来自古柯的聚酮合酶EnPKS1和EnPKS2及其基因和应用的制作方法

来自古柯的聚酮合酶enpks1和enpks2及其基因和应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子生物学领域，公开了来自古柯的聚酮合酶enpks1和enpks2及其基因，编码古柯聚酮合酶基因的鉴定，还涉及古柯聚酮合酶的应用。enpks1和enpks2能以丙二酰辅酶a为底物，催化生成丙酮二羧酸，该产物是植物体内生物合成以及体外化学合成托品烷骨架的重要中间体。本发明的聚酮合酶可作为元件用于托品烷类生物碱的合成生物学，以及生物合成路径中涉及丙酮二羧酸中间体的天然产物的合成代谢工程，为合成生物学提供更多可选择元件。


背景技术：

2.托品类生物碱(tas)作为一类重要的天然产物，从茄科（solanaceae），古柯科（erythroxylaceae），山龙眼科（proteaceae），红树科（rhizophoraceae），旋花科（convolvulaceae），十字花科（brassicaceae）等植物中分离得到，具有很好的生理活性。例如，从古柯（erythroxylum novogranatense）中分离得到的可卡因是用于鼻腔的局部麻醉剂；从茄科植物中分离得到的托品生物碱，如莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱作为副交感神经的抗胆碱药物，用于镇痛、麻醉、解痉挛等，在临床中被广泛使用。市面上的托品类生物碱多是从植物中分离得到，产量有限。因此，除培育高产的药用植物品种之外，人们一直在寻找其他更为绿色经济地获得该类化合物的方法。
3.现代分子生物学技术手段的发展，使得脱离原植物，在微生物中异源生产托品烷类生物碱成为可能。而生物合成途径的解析、发掘生物合成重要元件是进行代谢工程的基础。并且对生物合成途径的解析还有助于进行分子育种，开发高产药源植物品种。
4.托品类生物碱中的莨菪碱的生物合成途径已被解析，其托品酮的骨架是由鸟氨酸和精氨酸经脱羧氧化等一系列反应，形成n
‑
甲基吡咯阳离子，而后可自发和丙酮二羧酸发生缩合，生成4
‑
（1
‑
甲基
‑
吡咯）
‑3‑
氧代丁酸[4
‑
(1
‑
methyl
‑2‑
pyrrolidinyl)
‑3‑
oxobutanoic acid]，随后再经历氧化成环生成托品烷骨架。
[0005]
前人已经从茄科植物颠茄（atropa belladonna l.）、三分三（anisodus acutangulus）和曼陀罗（datura stramonium l.）中鉴定出了参与莨菪碱生物合成的聚酮合酶，能够催化两分子的丙二酰辅酶a缩合生成丙酮二羧酸的反应。本发明从古柯当中鉴定出了同样能够催化两分子的丙二酰辅酶a缩合生成丙酮二羧酸的酶，反应式如图1所示。然而，本发明报道的酶与之前的三个物种（颠茄、三分三、曼陀罗）氨基酸相似性较低（约60%），聚酮合酶的多样性拓宽了合成生物学应用中元件的可选范围，并且为改造这类酶提供了新思路，可指导这类酶的理性设计。
[0006]
另一方面，丙酮二羧酸也是化学合成托品类生物碱骨架的重要中间体，早在1917年德国化学家robinson以丙酮二羧酸盐、丁二醛和甲胺为原料，非常巧妙地运用一锅法完成了托品酮的合成，并且收率高达42%。丙酮二羧酸具有良好的反应活性，除合成托品酮之外，还可用于合成药物，如格拉司琼，雷尼酸锶等。然而，化学合成方法中使用的一些试剂处理不当会对环境造成危害，故酶的挖掘也为药物合成提供了新的解决方法。
[0007]
迄今为止，现有技术中没有来自古柯的聚酮合酶enpks1和enpks2及其编码基因鉴定，以及古柯聚酮合酶的应用的报道。


技术实现要素：

[0008]
有鉴于现有技术中存在的上述不足之处，本发明的目的之一在于提供一种古柯聚酮合酶；本发明的目的之二在于提供古柯聚酮合酶基因；本发明的目的之三在于提供含有所述古柯聚酮合酶基因的重组表达载体；本发明的目的之四在于提供含有所述古柯聚酮合酶基因的转基因重组菌；本发明的目的之五在于提供所述古柯聚酮合酶在体内或体外催化生产丙酮二羧酸的应用；本发明的目的之六在于提供所述古柯聚酮合酶基因、所述的重组表达载体、所述的转基因重组菌在不具有托品烷类生物碱的生物合成途径的原核生物或真核生物中构建托品烷类生物碱合成途径的应用，或是在具有托品烷类生物碱的生物合成途径的原核生物或真核生物中提升托品烷类生物碱产量的应用。
[0009]
本发明的目的之七在于提供所述古柯聚酮合酶基因、所述的重组表达载体、所述的转基因重组菌在不具有丙酮二羧酸合成能力的原核生物或真核生物中合成途径中涉及丙酮二羧酸中间体的天然产物的生物合成途径的应用，或是在提升生物合成途径中涉及丙酮二羧酸中间体的天然产物产量的应用。
[0010]
为达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：1、古柯聚酮合酶，具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：a）具有seq id no.4或seq id no.8所示的氨基酸残基序列的蛋白质；b）将seq id no.4或seq id no.8中的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a）酶功能的由a）衍生的氨基酸序列。
[0011]
c）与a）或b）限定的氨基酸序列具有80%以上的同源性，且具有a）酶功能的由a）衍生的蛋白质。
[0012]
d）序列中含有a)或b）所述氨基酸序列的衍生蛋白质。
[0013]
2、古柯聚酮合酶基因，具有下述核苷酸序列之一的多核苷酸：a）核苷酸序列如seq id no.3或seq id no.7所示的多核苷酸；b）编码权利要求1所述蛋白质的多核苷酸。
[0014]
c）编码如seq id no.4或seq id no.8所示的氨基酸序列的多核苷酸。
[0015]
d）与a）、b）或c）限定的核苷酸序列具有80％以上的同源性且编码具有权利要求1所述合成丙酮二羧酸的古柯聚酮合酶功能的多核苷酸；e）与a）、b）或c）所述的序列互补的多核苷酸。
[0016]
3、含有所述古柯聚酮合酶基因的重组表达载体。
[0017]
优选的，所述重组表达载体为将所述的古柯聚酮合酶基因插入原核或真核表达载体得到表达古柯聚酮合酶的重组表达载体。
[0018]
进一步的，所述重组表达载体为，将古柯聚酮合酶基因enpks1，如seq id no.3所示的核苷酸序列，经bamhi和sali酶切位点连入pet28a载体而得；将古柯聚酮合酶基因
enpks2，如seq id no.7所示的核苷酸序列，经bamhi和xhoi酶切位点连入pet28a载体而得。
[0019]
4、含有所述古柯聚酮合酶基因的转基因重组菌。
[0020]
优选的，转基因重组菌为rosetta（de3），或其他细菌和真菌，所述细菌和真菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。
[0021]
5、所述古柯聚酮合酶在体内或体外催化制备丙酮二羧酸中的应用，以及在体内或体外用于催化生产托品烷类生物碱中的应用。
[0022]
6、所述古柯聚酮合酶基因或重组载体在不具有合成托品烷类生物碱合成能力的原核生物或真核生物中的应用，以及在不具有合成途径中涉及丙酮二羧酸的天然产物合成能力的原核生物或真核生物中的合成生物学中的应用。
[0023]
7、所述古柯聚酮合酶基因或重组载体在具有丙酮二羧酸生物合成途径的原核生物或真核生物中提升丙酮二羧酸产量，以及合成途径中涉及丙酮二羧酸中间体的天然产物产量中的应用。
[0024]
8、所述古柯聚酮合酶转基因重组菌或转基因细胞系在制备丙酮二羧酸或是生产托品烷类生物碱中的应用。
[0025]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明公开了古柯聚酮合酶，经研究发现古柯聚酮合酶的氨基酸序列分别是，enpks1如seq id no.4所示，enpks2如seq id no.8所示，其编码的核苷酸分别是，enpks1如seq id no.3所示，enpks2如seq id no.7所示，将古柯聚酮合酶进行原核表达后能够催化丙二酰辅酶a生成丙酮二羧酸。古柯聚酮合酶与之前在颠茄、曼陀罗和三分三中发现的催化相同反应的聚酮合酶氨基酸相似性较低（约60%），古柯聚酮合酶的发现为天然产物的合成生物学提供了更多可选择的元件，并且为这类酶的理性设计提供了指导和依据，具有很好的工业化前景。本发明完善了对古柯托品烷类生物碱生物合成的认识。
附图说明
[0026]
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为enpks1和enpks2催化的酶化学反应方程式。
[0027]
图2为pet28a
‑
enpks1和pet28a
‑
enpks2的质粒图谱。
[0028]
图3为enpks1和enpks2蛋白的sds
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，其中，1为enpks1，2为enpks2，m为蛋白marker；图4为enpks1和enpks2催化丙二酰辅酶a生成丙酮二羧酸的lc
‑
ms分析图。
具体实施方式
[0029]
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册（new york：cold spring harbor laboratory press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0030]
实施例1
古柯聚酮合酶（polyketide synthases，pks）基因的克隆。
[0031]
（1）古柯嫩芽总rna的提取及cdna第一链的合成。
[0032]
取适量古柯叶芽组织，在液氮中研磨，用biotek多糖多酚植物总rna快速提取试剂盒按说明书提取总rna。用thermo scientific nanodrop分光光度计检测rna浓度及质量，并用琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。
[0033]
用诺唯赞公司hiscript iii 1st strand cdna synthesis kit反转录试剂盒，按照其产品说明书指示，以总rna为模板，合成cdna。
[0034]
（2）enpks基因的克隆。
[0035]
设计特异性引物，具体引物序列如下：enpks1
‑
f：5
’‑
atgaacggaaccgtcaagaaaatgaatg
‑3’
（seq id no.1）enpks1
‑
r：5
’‑
tcattctgtaaccacagaaatggcacgc
‑3’
（seq id no.2）enpks2
‑
f：5
’‑
atgaacggaatggctaagaaaatgaatg
‑3’
（seq id no.5）enpks2
‑
r：5
’‑
tcacacagaaatggcacgcaaaactacg
‑3’
（seq id no.6）通过pcr以嫩芽组织的cdna为模板，扩增enpks1和enpks2的基因并测序，获得enpks1和enpks2基因的核苷酸序列如下，enpks1如seq id no.3所示，起始密码子为atg，终止密码子为tga；翻译出蛋白编码序列如seq id no.4所示；enpks2如seq id no.7所示，起始密码子为atg，终止密码子为tga；翻译出蛋白编码序列如seq id no.8所示。
[0036]
实施例2原核表达验证enpks1和enpks2基因功能。
[0037]
在酶切位点引入enpks1和enpks2基因。为enpks1和enpks2基因设计引物，enpks1正向引物带有bamhi酶切位点如seq id no.9所示，反向引物带有sali酶切位点如seq id no.10所示；enpks2正向引物带有bamhi酶切位点如seq id no.11所示，反向引物带有xhoi酶切位点如seq id no.12所示。通过pcr扩增得到两端带有酶切位点的enpks1和enpks2基因后，用这两个酶切位点产生的粘性末端分别将enpks1和enpks2的编码区完整序列连接质粒pet28a，获得重组表达载体pet28a
‑
enpks1和pet28a
‑
enpks2。
[0038]
引物序列如下：bamhi
‑
enpks1
‑
f：5
’‑
cgggatccatgaacggaaccgtcaagaaaatgaatg
‑3’
（seq id no.9）sali
‑
enpks1
‑
r：5
’‑
acgcgtcgactcattctgtaaccacagaaatggcacgc
‑3’
（seq id no.10）bamhi
‑
enpks2
‑
f：5
’‑
cgggatccatgaacggaatggctaag
‑3’
（seq id no.11）xhoi
‑
enpks2
‑
r：5
’‑
ccctcgagtcacacagaaatggcacgc
‑3’
（seq id no.12）将构建好的pet28a
‑
enpks1和pet28a
‑
enpks2质粒转化原核表达菌株rosetta（de3），涂布含有卡那霉素和氯霉素的lb固体平板，挑取单菌落培养，提取质粒进行酶切验证，筛选阳性克隆子，获得原核表达工程菌rosetta
‑
pet28a
‑
enpks1和rosetta
‑
pet28a
‑
enpks2。取菌液10 μl接种到含50 μg/l卡那霉素25μg/l氯霉素的5 ml lb液体培养基中，37℃，200 rpm过夜培养。再按1：100比例接种量分别接种到250 ml lb液体培养基中37 ℃，200 rpm进行活化培养，培养至od600 = 0.6左右时，放置冰上十分钟后，加入iptg至终浓度0.5mm。在16 ℃，200 rpm条件下继续培养18
‑
22 h。将收获的菌液4000 rpm离心，去掉上清。
再把菌体沉淀用蛋白纯化buffer重悬，并在超声破碎后，用镍柱进行蛋白纯化获得enpks1和enpks2蛋白。得到的蛋白用sds
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如图3所示。
[0039]
（2）enpks1和enpks2酶活性验证。
[0040]
enpks1和enpks2催化的体外酶反应的体系如下：磷酸钾缓冲盐（ph8.0），0.5mm丙二酰辅酶a，10μgenpks1或enpks2蛋白，总体积100μl，37℃，孵育1h后，加10μl20%hcl终止反应。
[0041]
酶反应体系用lc
‑
ms进行分析，质谱仪为agilent6530accurate
‑
massq
‑
tof，色谱柱为ymc
‑
triartc
18
（250
×
10mmi.d.），柱温30℃，流速1ml/min，流动相洗脱程序为：95%a相（含0.1%甲酸的水），5%b相（乙腈），等度洗脱10min，质谱仪为电喷雾离子源（esi），进行正离子模式扫描。
[0042]
检测结果显示，enpks1和enpks2催化生产丙酮二羧酸（m/z:169[m na]

），在分析条件下保留时间为5.7min如图4所示。
[0043]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
[0044] 本发明涉及的序列表<110>中国科学院昆明植物研究所<120>来自古柯的聚酮合酶enpks1和enpks2及其基因和应用<141>2021
‑
07
‑
03<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgaacggaaccgtcaagaaaatgaatg28<110>中国科学院昆明植物研究所<120>来自古柯的聚酮合酶enpks1和enpks2及其基因和应用<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcattctgtaaccacagaaatggcacgc28<110>中国科学院昆明植物研究所<120>来自古柯的聚酮合酶enpks1和enpks2及其基因和应用<210>3<211>1182
<212>dna<213>古柯(erythroxylumnovogranatense)<400>3atgaacggaaccgtcaagaaaatgaatggagctcggcgacctcatggtctggcctctatt60ctagccattggcaccgcaaatccatcaaactgtttcaaccaagacgaatttcctgactat120agcttcagagttaccaagtccgagcacttgacgtcccttaaagacaagttcaagcgcata180tgcgagagatcaacagtgaggaagcgatacttgcacttgacagaggaacttctccaagag240tatcccagcatagcaacctacgacgctccatcactagacgcacgtcaagagatcgaagtt300gctgaggtccccaaactcgctgccagagcagcatccagggccatcgaggaatggggacaa360cccaaaaacaaaatcacacacctcatcttctcttcaacttcaggcatagaaaaacctggc420gtggactgtcacctcgtgcaccttctaggtcttccgttgtccgtaaaccgagtaatgctc480tacactattggctgtcatgcaggtggcactgtgcttcgcattgccaaggacttggcagaa540aacaatgtcggttcacgcgttcttgtagtttgtagcgagctcaccgtcatgacgtttcgt600ggaccgtcagagaccgacttggctaatcttatacgtatgggtattttcggtgacggtgca660gctgctctcattattggtgctgaccctgacctatccatcgaaaaacctatctttgaaatt720ttctcagcttcccaaacattggttcctaacacaagcaaagcaattcgcggacgtgttaaa780gaaatggggctaacgttttacgttgacaaaatggttccaactttggtggcgagcaacatt840gagcaatgcttggataaagcgtttagtccacttggtataaatgattggaactcaatattc900tggataccacatcctggagggcctgcgattttagcagagatagaagcgaaattggaattg960aaaccgggcaagctgagagcaactagacatgtgctcagcgagtacggcaacatgtcaggt1020gcgacagtgctgttcatattggacgagatgagaaggagatcgaagaaggaagggaaaggg1080accacaggcg acggacttga gtggggtgtt ctgatgggat tcgggcccgg tgtgacggta1140gagaccatag tgttgcgtgc catttctgtg gttacagaat ga 1182<110>中国科学院昆明植物研究所<120> 来自古柯的聚酮合酶enpks1和enpks2及其基因和应用<210> 4<211> 393<212> prt<213> 古柯(erythroxylum novogranatense)<400> 4met asn gly thr val lys lys met asn gly ala arg arg pro his gly1
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