一种岷江百合defensin抗菌肽基因LrDef1及应用的制作方法

一种岷江百合defensin抗菌肽基因lrdef1及应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术领域，特别是一种具有抗真菌侵染能力的岷江百合defensin抗菌肽基因lrdef1及应用。


背景技术：

2.病原菌是引起植物产量和品质损失的重要影响因素，由病原菌引起的植物病害，可使作物减产20%~40%；其中真菌病害是植物病害中数量最大的一类，约占病害总数的70%~80%。传统控制植物病害的方法主要是使用化学农药、改进栽培管理措施和培育抗性新品种。这些方法虽然取得了一定成效，但传统育种周期长，栽培措施效果差，农药易导致环境安全和食品安全等问题。随着生物技术的快速发展，利用基因工程的方法来培育抗病新品种不仅能克服上述防治方法的诸多弊端，还可最大限度地降低对土壤中有益微生物的伤害，实现农业的可持续发展。
3.植物抗菌肽（antimicrobial protein, amp）是一类小的、富含半胱氨酸的碱性阳离子肽，是植物免疫系统的一部分，对细菌、真菌和病毒等病原微生物都具有抑制或杀灭作用，在植物防卫反应中起至关重要的作用（zasloff michael. antimicrobial peptides of multicellular organisms. nature, 2002, 415 (6870): 389
‑
395）。植物防御素是一类的重要的amp，当植物受到生物胁迫时，植物防御素可与真菌特异性质膜组分结合，导致病原菌细胞膜凹陷，嵌入细胞膜或转运到细胞膜内，进而发生一系列的生物化学变化。
4.目前已有多种防御素基因导入植物中用于增强植物的抗性。烟草（nicotiana megalosiphon）防御素（nmdef02）是一种常见的具有抗菌活性的植物防御素，表达nmdef02的转基因大豆（glycine max）植株对大豆锈菌（phakopsora pachyrhizi）和炭疽病菌（colletotrichum truncatum）表现出更高的抗性（soto n , y hern
á
ndez, delgado c , et al. field resistance to phakopsora pachyrhizi and colletotrichum truncatum of transgenic soybean expressing the nmdef02 plant defensin gene. frontiers in plant science, 2020, 11: 562）。在烟草（n. alata）的花芽中分离得到一个nad1防御素，nad1可与真菌细胞壁特异性结合并进入真菌细胞质中，进而引发胞内活性氧浓度迅速提高，使真菌的细胞质膜发生透化，最终导致真菌细胞死亡（baxter aa , poon ik , hulett md. the plant defensin nad1 induces tumor cell death via a non
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apoptotic, membranolytic process. cell death discovery, 2017, 3(1): 402
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410）。此外，nad1蛋白对尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）、灰霉菌（botrytis cinerea）、念珠菌（candida albicans）等多种致病真菌也具有良好的抗菌活性（罗显麟, 赵德刚, 赵懿琛. 花烟草nad1基因的原核表达及纯化.分子植物育种, 2020, 18(11): 3502
‑
3508）。
5.百合是百合科（liliaceae）百合属（lilium）植物的总称，属多年生球根类花卉。在种球繁殖及鲜切花生产过程中，百合易受到真菌、病毒、细菌等多种病原菌的危害。目前发现的百合病害达几十种之多，其中由镰刀属（fusarium spp.）真菌引起的枯萎病（又称为基腐病、茎腐病）是百合生产中危害最严重的病害。镰刀菌侵染百合种球后引起基盘坏死、鳞
片腐烂脱落，造成种球质量下降；植株感染镰刀菌后叶片变黄、萎蔫下垂，植株提早枯萎死亡，严重影响百合切花的产量和品质；其中尖孢镰刀菌致病性最强、分离频率最高，是百合枯萎病的主要致病菌。岷江百合（l. regale wilson）为我国特有种，仅分布于岷江流域海拔800～2700m的河谷到山腰的岩石缝中，具有强的抗枯萎病性，是现代百合育种的重要种质资源。抗菌肽是植物防御系统的重要组成部分，因此对岷江百合中抗菌肽基因的发掘以及功能分析具有重要的研究及其应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种岷江百合defensin抗菌肽基因lrdef1及其应用，即在提高烟草对尖孢镰刀菌（f. oxysporum）、草茎点霉（phoma herbarum）、木贼镰刀菌（f. equiseti）抗性中的应用。
7.本发明从岷江百合中克隆获得的具有抗真菌活性的defensin抗菌肽基因lrdef1，lrdef1核苷酸序列如seq id no:1所示，该基因cdna全长序列为501bp，包含一个225bp的开放阅读框、37 bp的5’非翻译区、239 bp的3’非翻译区，编码如seq id no:2所示氨基酸序列的蛋白质。
8.本发明中lrdef1基因的编码区是序列表seq id no:1中第38
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262位所示的核苷酸序列。
9.本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整cdna片段，利用根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为lrdef1。
10.上述lrdef1基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：（1）采用扩增lrdef1的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总rna，通过逆转录
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聚合酶链式反应（reverse transcription
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polymerase chain reaction，rt
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pcr）扩增出lrdef1的全长编码区，然后将其连接到pgem
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t载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；（2）用限制性内切酶ecorⅰ和bamhⅰ酶切pgem
‑
t
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lrdef1载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pcambia2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得lrdef1基因片段与pcambia2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；（3）以重组载体t
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dna上具有的抗性标记筛选转化子，并通过pcr以及rt
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pcr检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物叶片总蛋白对病原真菌生长的抑制能力，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。
11.本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自岷江百合的lrdef1基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料；利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性；它不仅可以为大规模生产农作物、药材、园艺植物等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明
finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个225bp的开放读码框（见序列表），lrdef1编码一个含74个氨基酸的蛋白质，其分子量约为8.06kda，等电点约为8.22。借助生物信息学软件signalp 5.0分析lrdef1编码的蛋白序列，检测其是否具有n端信号肽。结果显示在lrdef1的n端存在信号肽，因此推测该蛋白是分泌蛋白。
17.实施例2：植物超表达载体构建采用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入lrdef1的大肠杆菌质粒pgem
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t
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lrdef1以及植物表达载体pcambia2300s的质粒，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶ecori（takara）和bamhi（takara）分别对质粒pgem
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t
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lrdef1和pcambia2300s进行双酶切（100μl体系），反应体系和操作过程为：取20μl pgem
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t
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lrdef1和pcambia2300s质粒、依次加入10μl 10
×
k buffer、4μlecori、6μl bamhi、60μl ddh2o，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对lrdef1片段和pcambia2300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒（上海生工）；取1μl回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于
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20℃保存备用。
18.利用t4 dna ligase（takara），将回收的lrdef1 dna片段和pcambia2300s载体片段连接起来，反应体系（20μl）和操作过程为：取10μl lrdef1 dna片段依次加入2μl pcambia2300s载体dna、2μl 10
×
t4 dna ligase buffer、1μl t4 dna ligase、5μl ddh2o，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/l卡那霉素（kanamycin，km）的固体培养基筛选阳性克隆，挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增lrdef1的特异引物进行pcr，挑选出lrdef1与pcambia2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于
‑
80℃保存备用。
19.提取并纯化上述大肠杆菌中的pcambia2300s
‑
lrdef1质粒，随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pcambia2300s
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lrdef1转入根癌农杆菌lba4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μg pcambia2300s
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lrdef1质粒加入含有200μl感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800μl lb液体培养基于28℃振荡培养4h；将活化后的农杆菌涂于含有50mg/l km的lb固体培养基上，28℃静止培养；挑选单菌落摇菌，再用扩增lrdef1的特异性引物进行pcr，检测pcambia2300s
‑
lrdef1是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于
‑
80℃保存备用。
20.实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的hgcl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 ms培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16 h/d光照），以后每月用1/2 ms培养基继代一次。
21.从
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80℃冰箱中取出保存的含有pcambia2300s
‑
lrdef1质粒的农杆菌lba4404菌种，接种于5ml含有50mg/l km和20mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1ml浑浊的菌液至含有50mg/l km的lb固体培养基上，28℃培养48 h；随后将lb固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/l的乙酰丁香酮的mgl液体培养基中，28℃振荡培养2
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3h以活化农杆菌。
22.取烟草无菌苗叶片切成1 cm2左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的mgl
液体培养基中，浸染时间为15min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为ms 0.02mg/l 6
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ba 2.1mg/l naa 30g/l sucrose 6g/l琼脂，22℃无光条件下共培养2天。
23.将共培养后的叶盘转到加有抗生素的ms筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株；烟草筛选培养基为ms 0.5mg/l 6
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ba 0.1mg/l naa 30g/l sucrose 6g/l琼脂 50mg/l km 200 mg/l 头孢霉素（cefotaxime sodium salt，cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16 h/d光照，8 h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50mg/l km和200mg/l cef的ms培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50mg/l km的ms培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。
24.采用ctab法提取转基因烟草植株叶片的基因组dna，将提取的基因组dna取1μl通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组dna为模板用扩增lrdef1的特异引物进行pcr，pcr结束后，取8μl产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分转基因烟草的扩增结果如图1所示，共筛选到30株阳性转基因烟草植株。
25.实施例4：转基因烟草中lrdef1的表达分析以及转基因植株抗真菌侵染的功能分析取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总rna，逆转录生成cdna第一链，并以此为模板用扩增lrdef1的特异引物进行pcr，根据pcr结果分析各转基因单株中lrdef1转录水平的表达，总rna提取以及rt
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pcr的方法与实施例1中相同，pcr结束之后，取8μl用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到20个转基因单株中lrdef1在转录水平大量表达，这些单株的编号为l1～l20。
26.将实验室保存的几种病原真菌接种于pda固体培养基（200g/l马铃薯、15g/l琼脂、20g/l葡萄糖）上，28℃暗培养待菌落生长至直径约为2
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3cm时添加植物蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其他杂菌污染提取的蛋白，整个植物蛋白提取的过程均是无菌操作。首先取1g转基因烟草单株（编号分别为l
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8、l
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9、l
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16)及野生型叶片放入研钵中，加入1ml蛋白提取液(1m nacl、0.1m乙酸钠、1% pvp，ph6.0)，充分研磨。转入1.5ml离心管中，混匀后4℃静置过夜。4℃离心30min (12,000g/min)，取上清于新的1.5ml离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2μg/μl，然后分别取20μl滴于各真菌培养基的无菌滤纸上。在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（蛋白提取液）。28℃下培养几天后观察真菌的生长情况，并据此来评价lrdef1转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，lrdef1转基因烟草蛋白对尖孢镰刀菌、草茎点霉、木贼镰刀菌的生长具有明显的抑制作用。