一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果和毒性作用的方法与流程

1.本发明涉及药物筛选和评价领域，具体地说，涉及一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果和毒性作用的方法。


背景技术：

2.血管生成本身由几个生理过程组成：内皮发芽、套叠式血管生成和动脉生成(平滑肌向血管的募集)。肿瘤进展通常取决于血管供应的形成(尽管最近的研究表明血管共同选择是肿瘤发展过程中的另一种生存方法)。新形成的脉管系统提供营养，清除废物，促进肿瘤生长和转移。血管形成的开始由缺氧诱导因子(hif)控制。hif
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1与血管生成生长因子和葡萄糖代谢相关的靶基因的启动子和增强子内的缺氧反应元件结合。这些包括血管内皮生长因子(vegf)、血小板源性生长因子(pdgf
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β)、转化生长因子β(tgf
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β)、血管生成素(ang2)、诱导型一氧化氮合成酶(inos)、胰岛素样生长因子2(igf
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2)、肾上腺髓质素、表皮生长因子(egf)和尿激酶型纤溶酶原激活剂。
3.在肿瘤的治疗过程中，抗血管生成有助于阻止肿瘤的生长和转移，所以肿瘤血管生成，也一直是肿瘤药物发现的重点领域。肿瘤与非肿瘤内皮细胞之间的表型和遗传差异，使得开发抗血管生成剂作为靶向药物成为一种合理的策略，并且，靶向治疗后的不良反应也是有限的。临床上使用和评估的主要抗血管生成剂包括血管内皮生长因子受体(vegfr)抑制剂，如舒尼替尼，凡德替尼，帕唑帕尼，卡博替尼和阿昔替尼；其次是多激酶抑制剂，如索拉非尼，舒尼替尼。也有研究评估了内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(如厄洛替尼)的抗血管生成活性，已知该抑制剂可通过与血管内皮生长因子(vegf)通路的功能性相互作用来抑制血管生成。
4.在药物发现中，通常可以通过几种表型筛选来评估血管生成：例如基于体外细胞的方法和体内全生物方法。体外血管生成测定如内皮细胞迁移和管形成作为转化模型的实用性受到其无法模拟体内环境的复杂性和证明异质内皮细胞差异行为的限制，例如matrigel胶测定，鸡绒膜尿囊膜(cam)测定或角膜血管生成测定之类的体内动物模型，虽然保持了生物学上的复杂性，但通量低且半定量，需要大量的药物和人员参与用于抗血管生成化合物的筛选。
5.抗血管生成药物从药物发现到临床应用，淘汰率很高，原因在于药物的治疗窗口狭窄、脱靶现象以及疗效不佳。因此，准确高效的临床前筛选和评估平台将极大地节约抗血管生成药物挖掘所耗费的精力和财力。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果的方法。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
8.一种基于斑马鱼平台筛选抗血管生成化合物或评价化合物抗血管生成效果的方法，包括以下步骤：
9.a)将内皮细胞中表达增强的绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼的胚胎于受精后24h时用蛋白酶去绒毛膜；
10.b)去绒毛的胚胎用含有0.003％苯基
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硫脲的e3培养液培养；
11.c)在受精后1d和4d，将胚胎暴露于受试化合物中，并用胚胎培养基和0.1％dmso分别处理斑马鱼胚胎作为空白对照和媒介物对照；受试化合物处理24h后，麻醉胚胎并捕获其图像，观察体节血管长度来分析图像，以确定受试化合物的抗血管生成作用；
12.d)在受精后2.5d，将胚胎暴露于受试化合物中，并用胚胎培养基和0.1％dmso分别处理斑马鱼胚胎作为空白对照和媒介物对照；受试化合物处理36h后，麻醉胚胎并捕获其图像，测量肠下血管的面积来分析图像，以确定受试化合物的抗血管生成作用；
13.e)在受精后2.5d，将胚胎暴露于受试化合物中，并用胚胎培养基和0.1％dmso分别处理斑马鱼胚胎作为空白对照和媒介物对照；受试化合物处理36h后，麻醉胚胎并捕获眼底血管的图像，测量视网膜血管的面积来分析图像，以确定受试化合物的抗血管生成作用。
14.优选地，还包括以下步骤：在受精后24h，用蛋白酶将胚胎去绒毛膜，去绒毛的胚用e3培养液培养，并加入受试化合物，受试化合物处理24小时后，观察并记录胚胎的存活数、畸形数、是否出现心包水肿、心率减慢等毒性反应，以评估受试化合物的毒性。
15.优选地，步骤a)中，所述蛋白酶用量为1mg/ml。
16.优选地，步骤c)中，通过立体荧光显微镜观察体节血管长度。
17.优选地，步骤d)和e)中，使用imag j软件测量血管的面积。
18.本发明优点在于：
19.本发明基于内皮细胞中表达增强的绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼的胚胎，在合适的时机用受试化合物处理胚胎，处理后捕获图像，测量体节血管长度、肠下血管的面积和视网膜血管的面积分析图像，最终确定受试化合物的抗血管生成作用，另外还用受试化合物处理胚胎，观察胚胎的存活数、畸形数、是否出现心包水肿、心率减慢等毒性反应评估受试化合物的毒性。本发明建立了发现抗血管生成药物的临床前功效
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毒性模型，基于该平台探究药物的有效性和安全性具有高通量，评价结果客观、准确、全面的优点。本发明测试了不同种类的酪氨酸激酶抑制剂在斑马鱼胚胎的不同部位血管的抑制情况，发现药物在不同部位血管的抑制作用是有差异的，为选择阳性药物测试药物在不同部位血管的抑制效果提供了参考；在测试体节血管抑制率上，通过观察体节血管长度来计算药物对血管的抑制率，具有准确、可快速操作的特点。在评价药物对肠系膜血管以及眼底血管的抑制作用时，使用激光共聚焦显微镜采集血管图片，一方面可以准确测量用药后血管面积来评价药物对血管的抑制效果，另一方面，可以清楚观察到药物对血管形态的影响，更全面地评价药物对血管的作用。
附图说明
20.图1：tkis对早期斑马鱼体节间血管的影响。
21.图2：tkis对晚期斑马鱼体节血管的影响。
22.图3：tkis对斑马鱼肠下静脉的影响。
23.图4：tkis对斑马鱼眼底血管的影响。
24.图5：tkis对斑马鱼的毒性作用。
具体实施方式
25.下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
26.实施例1
27.一、试剂
28.酪氨酸激酶抑制剂，包括卡博替尼(cabo)、乐伐替尼(lenva)、瑞戈非尼(regora)、阿西替尼(axi)、甲磺酸阿帕替尼(apa)、帕纳替尼(pona)、凡德替尼(vande)、索拉非尼(sora)、舒尼替尼(suni)、拉帕替尼(lapa)、伊马替尼(ima)、厄洛替尼(erlo)、吉非替尼(gefi)。
29.二、方法
30.1斑马鱼的维护和胚胎处理
31.在内皮细胞中表达增强的绿色荧光蛋白(egfp)的转基因斑马鱼tg(flk1:egfp)从上海交通大学药学院获得，转基因斑马鱼是根据上海交通大学机构动物护理委员会的标准规程进行维护，处理和繁殖的。成年斑马鱼在循环水系统中以14h/10h的光/暗循环在26
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28℃下饲养，每天喂养两次。成年雄性和雌性斑马鱼在晚上分别放在同一个交配箱中，第二天早晨交配。收集胚胎并在e3培养液(5mm nacl，0.17mm kcl，0.33mm cacl2和0.33mm mgso4)中以每10厘米直径的培养皿100个胚胎的密度保存在28.5℃下。受精后数小时(h)和受精后数天(d)进行胚胎分期。
32.2斑马鱼早期体节血管生成评估
33.为了计算体节间血管(isv)的血管生成，在约24h下用蛋白酶(1mg/ml)将胚胎去绒毛膜。然后，将去绒毛的胚分配到24孔培养板中，每孔包含10
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15个胚培，每孔中加入的药物体积以及e3培养液共计1ml，并且该溶液含有0.003％苯基
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硫脲，以防止色素沉着。分别在1d和4d时将胚胎暴露于不同浓度的药物中，并在28.5℃下孵育。用胚胎培养基和0.1％dmso分别处理斑马鱼胚胎作为空白对照和媒介物对照。药物处理24小时后，麻醉胚胎并捕获其图像。通过在立体荧光显微镜下观察体节血管长度来分析图像，以确定各个化合物在早期和晚期的抗血管生成作用。
34.3斑马鱼肠下血管生成实验
35.为了计算肠下血管(sivs)的血管生成，在受精后2.5d，将上述药物在28.5℃下处理36小时。处理后，麻醉胚胎并拍摄照片。通过使用imag j软件来测量siv的面积来分析图像。
36.4斑马鱼眼底血管生成实验
37.为了计算视网膜的血管生成，将2.5d胚胎在28.5℃下用不同浓度的酪氨酸激酶抑制剂处理36h。处理后，麻醉胚胎并使用共聚焦显微镜拍摄眼底血管的照片。为了评估药物对视网膜血管的抑制作用，我们使用imag j软件来测量sivs的面积来分析图像。
38.5胚胎毒性试验
39.在约24h下用蛋白酶(1mg/ml)将胚胎去绒毛膜。然后，将去绒毛的胚分配到24孔培养板中，每孔包含15个胚培，每孔中加入的药物体积以及e3培养液共计1ml，加入的药物浓
度分别是0.1μm、1μm、10μm和50μm，并在28.5℃的培养箱中下孵育直至实验结束。给药后24h，观察并记录胚胎的存活数、畸形数、是否出现心包水肿、心率减慢等毒性反应。
40.6图像处理
41.使用olympus体式显微镜(olympus mvx10)拍摄斑马鱼体节血管及白光图像；使用leica激光共聚焦显微镜(leica tcs sp8)拍摄斑马鱼肠系膜血管及眼底血管。使用image j软件量化图片信息。
42.7统计
43.使用graphpad prism 8.4进行统计分析，所有统计分析均表示为平均值
±
sem。使用单向方差分析(anova)，当p值低于0.05时，认为具有显著性。“****”表示统计显著性p<0.0001，“***”表示统计显著性p<0.001，“**”p<0.01，“*”p<0.05，“ns”，无统计学意义。所有实验一式三份进行，并且独立实验重复至少三次。
44.三、结果
45.1不同种类的酪氨酸激酶抑制剂对早期斑马鱼体节血管的影响
46.首先研究了卡博替尼、拉帕替尼、厄洛替尼、索拉非尼等不同类型的酪氨酸激酶抑制剂(tkis)对早期斑马鱼体节血管的影响。给药后24小时，在立体荧光显微镜下观察并统计斑马鱼体节血管情况，图1a展示了不同的tkis对斑马鱼胚胎早期的体节间血管的抑制效果不同；图1b图展示了计算体节间血管抑制率的依据，血管为0、1/4、1/2、3/4、1的抑制率分别为100％、75％、50％、25％、0％；图1c是靶向vegfr的tkis对斑马鱼胚胎晚期体节间血管的抑制；图1d是多靶点的tkis对斑马鱼胚胎晚期体节间血管的抑制；图1e是靶向egfr和pdgfr的tkis对斑马鱼胚胎晚期体节间血管的抑制。通过统计结果，发现靶向vegfr的酪氨酸激酶抑制剂对早期体节血管的抑制效果整体较好，例如卡博替尼、瑞戈替尼，但是其中凡德替尼抑制体节血管的效果不佳；多靶点的酪氨酸激酶抑制剂的效果次之，例如索拉非尼；靶向egfr和pdgf的酪氨酸激酶抑制剂对体节血管的抑制效果最差，例如拉帕替尼、伊马替尼。
47.2不同种类的酪氨酸激酶抑制剂对晚期斑马鱼体节血管的影响
48.之后，又研究了不同类型的酪氨酸激酶抑制剂对晚期成熟的斑马鱼体节血管的影响。图2a展示了不同的tkis对斑马鱼胚胎晚期的体节间血管的抑制效果不同；图1b是靶向vegfr的tkis对斑马鱼晚期体节间血管的抑制；图1c是多靶点的tkis对斑马鱼胚胎晚期体节间血管的抑制；图1d是靶向egfr和pdgfr的tkis对斑马鱼胚胎晚期体节间血管的抑制。与早期给药后的抑制效果相对比，酪氨酸激酶抑制剂对斑马鱼晚期较为成熟的体节血管的抑制效果较差。其中，靶向vegfr的酪氨酸激酶抑制剂的效果在所测试的13个不同类型的酪氨酸激酶抑制剂中的效果是比较好的；而靶向egfr和pdgf的酪氨酸激酶抑制剂抑制效果是最差的，抑制率均低于20％。
49.3不同种类的酪氨酸激酶抑制剂对斑马鱼肠系膜血管的影响
50.受精后2.5天，给予斑马鱼不同浓度的酪氨酸激酶抑制剂，给药36小时后，对斑马鱼肠系膜血管进行拍摄共聚焦照片，图3a展示了不同的tkis对斑马鱼胚胎肠下静脉的抑制效果不同；图3b是靶向vegfr的tkis对斑马鱼胚胎肠下静脉的抑制；图3c是多靶点的tkis对斑马鱼胚胎肠下静脉血管的抑制；图3d是靶向egfr和pdgfr的tkis对斑马鱼胚胎肠下静脉血管的抑制。使用image j测量统计血管面积后发现，不同类型的酪氨酸激酶抑制剂对斑马
鱼肠系膜血管的抑制效果与对早期体节血管的抑制效果相类似，其中卡博替尼的抑制效果总体来说是最优的。并且，通过观察肠系膜血管的形态发现，酪氨酸激酶抑制剂不仅可以减少肠系膜血管的面积，有些药物甚至可以改变肠系膜血管的形态，例如卡博替尼、乐伐替尼、阿西替尼等。
51.4不同种类的酪氨酸激酶抑制剂对斑马鱼眼底血管的影响
52.受精后2.5天，给予斑马鱼不同浓度的酪氨酸激酶抑制剂，给药36小时后，对斑马鱼眼底血管进行拍摄共聚焦照片，图4a展示了不同的tkis对斑马鱼胚胎眼底血管的抑制效果不同；图4b是靶向vegfr的tkis对斑马鱼胚胎眼底血管的抑制情况的统计；图4c是多靶点的tkis对斑马鱼胚胎眼底血管的抑制；图3d是靶向egfr和pdgfr的tkis对斑马鱼胚胎眼底血管的抑制情况统计。使用image j软件测量血管面积后发现，不同类型的酪氨酸激酶抑制剂对斑马鱼眼底血管的抑制效果与对早期体节血管的抑制效果相类似，与对斑马鱼肠系膜血管的抑制效果基本一致。其中乐伐替尼、阿西替尼的抑制效果最优，但是靶向vegfr的药物中，阿帕替尼、凡德替尼对眼底血管的抑制效果较差，与空白对照组无明显的差异；多靶点的酪氨酸激酶抑制剂中可以明显抑制眼底血管的是索拉非尼，舒尼替尼对眼底血管的抑制效果较差，靶向egfr和pdgf的酪氨酸激酶抑制剂对眼底血管没有明显的抑制效果。
53.5酪氨酸激酶抑制剂对斑马鱼的毒性作用
54.我们对13种酪氨酸激酶抑制剂进行了早期胚胎毒性研究，给予受精后24小时的斑马鱼胚胎不同浓度(0.1、1、10、50μm)的酪氨酸激酶抑制剂，给药24小时后在立体显微镜下观察统计胚胎的存活数和胚胎形态。图5a展示了酪氨酸激酶抑制剂可能导致的斑马鱼心包水肿和尾部畸形，图5b是不同浓度的tkis对斑马鱼生存率的影响；图5c是不同浓度的tkis对斑马鱼心包水肿率的影响；图5c是不同浓度的tkis对斑马鱼畸形率的影响。通过对给药后斑马鱼存活率、心包水肿率和畸形率统计，我们发现，在所测试的13种酪氨酸激酶抑制剂中，帕纳替尼有明显的心脏毒性和致畸性，凡德替尼对斑马鱼的生存率影响较大。
55.四、讨论
56.近年来，抗血管药物在肿瘤、眼部血管增生疾病等领域应用广泛，但目前很多研究都是基于从毛细血管或大血管中分离出的内皮细胞进行的，体外抗血管生成药物的评估无法评估药物相互作用以及血管与相应组织之间的关系。
57.在这项研究中，我们探索了13种不同类型的酪氨酸激酶抑制剂在斑马鱼不同部位的抗血管作用以及毒性作用，包括卡博替尼、乐伐替尼、瑞戈非尼、阿西替尼、甲磺酸阿帕替尼、帕纳替尼、凡德替尼、索拉非尼、舒尼替尼、拉帕替尼、伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼。我们发现，靶向vegfr的酪氨酸激酶抑制剂在斑马鱼不同部位的血管抑制效果较好，但容易导致斑马鱼心包水肿，这可能与药物抑制血管生长的药效相对应，其中的帕纳替尼的心脏毒性较强，在临床使用中应多加注意，凡德替尼的效果较差，并且有一定的胚胎毒性，总体评价较差；多靶点的酪氨酸激酶抑制剂中，索拉非尼抑制血管的效果要优于舒尼替尼，靶向egfr和pdgf的酪氨酸激酶抑制剂在抑制血管的效果上较差，但是一些药物在抗肿瘤治疗中，有很好的效果，作用机制不在抗血管上。本发明建立的抗血管生成药物的临床前功效
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毒性模型具有高通量，评价结果客观、准确、全面的优点。
58.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为
本发明的保护范围。