，invitrogen a11070)进行完整的免疫细胞化学程序，并为细胞计数进行平行核染色。
[0229]
在imagexpress ultra共聚焦高容量读数器上检测核定位的pchk1信号，并报告为阳性细胞百分比（细胞核）。
[0230]
dna
‑
pk测定激酶测定作为基于htrf
®
的384
‑
孔测定进行。在第一步中，将dna
‑
pk蛋白复合物与或不与试验化合物一起在22℃温育15分钟。在加入stk
‑
底物1
‑
生物素(cisbio)、mg
‑
atp、dna和星形孢菌素以后，将反应混合物在22℃温育60
‑
80分钟（取决于dna
‑
pk蛋白复合物的活性）。使用echo 555 (labcyte)分配化合物溶液。测定缓冲液由25mm hepes ph 7.4、11mm mgcl2、80mm kcl、0.45mm edta和0.5mm egta组成，并含有1mm二硫苏糖醇(dtt)、0.17%bsa和0.01%吐温
®
20。药理学相关体积为5
µ
l。在反应混合物温育期间测定中的最终浓度为50
‑
100ng/孔dna
‑
pk蛋白复合物(取决于dna
‑
pk蛋白复合物的活性)、1
µ
m stk
‑
底物1
‑
生物素、10
µ
m mg
‑
atp、80ng/孔的来自小牛胸腺的dna和1
µ
m星形孢菌素。通过加入edta停止酶促反应。通过实现fret的作为供体的用铕(eu)标记的特异性抗
‑
磷酸stk
‑
抗体(cisbio)和作为受体的用xl665标记的抗生蛋白链菌素(cisbio)，检测由dna
‑
pk介导的反应引起的磷酸化的stk
‑
底物1
‑
生物素的产生。为此目的，将4
µ
l含有抗体和抗生蛋白链菌素的停止溶液(12.5 mm hepes ph 8.0、125 mm edta、30 mm氯化钠、300mm氟化钾、0.006%吐温
‑
20、0.005%brij
®
35、0.179 nm抗
‑
磷酸
‑
stk抗体、160 nm抗生蛋白链菌素
‑
xl665)加入反应混合物中。在信号产生1小时后，在rubystar或pherastar微量培养板读数器(bmg labtech)上分析平板。磷酸化底物的量与在发射波长665 nm (磷酸肽敏感的波长/xl665的发射波长)的荧光单位(激发波长337 nm)与在620 nm (参考波长铕)的单位的比率成正比。使用genedata screener
®
软件计算ic50
‑
值。(molecular cancer therapeutics 2003, 1257
‑
1264; dna
‑
dependent protein kinase inhibitors as drug candidates for the treatment of cancer; a.kashishian, h.douangpanya, d.clark, s.t.schlachter, c.todd eary, j.g.schiro, h.huang, l.e.burgess, e.a.kesicki, 和j.halbrook.)。
[0231]
pdna
‑
pk细胞测定在含有10%胎牛血清和2 mm谷氨酰胺的memα培养基中在37℃和10%co2下培养hct116细胞。将细胞使用胰蛋白酶/edta从培养容器的底部脱离，在离心管中离心，溶解于新鲜培养基中并测定细胞密度。将100,000个细胞接种在24
‑
孔细胞培养平板的每孔1 ml培养基中并培养过夜。次日，将在新鲜培养基中的10 μm博来霉素(dna嵌入剂和dna双链断裂诱导物)和试验物加入细胞中并培养另外6小时。然后进行细胞裂解，并将细胞裂解物点涂在96
‑
孔elisa板(sigma
‑
aldrich wh0005591m2：总dna
‑
pk, abcam ab18192或epitomics em09912: 磷酸
‑
丝氨酸2056 dna
‑
pk)上，将其封闭并用dna
‑
pk特异性抗体包被，并在4℃温育过夜。随后，用检测抗体(abcam ab79444：总dna
‑
pk)和抗生蛋白链菌素
‑
hrp缀合物处理96
‑
孔elisa平板。使用化学发光试剂进行酶促反应的进程，使用mithras lb940测量化学发光。将磷酸
‑
dna
‑
pk特异性抗体的信号标准化为针对全蛋白dna
‑
pkc的抗体的信号。通过参考博来霉素处理的媒介物对照组的信号水平来确定ic
50
值或百分比（对照的100%）。dmso对照用作空白。
[0232]
mem：最低基础培养基；dmso：二甲基亚砜。
[0233]
pde2a1测定使用商购可得的测定(cerep, 目录参考4071, sop n
°
1c1054)，其旨在评价化合物对人磷酸二酯酶
‑
2a1的活性的影响，其中通过使用在sf9细胞中表达的人重组酶测量来自camp的5’amp形成来量化。
[0234]
将试验化合物、参照化合物或水(对照)加入含有40 mm tris/hcl (ph 7.4)、8 mm mgcl2和1.7 mm egta/naoh、1.8
µ
m camp和1
µ
ci [3h]camp的缓冲液中。
[0235]
此后，通过加入酶(约2.5u)引发反应，并将混合物在22℃温育20分钟。
[0236]
对于基础对照测量，从反应混合物中省略酶。
[0237]
温育后，加入spa珠子。
[0238]
在22℃振荡30分钟后，用闪烁计数器(topcount, packard)定量[3h]5’amp的量。
[0239]
将结果表示为对照酶活性的抑制百分比。
[0240]
标准抑制性参照化合物是ehna (赤式
‑9‑
(2
‑
羟基
‑3‑
壬基)腺嘌呤)，其在每个实验中以几种浓度进行测试以获得抑制曲线，从中计算其ic
50
值。
[0241]
参考书目：maurice d.h., ke h., ahmad f., wang y., chung j.和manganiello v.c.(2014), advances in targeting cyclic nucleotide phosphodiesterases, nat.rev.drug discov., 第13卷第4期: 第290页。
[0242]
pde4d2测定使用了商购可得的cerep测定(目录参考4077; sop n
°
1c1045)。该测定旨在评价
试验化合物对人磷酸二酯酶
‑
4d2的活性的影响，其中通过使用在sf9细胞中表达的人重组酶测量来自camp的5’amp形成来量化。
[0243]
将试验化合物、参照化合物或水(对照)加入含有40 mm tris/hcl (ph 7.4)和8 mm mgcl2、450 nm camp和0.0125
µ
ci [3h]camp的缓冲液中。
[0244]
此后，通过加入酶(约1.5 u)引发反应，并将混合物在22℃温育20分钟。
[0245]
对于基础对照测量，从反应混合物中省略酶。
[0246]
温育后，加入spa (闪烁迫近测定)珠子。
[0247]
在22℃振荡30分钟后，用闪烁计数器(topcount, packard)定量[3h]5’amp的量。
[0248]
将结果表示为对照酶活性的抑制百分比。
[0249]
标准抑制性参照化合物是ro 20
‑
1724，其在每个实验中以几种浓度进行测试以获得抑制曲线，从中计算其ic
50
值。
[0250]
文献参考如上。
[0251]
pde42a1测定使用了商购可得的cerep测定(目录参考4074; sop n
°
1c1056)，其旨在评价化合物对人磷酸二酯酶
‑
4a1a的活性的影响，其中通过使用在sf9细胞中表达的人重组酶测量来自camp的5’amp形成来量化。
[0252]
将试验化合物、参照化合物或水(对照)加入含有40 mm tris/hcl (ph 7.4)和8 mm mgcl2、450 nm camp和0.25
µ
ci [3h]camp的缓冲液中。
[0253]
此后，通过加入酶(约10u)引发反应，并将混合物在22℃温育20分钟。
[0254]
对于基础对照测量，从反应混合物中省略酶。
[0255]
温育后，加入spa珠子。
[0256]
在22℃振荡30分钟后，用闪烁计数器(topcount, packard)定量[3h]5’amp的量。
[0257]
将结果表示为对照酶活性的抑制百分比。
[0258]
标准抑制性参照化合物是ro 20
‑
1724，其在每个实验中以几种浓度进行测试以获得抑制曲线，从中计算其ic
50
值。
[0259]
文献参考如上。
[0260]
认为重要的其它参数如下确定：试验方法微粒体稳定性(固有清除率)微粒体稳定性测定用于测量体外清除率（clint）。该测定涉及测量化合物由于其固有代谢状态而消失的速率（“固有”意味着消失不受在量化体内清除率时起作用的其它性能如渗透性、结合等影响）。微粒体稳定性（固有清除率，clint）以及因此的代谢稳定性通常作为
µ
l/min/mg蛋白给出。可以将其可视化为1 mg微粒体在一分钟内能够清除化合物的溶液体积。
[0261]
仪器将tecan genesis工作站(rsp 150/8)用于进行微粒体温育。使用与absciex api3000质谱仪偶联的waters acquity uplc系统进行分析。使用assay explorer (symyx)进行数据分析。
[0262]
uplc条件柱：acquity uplc beh c18, 2.1 x 50mm, 1.7
µ
m (waters)
流动相: a = 0.1%在水中的甲酸; b = 乙腈梯度时间%a%b最初90100.475950.655950.669010流速：0.750 ml/min；检测：esi，mrm；注射：10
µ
l；柱温度：50℃。
[0263]
化学物质
●ꢀ
磷酸钾缓冲液: 含有1 mm mgcl2的0.05 m磷酸钾缓冲液ph 7.4
●ꢀ
nadph (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸): 22.5 mg 在1.8 ml磷酸钾缓冲液中的nadph
‑
na4●ꢀ
乙腈: 50体积%乙腈(1体积乙腈, 1体积水)
●ꢀ
dmso: 20体积%的在水中的dmso
●ꢀ
20 mg/ml人或小鼠肝微粒体(蛋白)/ml在磷酸盐缓冲液中的储备溶液
●ꢀ
10 mm化合物在100%dmso中的储备溶液。
[0264]
微粒体温育从各化合物在100%dmso中的10 mm储备溶液开始，分两步稀释试验化合物。将前4 μl储备溶液添加到196 μl的20体积%dmso中。在第二步中，将10 μl的第一次稀释液添加到1590 μl磷酸钾缓冲液中，以在最终化合物稀释液中达到1.25 μμ的终浓度。因而，测定中有机溶剂的量保持在最小(<1%)。
[0265]
通过将750 μl储备溶液(20 mg/ml)和2250 μl磷酸钾缓冲液混合至5 mg/ml的终浓度，制备要用于该测定的人或小鼠肝微粒体(蛋白)溶液。
[0266]
在96深孔温育板上进行温育。将160 μl/孔的最终化合物稀释液转移到温育板上。测定了每种化合物稀释液的四个样品。将20 μl/孔的肝微粒体溶液加入每个孔中，并然后将样品在37℃和800 rpm搅拌下预温育5分钟。在每个实验中和对于每个物种（人或小鼠微粒体）平行使用两种参照化合物(维拉帕米和右美沙芬)以确保系统性能和进行对比。
[0267]
在单独的停止平板上，每孔加入160 μl乙腈。
[0268]
预温育后，即在时间t
1 = 0分钟，将温育的化合物溶液的18 μl样品转移并添加到停止平板上的每个孔（含有乙腈）中以防止反应（0分钟对照样品，每种化合物4个样品）。同样，在时间t
1 = 0分钟和30分钟后再次(t4)，将温育的参照化合物溶液的18 μl样品转移并添加到停止平板上的每个孔（含有乙腈）中，检查化合物的溶解度和化学稳定性。
[0269]
为了开始反应，将26 μl nadph溶液(辅因子)添加到包含预温育的化合物稀释液或参比溶液的所有孔中，但包含预温育的化合物稀释液的那些孔除外，这些孔将用作30分钟对照样品，其中替代性地添加26 μl磷酸盐缓冲液。然后在37℃和800 rpm搅拌下继续温育。
[0270]
在最终测定溶液中（即，在分别包含化合物、微粒体(蛋白)和nadph以及磷酸盐缓冲液的溶液的每个孔中），最终蛋白浓度为0.5 mg/ml且化合物浓度为1 mg/ml。
[0271]
在t
2 = 5分钟、t
3 = 10分钟和t4= 20分钟的温育时间以后(即在反应开始以后)，将温育的化合物溶液(每种化合物4个样品)和参照化合物溶液的20 μl样品转移并添加到
停止平板上的每孔的乙腈中。
[0272]
在t4= 30分钟的温育时间以后，将的温育的化合物溶液的20 μl样品(每种化合物4个样品)和30分钟对照样品(含有缓冲液而不是nadph)的20 μl样品以及温育的参照化合物溶液的20 μl样品转移并添加到停止平板上的每孔的乙腈中。
[0273]
将淬灭的样品在4℃在4000g离心1 h。将80 μl的上清液转移进96孔板中用于通过lc
‑
ms/ms进行分析。
[0274]
数据分析通过测量lc
‑
ms/ms峰面积随时间的变化来确定每种化合物的微粒体/代谢稳定性。根据符合michaelis/menten的对数线性模型拟合数据。从每个时间图的线性对数转换浓度的斜率(k)除以微粒体的量(0.5 mg/ml)计算clint值：clint ( μl/min/mg蛋白) = k*1000/蛋白浓度。assay explorer软件用于自动计算下降的斜率k。
[0275]
kv11.1 (herg)离子通道活性(膜片箝测定)用于检测和表征干扰kv11.1 (herg)通道: kv11.1 (herg, 人乙醚麻醉舞蹈症相关基因(human ether a
‑
go
‑
go related gene))的试验物的方法是一种钾通道，其在心室心肌细胞中的细胞复极化中起核心作用。
[0276]
在室温以全细胞构造对已用herg基因以稳定方式转染的人胚胎肾细胞(hek293)进行膜片箝测量。
[0277]
使用自动化膜片箝装置（patchlinertm，nanion technologies，慕尼黑）进行全细胞构造。这是一个基于玻璃芯片的系统，用它可能同时对至多8个细胞进行自动化全细胞测量。玻璃芯片有一个确定大小的孔，通过向其施加减压将细胞转移到gigaseal中，并进入全细胞构造。使用teflon包被的移液器将缓冲液、细胞悬浮液和试验物添加到芯片的微通道中。
[0278]
将细胞夹在
‑
80mv的保持电位。为了测量物质促进的kv11.1通道的抑制，以10秒间隔应用以下电压方案：51 ms/
‑
80 mv，500 ms/ 40 mv，500 ms/
‑
40 mv，200 ms/
‑
80 mv。借助于p4方法减去渗漏电流。将细胞重新悬浮在细胞外缓冲液(ec)中并应用于芯片。已经收集细胞以后，通过添加密封增强缓冲液改善密封。一旦达到全细胞构造，就洗掉密封增强缓冲液并替换为细胞外缓冲液。在ec中开始测量1.5分钟。然后施加dmso（媒介物对照，0.1%的dmso），并记录控制电流3分钟。随后以相同浓度添加试验物两次，并在每种情况下测量钾电流3.5分钟。
[0279]
如果试验物在10
µ
m的初始浓度的测量结果小于(
‑
)50%效应(阈值) (例如(
‑
)60%效应)，则为了确定剂量/作用关系，以递增浓度累积添加试验物，其中每个浓度测量5分钟。
[0280]
使用的参考物质是kv11.1 (herg)离子通道阻滞剂奎尼丁。将试验物和奎尼丁的作用标准化为相关的媒介物对照。从在
‑
40mv的钾电流评估对kv11.1 (herg)通道活性的影响。为了计算，针对相应的最终迹线评价电流。将试验物诱导的kv11.1(herg)通道抑制标准化为媒介物对照(0.1%的dmso)。
[0281]
在测量过程中，取试验物的等分试样用于浓度测定。立即通过hplc测量样品，且从校正曲线确定最终浓度。
[0282]
如果试验物在10 μm的初始浓度的测量结果大于或等于(
‑
)50%效应(阈值) (例如(
‑
)30%效应，即在10
µ
m时30%抑制)，则根据以下公式计算k
i
: k
i = 1.0e
‑
5 x (100 %效应)/
(
‑
%效应),[m]。
[0283]
在10μm的试验物浓度时(
‑
)30%效应的测量结果给出了23
µ
m的k
i
。
[0284]
细胞色素p
‑
450酶(cyp)在人生物体中，药用物质被酶系统转化成水溶性化合物以促进它们的排泄。这些酶系统包括微粒体细胞色素p
‑
450酶，简写为cyp。该测定旨在鉴定化合物是否可能是确定的cyp同种型的强抑制剂。这涉及通过在杆状病毒感染的昆虫细胞中过表达获得的重组cyp同种型及其还原酶的应用。通过在nadph再生条件下与发光cyp底物一起试验的cyp同种型的抑制来进行cyp反应。发光p450
‑
glotm底物是甲虫萤光素((4s)
‑
4,5
‑
二氢
‑2‑
(6
‑
羟基苯并噻唑基)
‑4‑
噻唑甲酸或d
‑
萤光素，来自甲虫的荧火虫萤光素酶的底物)的衍生物。发光p450
‑
glotm底物不直接与萤光素酶反应，而是被各自的cyp同种型转化为萤光素产物，该产物在与萤光素检测试剂(ldr)反应后会发光。这允许通过亮度来快速量化酶活性。通过确定ic50值来测量抑制程度(crespi等人,methodsenzymol.357:276
‑
284,2002)。使用下述商购可得的筛选系统/测定：p450
‑
glo
™
cyp1a2筛选系统(promegacorporation；v9770)；p450
‑
glo
™
cyp2c8测定(promegacorporation；v8782)；p450
‑
glo
™
cyp2c9筛选系统(promegacorporation；v9790)；p450
‑
glo
™
cyp2c19筛选系统(promegacorporation；v9880)；p450
‑
glo
™
cyp2d6筛选系统(promegacorporation；v9880)；p450
‑
glo
™
cyp3a4筛选系统(萤光素
‑
ppxe)(promegacorporation；v9910)。
[0285]
生物利用度从在临床前物种小鼠、大鼠和狗（比格犬）中测量的生物利用度推出在人类中的预测生物利用度，并计算在人类中的预测药理学有效剂量（计算机环境gastroplus模拟）。
[0286]
粉末x
‑
射线衍射(pxrd)方法：使用以下方法获得x
‑
射线粉末衍射图(xrpd)，诸如在图7b和10
‑
19（及其它）中描绘的那些：在组合96
‑
孔板（包含x
‑
射线无定形箔作为底部）中，或在x
‑
射线无定形薄膜之间，制备样品。在stoestadip611衍射仪上使用cu
‑
k
α1
辐射在透射几何中进行测量。扫描分别是同时0
‑
36
°
2θ(0.03
°
2θ的步宽，每步30秒)，或覆盖1
‑
65
°
2θ(0.015
°
2θ的步宽，每步15秒)。
[0287]
a)单晶x
‑
射线衍射：使用来自agilent的supernova衍射仪获得单晶x
‑
射线结构数据，该衍射仪配备了使用cukα辐射的ccd检测器。分别在200k(形式h2)或在298k(形式a1、a2、a3、h1)进行测量。将单晶数据用于确定晶系和晶胞参数。
[0288]
b)示差扫描量热法(dsc)：使用氮气惰性气体气氛(50ml/min)，在带有自动采样器的mettler
‑
toledo热通量示差扫描量热仪上获得dsc扫描。在打开盖子的al40
µ
l平底锅中以5℃/min在25
‑
300℃进行概览扫描。
[0289]
c)热重量分析法(tga)：使用氮气惰性气体气氛(50ml/min)，在带有自动采样器的mettler
‑
toledothermogravimetricanalyser上获得tga扫描。在没有盖子的al100
µ
l平底锅中以5℃/min在25
‑
300℃进行概览扫描。使用相同的温度方案，用没有盖子的空al100
µ
l平底锅中的空白运行进行实验基线校正。
[0290]
d)动态蒸汽吸附(dvs)：在带有微量天平和培养箱的dvs仪器(dvs
‑
intrinsic,surfacemeasurementsystems,sms)上获得dcs水蒸汽吸附等温线。将粉末样品准确地称量进一次用弃的al平底锅中并置于dvs仪器的样品位置上。使用200ml/min的氮气总流动速率（组合的干和湿流）进行加湿。使用从40%rh(相对湿度)至0%rh的最初解吸段1（具有10%rh步骤），从0%rh至98%rh的吸附段（分别具有10%rh步骤和最终8%rh步骤），以及从98%rh至0%rh的最终解吸段2（分别具有最初8%rh步骤和10%rh步骤），在25℃获得水蒸汽吸附等温线。对于所有rh步骤，使用dm/dt≤0.0005重量%/min的平衡条件，最小rh步骤时间为10分钟，且最大rh步骤时间（超时）为360分钟。
[0291]
e)固态形式的非沉降溶解曲线：在fassif介质(ph6.5)中用过量固体材料使用摇瓶法获得固态形式的非沉降溶解曲线，并采用时间分辨采样来确定api的溶解量。
[0292]
将大约10
‑
20mg固体样品称量进玻璃管形瓶中。加入7ml各种介质（预热至37℃），并在37℃以450rpm摇动悬浮液。5min、10min、15min、30min、60min、120min、24h和48h以后，取出1ml悬浮液并通过0.2
µ
m注射器式滤器过滤。在适当稀释后通过hplc分析澄清的滤液以测量溶解的化合物/形式(也可以被称作api)的量。
[0293]
fassif：3mm牛磺胆酸钠；0.75mm卵磷脂；105.9mm氯化钠；28.4mm磷酸二氢钠和8.7mm氢氧化钠，ph6.5用于ph依赖性溶解度和小型化非沉降溶解的hplc方法：用以下条件通过hplc分析溶解的化合物/形式的水平：
●
柱：chromolithrp
‑
18e100
‑
3mm
●
溶剂a:水/甲酸(999:1;v/v)
●
溶剂b:乙腈/甲酸(999:1;v/v)
●
注射体积:5
µ
l
●
柱温度:37℃
●
hplc
‑
梯度:时间(分钟)洗脱液aꢀꢀ(%)洗脱液bꢀꢀ(%)流速ꢀꢀ(ml/min)0.090101.70.390101.72.010901.72.7510901.7
实施例
[0294]
以下实施例例证了上述发明；但是，它们无意以任何方式限制本发明的范围。实施例尤其应以这样的方式解释：它们不限于具体说明的特征或特征组合，而是可以自由修改或组合示例性特征，只要达到本发明的目的即可。也可以通过相关领域的技术人员已知的其它分析方法和实验方案来确定本发明的化合物、组合和组合物的有益效果。同样，对制备方法，特别是反应条件的修改，对于技术人员来说将是显而易见的。
[0295]
实施例1：化合物1和2的制备
根据在wo 2016/155844中公开的程序制备化合物y，随后将化合物1和2从化合物y分离：。
[0296]
a. 6
‑
溴
‑
n
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
硝基
‑
喹啉
‑4‑
胺的合成在干燥氮气氛下，提供3
‑
氟
‑5‑
甲氧基吡啶
‑4‑
胺(447 mg, 3.02 mmol)溶解在n,n
‑
二甲基甲酰胺(5 ml)中的溶液。然后，将氢化钠(504 mg, 12.6 mmol, 60%)加入溶液并在室温继续搅拌5分钟。然后将6
‑
溴
‑4‑
氯
‑7‑
甲氧基
‑3‑
硝基
‑
喹啉(800 mg, 2.52 mmol)加入反应混合物，随后在室温搅拌15分钟，然后通过加入冰水(100 ml)淬灭反应。将沉淀物滤出，用冰水洗涤和干燥，得到1.00 g (94%)作为黄色固体的6
‑
溴
‑
n
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
硝基
‑
喹啉
‑4‑
胺。
[0297]
b. 6
‑
溴
‑
n4‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑
喹啉
‑
3,4
‑
二胺的合成在保护性氮气氛下提供6
‑
溴
‑
n
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
硝基
‑
喹啉
‑4‑
胺(990 mg, 2.20 mmol)溶解在甲醇(100 ml)中的溶液。然后，将兰尼镍(100 mg, 1.17 mmol)加入溶液，并将反应混合物在氢气氛下在常压搅拌30分钟。引入氮气以后，将悬浮液过滤并将滤液在真空下干燥。将滤液在真空下蒸发至干燥。将残余物从乙酸乙酯/石油醚的混合物中结晶，产生0.86 g (99%)作为黄色固体的6
‑
溴
‑
n4‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑
喹啉
‑
3,4
‑
二胺。
[0298]
c. 8
‑
溴
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮的合成提供6
‑
溴
‑
n4‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑
喹啉
‑
3,4
‑
二胺(0.85 g, 2.20 mmol)溶解在四氢呋喃(20 ml)中的溶液。然后，加入1,1'
‑
羰基二咪唑(1.84 g, 11.3 mmol)和h
ü
nig氏碱(1.46 g, 11.3 mmol)。将反应混合物加热至40℃和搅拌16小时。然后将
反应物通过加入冰水(200 ml)淬灭。将沉淀物滤出，用冰水洗涤和干燥，得到0.87 g (94%)作为浅黄色固体的8
‑
溴
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮。
[0299]
d. 8
‑
溴
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮的合成在干燥的保护性氮气气氛中，提供8
‑
溴
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑
3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(0.86 g, 1.94 mmol)溶解在n,n
‑
二甲基甲酰胺(5 ml)中的溶液。然后，加入氢化钠(388 mg, 9.71 mmol, 60%)和碘代甲烷(2.76 g, 19.4 mmol)。将反应混合物在室温搅拌10分钟。然后，通过加入冰水(100 ml)淬灭反应。将得到的沉淀物过滤和在真空下干燥，得到0.70 g (80%)作为浅黄色固体的8
‑
溴
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮。
[0300]
e. 1
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮的合成在封闭设备中在氩惰性气体气氛下，提供在1,4
‑
二氧杂环己烷(15 ml)和水(5 ml)中的8
‑
溴
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(150 mg, 0.33 mmol)、1
‑3‑
二甲基
‑4‑
(四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吡唑(88.4 mg, 0.40 mmol)、pd(pph3)
4 (76.6 mg, 0.07 mmol)和碳酸钾(91.6 mg, 0.66 mmol)。将反应混合物在搅拌下加热至80℃保持2小时。这之后冷却至室温和将反应混合物在真空下减少至干燥。将残余物使用二氧化硅进行色谱纯化(乙酸乙酯/甲醇= 97:3，体积份)。将洗脱液减少至干燥，并将得到的粗产物通过制备型rp
‑
hplc (水/乙腈)纯化。减少产物级分以后，得到作为无色固体的1
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(70 mg, 47%)。
[0301]
f. 8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(ra)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮和8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮的分离使用sfc通过手性hplc分离如上得到的1
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
(1,3
‑
甲基吡唑
‑4‑
基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(50.0 mg, 0.11 mmol)，得到化合物1和2。将所述物质应用于手性柱lux cellulose
‑
2，并用co2/2
‑
丙醇 0.5%二乙胺(75:25)作为溶剂和使用在240 nm波长的检测以5 ml/min的流速分离。在减压下减少产物级分，得到8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(ra)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(25.0 mg, 50%)和8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮) (22.1 mg, 44%)，均为无色固体。
[0302]
起始化合物是容易得到的，例如如下所示：
[0303]
实施例2：阻转异构体的分离和化合物1的纯化如在方案1和图6中所示和如在下面详细讨论的，可以从化合物y分离化合物1和2。本领域普通技术人员会明白，下述方法同样适用于从3分离化合物3
‑
a和3
‑
b，从4分离4
‑
a和4
‑
b，以及从5分离5
‑
a和5
‑
b。
[0304]
方案1：手性盐的制备步骤1：1. 在200 l反应器中，在20~25℃加入丙酮(108 l，20体积)、净化水(8.13 l，1.5体积)和化合物y (5.42 kg，1.0当量)。2. 装入二苯甲酰基
‑
l
‑
酒石酸(4.33 kg, 1.0当量)。3. 加热至52
‑
55℃以得到澄清溶液，在52
‑
55℃搅拌0.5 h。4. 冷却至20~25℃。5. 过滤并用丙酮(5.4 l, 1体积)洗涤滤饼一次。6. 收集滤饼和干燥，得到l
‑
盐b (化合物2的l
‑
盐) (具有95.9%的手性纯度的浅黄色固体)。
7. 浓缩母液并得到l
‑
盐a (化合物1的l
‑
盐)。8. 在100 l反应器中加入l
‑
盐a和dcm (38 l, 7体积)，用饱和的nahco3溶液将ph调至8
‑
9。9. 收集二氯甲烷(dcm)层，用dcm (16.3 l, 3体积)萃取饱和nahco3，合并dcm层，用h2o (10.8 l, 2体积)洗涤dcm层。10. 浓缩dcm层。然后，在20~25℃加入丙酮(5.4 l, 1体积)。11. 在20~25℃搅拌1h。12. 过滤，收集滤饼和干燥，得到化合物1 (3.50 kg，具有73.2%的手性纯度的白色固体, 收率：64.6%)。
[0305]
步骤2：1. 在50 l烧瓶中加入l
‑
盐b和dcm (16.2 l,3体积)，用饱和的nahco3溶液将ph调至8
‑
9。2. 收集dcm层，用dcm (5.4 l,1体积)萃取水层，合并dcm层，用h2o (5.4 l, 1体积)洗涤dcm层。3. 在真空下在40~50℃用2
‑
乙氧基乙醇(1.8 l, 0.3体积)交换dcm 2次。4. 用2
‑
乙氧基乙醇将体积调至5.4 l (1体积)。5. 加热至128
‑
130℃以得到浆，在128
‑
130℃搅拌44 h。6. ipc (比率49.5:50.5)。7. 冷却至15
‑
20℃。8. 过滤并用甲基
‑
叔丁基
‑
醚(2.7 l, 0.5体积)洗涤滤饼。9. 收集滤饼并干燥，得到化合物y (1.60 kg, 灰白色固体, 总收率: 29.5%)。
[0306]
步骤3：1. 在20~25℃在100 l反应器中加入丙酮(70 l,20体积)，搅拌并加入化合物1 (3.5 kg, 1.0当量)，装入水(5.3 l,1.5体积)。2. 在35~40℃装入二苯甲酰基
‑
d
‑
酒石酸(2.8 kg,1.0当量)，加热至52~55℃以得到澄清溶液，在52~55℃搅拌0.5 h。3. 用油浴冷却至20~25℃并在20~25℃搅拌17h。4. 过滤并用丙酮(3.5 l, 1体积)洗涤滤饼。5. 收集滤饼以得到d
‑
盐a (化合物1的d
‑
盐) (具有98.7%手性纯度的浅黄色固体)。6. 浓缩母液，然后加入饱和的naho3溶液(15.5 l, 3.5体积)和h2o (15.5 l, 3.5体积)。7. 在20~25℃搅拌0.5 h。8. 过滤并用h2o (3.5 l,1体积)洗涤滤饼。9. 收集滤饼并干燥，得到化合物y (1.53 kg，具有50.3:49.7比率的白色固体，收率：43.7%)。
[0307]
步骤4：1. 在50 l反应器中加入d
‑
盐a (化合物1的d
‑
盐)和丙酮(17.5 l, 5体积)，温热至52~55℃以得到浆溶液，在52~55℃搅拌0.5 h。
2.冷却至20~25℃并在20~25℃搅拌17h。3.过滤并用丙酮(3.5l,1体积)洗涤滤饼。4.收集滤饼并干燥，得到d
‑
盐a(3.23kg，具有99.2%的手性纯度的浅黄色固体)。5.在50l反应器中加入d
‑
盐a，然后加入饱和的nahco3溶液(16l,5体积)和h2o(16l,5体积)。6.在20~25℃搅拌0.5h。7.过滤并用h2o(16l,5体积)洗涤滤饼。8.收集滤饼并干燥，得到化合物1(1638g，通过hplc具有99.1%和99.9%的手性纯度的白色固体,总收率:30.2%)。
[0308]
实施例3:色谱分离、纯化和分析3.1使用手性固定相上的色谱法，可以从化合物y分离化合物1和2(参见，例如，chiralliquidchromatography;w.j.lough,ed.chapmanandhall,newyork,(1989);okamoto,“opticalresolutionofdihydropyridineenantiomersbyhigh
‑
performanceliquidchromatographyusingphenylcarbamatesofpolysaccharidesasachiralstationaryphase”,j.ofchromatogr.513:375
‑
378,(1990))。通过手性固定相（例如，chiralpakic柱(5mm,150x4.6mmi.d.)）上的色谱法，例如，使用等度洗脱，其使用含有h2o/acn50/50v/v(acn:乙腈;v:体积)的流动相，可以分离化合物1和2。本领域普通技术人员会明白，可以将相同程序应用于化合物3
‑
a和3
‑
b、4
‑
a和4
‑
b以及5
‑
a和5
‑
b。
[0309]
如此得到的色谱图如图5所示（柱和洗脱如上所述，流速1.00ml/min；uv@260nm；t
c
和t
s
：25
±
5℃，s
conc
0.20mg/ml；注射体积10ml）3.2作为上述sfc条件的替代方案，可以使用制备型超临界流体色谱法，其涉及例如：chiralpakas
‑
h(20mmx250mm，5
µ
m)柱；等度洗脱(20:80乙醇：含有0.1%v/vnh3的co2)，bpr(背压调节)：高于大气压约100巴；40℃的柱温度，50ml/min的流速，2500
µ
l(125mg)的注射体积和265nm的检测器波长。
[0310]
3.3为了分析各种阻转异构体的纯度，再次可以应用sfc，例如使用以下方案：chiralpakas
‑
h(4.6mmx250mm，5
µ
m)柱；等度洗脱(20:80乙醇：含有0.1%v/vnh3的co2)，bpr(背压调节)：高于大气压约125巴；40℃的柱温度，4ml/min的流速，1
µ
l的注射体积和260nm的检测器波长。
[0311]
实施例4:化合物1和2的稳定性旋转屏障的量子力学计算laplante等人(chemmedchem,2011,6(3),505
‑
513)描述了用于估计药物
‑
样分子的轴旋转的能垒的量子力学工作流程。应用了类似的方案：已经使用corina（corina3.6版，molecularnetworks，德国）生成所有输入分子的3d结构，并随后使用macromodel(11.1版,schr
ö
dinger,llc,newyork,ny)最小化。基于这些输入结构，使用程序jaguar（版本9.1，第14版，schr
ö
dinger,llc,newyork,ny）从松弛二面角扫描计算旋转能垒，其中采用b3lyp/6
‑
31g**方法和15
°
的扭转角增量。使用相同水平的理论在扭转扫描之前优化结构。除了最小化步骤的最大数量设置为500并且引入了stop_rxn标志以避免人
为键断裂之外，已使用默认参数。对于所有计算，使用了代表性分子片段。从分子力学最小化结构获得的二面角已被用于定义二面角扫描的起始值，例如对于本发明的化合物1或对于“laplante参照化合物1”，已经将值分别设置为47.32
°
和35.8
°
。对于围绕轴向键qm的每个扭转，已在24步中计算能量值。通过将扭转角值绘制为计算的能量，已经获得扭转特性。已确定每种化合物的允许两种异构体之间互变的最低能垒。对于参照化合物1
‑
6，实验确定的互变速率和推导出的能垒是已知的。参照化合物1
‑
6的计算能垒介于9.865和31.316 kcal/mol之间。这些值已经拟合到实验确定的互变速率。
[0312]
本发明的化合物1和本发明的化合物2的计算揭示了29.205 kcal/mol的高预测旋转屏障，其转化为高度稳定的阻转异构体，其具有在数年(>10年)范围内的预测旋转半衰期。任一种对映异构的阻转异构体的外消旋化开始所需的温度> 100℃。
[0313]
本领域普通技术人员会明白，这些值对于化合物3
‑
a和3
‑
b、4
‑
a和4
‑
b以及5
‑
a和5
‑
b也是示例性的。
[0314]
实施例5：化合物1的药学上可接受的盐如所示的那样制备药学上可接受的化合物1的盐(化合物1
‑
a)并在下面详细讨论。
[0315]
富马酸盐(形式nf6)的制备：在配备磁性搅拌棒的具有封闭帽的4 ml玻璃管形瓶中并通过使用磁力搅拌器，在50℃将大约20 mg 8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮溶解在1 ml thf (分析纯级)中。在50℃，将大约5.7 mg富马酸(约1.1当量)加入热溶液中并以0.1 k/min的冷却速率冷却至5℃。将混合物在搅拌下重复加热至50℃(在大约30 min内)和冷却至5℃(以0.1 k/min)，然后是在5℃数小时的最终平衡步骤。为了增加冷却的溶液中盐形成的产率，在封闭的管形瓶构造中将混合物进一步暴露于正戊烷缓慢反溶剂蒸汽扩散。通过离心分离最终获得的固体材料，并在氮气吹扫下温和干燥。
[0316]
萘磺酸盐(形式nf7)的制备
‑ꢀ
备选方案1：在配备磁性搅拌棒的具有封闭帽的4 ml玻璃管形瓶中并通过使用磁力搅拌器，在50℃将大约10 mg 8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮溶解在约250
µ
l丙酮(分析纯级)中。在50℃，将大约5.6 mg萘
‑2‑
磺酸(约1.2当量)加入热溶液，并以0.1 k/min的冷却速率冷却至5℃。将混合物在搅拌下重复加热至50℃(在大约30 min内)和冷却至5℃(以0.1 k/min)，然后是在5℃数小时的最终平衡步骤。通过离心分离最终获得的固体材料，并在氮气吹扫下温和干燥。
[0317]
萘磺酸盐(形式nf7)的制备
‑ꢀ
备选方案2：在配备磁性搅拌棒的具有封闭帽的4 ml玻璃管形瓶中并通过使用磁力搅拌器，在50℃将大约11.5 mg 8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮溶解在约250
µ
l thf (四氢呋喃) (分析纯级)中。在50℃，将大约6.6 mg萘
‑2‑
磺酸(约1.2当量)加入热溶液，并以0.1 k/min的冷却速率冷却至5℃。将混合物在搅拌下重复加热至50℃(在大约30 min内)和冷却至5℃(以0.1 k/min)，然后是在5℃数小时的最终平衡步骤。通过离心分离最终获得的固体材料，并在氮气吹扫下温和干燥。
[0318]
乙二磺酸盐(形式nf8)的制备：在配备磁性搅拌棒的具有封闭帽的4 ml玻璃管形瓶中并通过使用磁力搅拌器，在50℃将大约12.6 mg 8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮溶解在约250
µ
l丙酮(分析纯级)中。在50℃，将大约6.1 mg乙烷二磺酸(约1.2当量)加入热溶液，并以0.1 k/min的冷却速率冷却至5℃。将混合物在搅拌下重复加热至50℃(在大约30 min内)和冷却至5℃(以0.1 k/min)，然后是在5℃数小时的最终平衡步骤。通过离心分离最终获得的固体材料，并在氮气吹扫下温和干燥。
[0319]
实施例6：化合物3、4和5的制备8
‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮的合成步骤a：在密闭试管中放入：1
‑
(3,5
‑
二氟吡啶
‑4‑
基)
‑8‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1h,2h,3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(90.0 mg, 0.20 mmol, 95%)、碳酸钾(85.3 mg, 0.62 mmol)、cd3od (0.30 ml, 6.74 mmol)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(3 ml)。将混合物在100℃搅拌1 h。加入10 ml水，并将得到的溶液用乙酸乙酯(10 ml)萃取3次，并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并将滤液在真空下浓缩至干燥。将粗残余物通过制备型hplc (shimadzu(hplc
‑
10): 柱: atlantis prep t3 obd柱, 19*250 mm, 10
µ
m；流动相: 水(10 mmol/l nh4hco3)和乙腈(保持34%乙腈10 min)；检测器: uv 254nm)纯化，得到35 mg (38%)作为白色固体的8
‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮。熔点260
‑
262℃。hplc/ms (纯度) 97%。rt 1.98 min (方法a)。[m h] 452。1h nmr (400 mhz, dmso
‑
d6) ppm = 8.92 (s, 1h), 8.70 (d, j = 9.5 hz, 2h), 7.83 (s, 1h), 7.54 (s, 1h), 7.00 (s, 1h), 3.94 (s, 3h), 3.78 (s, 3h), 3.60 (s, 3h), 1.75 (s, 3h)。
[0320]8‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
(三氘基甲基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮的合成
步骤b：在圆底烧瓶中放入在n,n
‑
二甲基甲酰胺(50 ml)中的8
‑
溴
‑1‑
(3,5
‑
二氟吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑
1h,2h,3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(3.00 g, 6.96 mmol, 94%)。在0℃在5 min内加入氢化钠(1.39 g, 34.8 mmol, 60%)，随后加入cd3i (3.18 g, 20.9 mmol, 95%)。将得到的溶液在室温搅拌15 min。向混合物中加入500 ml冰水，并将固体通过过滤进行收集。这产生2.95 g (99%)作为黄色固体的8
‑
溴
‑1‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
三氘基甲基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮。hplc/ms (纯度) 99%。rt 0.93 min (方法b)。[m h] 424, 426。
[0321]
步骤c：在用氩气惰性气氛吹扫和维持的密闭试管中放入8
‑
溴
‑1‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
三氘基甲基)咪唑并
‑
[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(1.80 g, 4.20 mmol, 99%)、1,3
‑
二甲基
‑4‑
(四甲基
‑
1,3,2
‑
二氧杂硼杂环戊烷
‑2‑
基)
‑
1h
‑
吡唑(1.97 g, 8.43 mmol, 95%)、pd(pph3)
4 (540 mg, 0.42 mmol, 90%)、碳酸钾(1.22 g, 8.39 mmol, 95%)、二氧杂环己烷(50 ml)和水(10 ml)。将混合物在80℃搅拌2 h并在真空下浓缩至干燥。将残余物通过柱色谱法(甲醇/乙酸乙酯, 13:87)纯化，得到1.35 g (71%)作为黄色固体的1
‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
吡啶基)
‑8‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
(三氘基甲基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮。hplc/ms (纯度) 97%。rt 0.91 min (方法c)。[m h] 440。
[0322]
步骤d：在用氩气惰性气氛吹扫和维持的密闭试管中放入1
‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
吡啶基)
‑8‑
(1,3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
(三氘基甲基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(1.35 g, 2.96 mmol)、n,n
‑
二甲基甲酰胺(30 ml)、碳酸钾(818 mg, 5.92 mmol)和cd3od (2.76 ml, 2.24 g, 62.2 mmol)。将混合物在100℃搅拌2 h。加入100 ml水并将得到的混合物用200 ml乙酸乙酯萃取3次。将合并的有机层用100 ml盐水洗涤2次。将有机层经无水硫酸钠干燥，浓缩至干燥，并将粗产物从甲醇/乙腈(1:25)中结晶，得到1.50 g (66%)作为灰白色固体的8
‑
(1,
3
‑
二甲基吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
(三氘基甲基)咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮。熔点266
‑
271℃。hplc/ms (纯度) 97%。rt 2.00 min (方法c)。[m h] 455。1h nmr (300 mhz, dmso
‑
d6) ppm = 8.87 (s, 1h), 8.65 (d, j = 7.5 hz, 2h), 7.78 (s, 1h), 7.49 (s, 1h), 6.95 (s, 1h), 3.89 (s, 3h), 3.28 (s, 3h), 1.71 (s, 3h)。
[0323]1‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
[3
‑
甲基
‑1‑
(三氘基甲基)吡唑
‑4‑
基]咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮的合成步骤e：在圆底烧瓶中放入在n,n
‑
二甲基甲酰胺(30 ml)中的1
‑
(3,5
‑
二氟吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
(3
‑
甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑
1h,2h,3h
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(890 mg, 1.89 mmol, 90%)。在0℃在5中加入氢化钠(377 mg, 9.43 mmol, 60%)，随后加入cd3i (1.44 g, 9.44 mmol, 95%)。将得到的混合物在室温搅拌8 h。加入200 ml冰水，并将溶液用200 ml乙酸乙酯萃取4次。将合并的有机层用100 ml盐水洗涤2次。将有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩至干燥，并通过柱色谱法用二氯甲烷/甲醇(19:1)纯化，得到400 mg (47%)作为黄色固体的1
‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
[3
‑
甲基
‑1‑
(三氘基甲基)吡唑
‑4‑
基]咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮。hplc/ms (纯度) 98%。rt 0.68 min (方法d)。[m h] 440。
[0324]
步骤f：在用氩气惰性气氛吹扫和维持的密闭试管中放入1
‑
(3,5
‑
二氟
‑4‑
吡啶基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
[3
‑
甲基
‑1‑
(三氘基甲基)吡唑
‑4‑
基]咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(380 mg, 0.84 mmol, 98%)、n
‑
甲基
‑2‑
吡咯烷酮(20 ml)、碳酸钾(368 mg, 2.53 mmol, 95%)和cd3od (2.45 ml, 53.9 mmol, 98%)。将混合物在100℃搅拌4 h。加入100 ml水，并将得到的溶液用100 ml乙酸乙酯萃取5次。将合并的有机层用100 ml盐水洗涤2次，经无水硫酸钠干燥，浓缩至干燥并通过柱色谱法用二氯甲烷/甲醇(10:1)纯化，得到300 mg (74%)作为橙色固体的1
‑
[3
‑
氟
‑5‑
(三氘基甲氧基)
‑4‑
吡啶基]
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑8‑
[3
‑
甲基
‑1‑
(三氘基甲基)吡唑
‑4‑
基]咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮。hplc/ms (纯度) 95%。rt 0.65 min (方法d)。[m h] 455。1h nmr (300 mhz, dmso
‑
d6) ppm = 8.87 (s, 1h), 8.65 (d, j = 7.5 hz, 2h), 7.78 (s, 1h), 7.49 (s, 1h), 6.95 (s, 1h), 3.89 (s, 3h), 3.55(s, 3h) 1.71 (s, 3h)。
[0325]
hplc方法a：柱：shim
‑
pack xr
‑
ods，3.0*50 mm，2.2
µ
m；流动相a：水/0.05%tfa，流动相b：乙腈/0.05%tfa；流速：1.0 ml/min；梯度：在2.2 min中5%b至100%b，保持1.0 min；254 nm。
[0326]
hplc方法b：柱：shim
‑
packxr
‑
ods，3.0*50mm，2.2
µ
m；流动相a：水/0.05%tfa，流动相b：乙腈/0.05%tfa；流速：1.2ml/min；梯度：在2.0min中5%b至100%b，保持0.7min；254nm。
[0327]
hplc方法c：柱：poroshellhph
‑
c18，3.0*50mm，2.7
µ
m；流动相a：水/5mmnh4hco3，流动相b：乙腈；流速：1.3ml/min；梯度：在2.1min中10%b至95%b，保持0.6min；254nm。
[0328]
hplc方法d：柱：ascentisexpressc18，3.0*50mm，2.7
µ
m；流动相a：水/0.05%tfa，流动相b：乙腈/0.05%tfa；流速：1.5ml/min；梯度：在1.2min中5%b至100%b，保持0.5min；254nm。
[0329]
实施例7：化合物1的固体形式和溶剂化物a.固体形式a2制备通过从醇中的不同冷却结晶方法制备化合物1的固体形式a2：7.1在50℃在搅拌下将化合物1以大约50mg/ml的浓度溶解在1
‑
丙醇中。将得到的澄清溶液以0.1℃/min的冷却速率冷却至
‑
20℃，在
‑
20℃的最终保持阶段为至少1h。通过真空抽滤进行固液分离，并将过滤的固体样品在动态氮气吹扫下干燥过夜。
[0330]
7.2在50℃在搅拌下将化合物1以大约40mg/ml的浓度溶解在异丁醇中。将得到的澄清溶液以0.1℃/min的冷却速率冷却至
‑
20℃，在
‑
20℃的最终保持阶段为至少1h。通过真空抽滤进行固液分离，并将过滤的固体样品在动态氮气吹扫下干燥过夜。
[0331]
7.3将化合物1水合物形式h2(其制备如下所述)以12％(m/m；相对于化合物1的干燥质量)的浓度水平分散在2
‑
proh中。将得到的分散体在搅拌下加热至80℃以获得澄清溶液。从80℃到70℃的初始冷却降幅以0.5℃/min的速率运行，随后是在70℃的保持时间。在70℃，加入无水形式a2的晶种（研磨颗粒<50
µ
m；相对于反应器中的量为大约4.5%）。对于每100mg种子量，将晶种预先分散在大约1ml2
‑
proh内。在70℃播种后，应用10分钟的保持时间。以0.1℃/min进行从70℃至5℃的冷却降幅，然后在最终温度(5℃)保持3小时的时间。通过真空抽滤进行固液分离，并将过滤的固体样品在动态氮气吹扫下在70℃干燥过夜。
[0332]
在一种替代性方法中，如下从不同的多晶型形式通过浆转化制备形式a2：7.4将固体材料，尤其是化合物1的不同多晶型形式，最优选水合物形式h2（其制备如下所述），分散在大约5.2体积当量的乙酸乙酯中并在室温搅拌21h。将沉淀物抽滤出并在真空下在60℃干燥至少72h。
[0333]
b.固体形式a1制备通过以下两种方法制备化合物1的固体形式a1：7.5使用luxcellulose
‑
2柱和co2/2
‑
丙醇 0.5�a(75:25)的溶剂混合物以5ml/min的流速，对大约50mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮(外消旋混合物)进行sfc手性分离。将得到的级分用二氯甲烷冲洗，并在30℃浴温度浓缩以得到固体。
[0334]
7.6将溶解在100
µ
l二氯甲烷(dcm)中的大约10mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮在室温(rt:室温，约20
‑
25℃)蒸发以得到粉末。
[0335]
c.固体形式a3制备
7.7将大约12mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮固体材料（代表除a3以外的替代无定形形式，最优选地代表形式a2）分散在大约40
µ
lthf中，并在室温(20
‑
25℃)搅拌大约4周。将得到的固体通过离心进行分离，并在环境条件温和干燥以得到粉末。
[0336]
d.固体形式nf9制备：通过以下两种方法制备化合物1的固体形式nf9：7.8将溶解在2000
µ
l二氯甲烷中的大约100mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮在真空下在室温(大约20
‑
25℃)迅速地闪蒸以得到粉末。
[0337]
7.9在50℃向溶解在1000
µ
l丙酮中的大约20mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮中加入1当量的苯甲酸。将溶液冷却至室温(大约20
‑
25℃)。然后使用正戊烷蓄池在室温(大约20
‑
25℃)对溶液进行蒸汽扩散结晶，通过气相扩散缓慢地扩散进溶液中。几天后，固体结晶，将其通过离心分离，并在氮气清扫下温和干燥以得到粉末。
[0338]
e.固体水合物形式h1制备通过以下两种方法得到化合物1水合物的固体形式h：7.10将大约12
‑
13mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮固体材料（代表除h1以外的替代无定形形式，最优选地代表形式a2）分散在大约200
µ
l甲醇中，并在室温(20
‑
25℃)搅拌5天。将得到的固体通过离心进行分离，并在环境条件温和干燥以得到粉末。
[0339]
7.11将溶解在750
µ
l1
‑
丙醇中的大约12mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮在室温(大约20
‑
25℃)蒸发以得到粉末。
[0340]
f.固体水合物形式h2制备7.12将大约19g8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮固体材料（代表除h2以外的替代无定形形式，最优选地代表形式a2）分散在大约80ml去离子水中，并在室温(20
‑
25℃)搅拌大约4天。将得到的固体通过真空过滤分离，并在50℃在氮气吹扫下干燥以得到粉末。
[0341]
7.13将溶解在250
µ
lthf中的大约13
‑
14mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮在室温(大约20
‑
25℃)在紊流搅拌下快速倒入1500
µ
l去离子水的蓄池中。将得到的沉淀物通过离心分离，并在环境条件温和干燥以得到粉末。
[0342]
g.固体形式nf19制备7.14将溶解在1500
µ
l甲醇中的大约48mg8
‑
(1,3
‑
二甲基
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)
‑1‑
(sa)
‑
(3
‑
氟
‑5‑
甲氧基
‑
吡啶
‑4‑
基)
‑7‑
甲氧基
‑3‑
甲基
‑
1,3
‑
二氢
‑
咪唑并[4,5
‑
c]喹啉
‑2‑
酮在50℃蒸发以得到粉末。
[0343]
实施例8：与放射疗法联合在体内药理学研究(fadusschn肿瘤模型)中，持续6周的伴随化合物1和分次辐照
(6x5天，每次2戈瑞)的联合治疗与靶接合水平一致地以剂量依赖性的方式强烈增强了ir(辐照)的效力，如在图20中所示。详细地说：在带有人鳞状细胞头和颈模型fadu的异种移植物的nmrinu/nu小鼠中，与辐照(ir)联合地评估了atm抑制剂化合物1的抗肿瘤效力。
[0344]
对照组之一仅用媒介物治疗。另一个对照组在5天治疗/2天停止治疗计划中仅以30次2戈瑞的ir进行采用ir的治疗并持续6周的时段。两组用ir（如在仅ir对照组中）和化合物1的组合治疗，所述化合物1在每次ir之前30min的口服剂量为10mg/kg或25mg/kg。
[0345]
实施例9：与parp抑制联合在hbcx
‑
10患者衍生的三重阴性的乳腺癌异种移植物模型（在免疫缺陷的雌性小鼠中开发）中证实了与奥拉帕尼联合的化合物1的效力，其结果显示在图21中。
[0346]
将七十(70)只具有皮下生长的在62.5至196.0mm3之间的hbcx
‑
10肿瘤(p20.1.4/0)的小鼠在其平均和中位肿瘤体积分别达到131.16和126.00mm3时分配到治疗。
[0347]
研究包含各10只小鼠的不同组：
‑
在组1中，与以10ml/kg口服(3天治疗/4天停止治疗)x4施用的媒介物methocel组合，以10ml/kg口服每天1次x28施用媒介物奥拉帕尼；
‑
在组2中，以50mg/kg口服每天1次x49给药奥拉帕尼；
‑
在组3中，口服(3天治疗/4天停止治疗)x5给予单独的比较性atm抑制剂atmix；
‑
在组4中，与atmix口服(3天治疗/4天停止治疗)x7组合，以50mg/kg口服每天1次x49给药奥拉帕尼；
‑
在组5中，与100mg/kg口服(3天治疗/4天停止治疗)x7的化合物1组合，以50mg/kg口服每天1次x49施用奥拉帕尼。
[0348]
在治疗期间每两周测量一次肿瘤，并在随访期间每周测量一次。p.o.口服
‑
d天
‑
qdquaquedie
‑
每天1次。