赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物制药技术领域，具体涉及赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.西蓝花、青菜、白菜、萝卜等十字花科蔬菜，是全球广泛食用的食材，且经常食用、必益健康。大多数的十字花科蔬菜含有吲哚芥子油苷，可以在酸或者芥子苷酶的作用下进一步降解产生吲哚
‑3‑
甲醇(i3c)。i3c虽有抗肿瘤等生物活性，但i3c在体内可以进一步代谢成为吲哚
‑3‑
甲醛(i3a)，吲哚
‑3‑
甲酸(i3ca)、吲哚咔唑(icz)、dim和ltr1等。鉴于i3c的化学不稳定性，其抗肿瘤活性很可能源于其代谢产物。哺乳动物的胃部和小肠为生理结构独特、生化组成特殊的酸性腔道，此腔道还栖息着大量的肠道微生物。因此，i3c(作为蔬菜成分或市售纯品)在口服后必在胃肠道中发生复杂的结构和功能的转化。但这种转化的过程及对“i3c抗肿瘤”的贡献尚不清楚。
3.因此，首先研究了i3c的体内转化产物，揭示了i3c可在哺乳动物胃肠道转化，产生的主产物为dim和ltr1。dim已经作为具有抗肿瘤潜力的保健品上市；同时，作为抗肿瘤药物，dim也进入了iii期临床研究。ltr1的生物学功能研究较少。于是，利用多种肿瘤细胞株和肿瘤模型，在相同实验背景下比较了i3c及其代谢产物dim和ltr1的抗肿瘤活性。同时，也通过分离健康志愿者粪便中的肠道菌，筛选其对i3c的转化能力。结果表明，ltr1的抗肿瘤活性优于dim和i3c，且肠道乳杆菌可将i3c最大程度地转化成为ltr1和dim。
4.健康人肠道中栖息着大量的乳杆菌，许多还是研究较多的益生菌。乳杆菌属于革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，在人的小肠中分布较多。乳杆菌通常释放乳酸、乙酸等穿透力很强的小分子，对共存(或“混进”)肠道的有害菌起拮抗作用，但其抑/杀菌作用比较弱，仅在调整和维持肠道菌群平衡方面发挥重要作用。在人的肠道中，一些丰度较高的乳杆菌，如嗜酸乳杆菌不仅拮抗致病微生物，而且分泌嗜酸乳菌素(acidolin)、嗜酸杆菌素(acidophilin)、乳酸菌素(1aetocidon)等抗生物素样物质，也对肠道致病菌产生抑制或拮抗作用。
5.一日三餐，进食多样，其中不乏酸敏感食物成分，i3c便是典型代表。故口服的i3c发挥抗肿瘤作用存在以下问题：(1)单独口服i3c或者十字花科植物的抗肿瘤效果仍然不理想。 (2)i3c的结构很不稳定，预实验发现i3c在弱酸水溶液中即可转化成多种化合物；但真正发挥作用的有效成分至今不甚明了；(3)i3c在体内的转化过程不清楚，急需回答：肠道菌能否转化i3c。若能，哪些菌可转化之？i3c转化成怎样的化合物。这些转化产物是否是肿瘤的“真正杀手”？若真有，如何提升“从i3c到抗癌分子”的转化率。
6.目前，急需一种赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌及其应用。


技术实现要素：

7.针对上述问题/不足，本发明的目的在于提供一种赋予食物成分抗癌效能的肠道
乳杆菌及其应用。
8.为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明的一种赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌，所述的赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏名：lactobacillus acidophilus，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2021年07月12日；保藏编号：cctcc m 2021863。
9.本发明所述的赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌在制备食源性抗肿瘤药物中的应用。
10.进一步地，所述赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌菌株的16s rdna基因序列为seq idno.1所示的核苷酸序列。
11.本发明所述的肠道乳杆菌制备的肠道乳杆菌菌剂。
12.进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
13.(a)所述的肠道乳杆菌的发酵培养物；
14.(b)所得肠道乳杆菌细胞的超声裂解上清；
15.(c)所得肠道乳杆菌细胞的超声裂解沉淀。
16.本发明所述的赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌在制备保健品中的应用。
17.进一步地，所述的药物为内服药物，所述的内服药物为含有乳杆菌的粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。
18.更进一步地，所述的内服药物为乳杆菌与十字花科植物提取物或其成分i3c、其他益生菌，维生素以及其他酸敏感性成分以任意比例混合的粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。
19.进一步地，内服药物的制备方法：将乳杆菌接种到mrs液体培养基平板中，1％
‑
5％的接种量，在37
±
3℃条件下，兼性厌氧培养18
‑
24小时，mrs经过离心，真空冷冻干燥，制得乳杆菌菌粉。
20.进一步地，将乳杆菌菌粉与适宜的辅料或维生素或其他菌粉等按照比例混匀，制成颗粒，为颗粒剂；将颗粒灌装于胶囊中为胶囊剂，将颗粒压片制得片剂。
21.有益效果：本发明的肠道乳杆菌与i3c纯品或含i3c的蔬菜同服，可对肺癌、黑色素瘤、白血病等肿瘤发挥预防和治疗作用。本发明的肠道乳杆菌可以定植于哺乳动物消化道，维持其较低的ph微环境，可以促进食物中的i3c转化成为抗肿瘤活性更好的dim和ltr1，从而赋予或显著提高口服i3c的抗癌效果。
22.与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明此类乳杆菌分离来源于健康人群消化道，既包括土著肠道菌，又包括通过进食(如喝酸奶)途径移居肠道的乳杆菌。
23.(2)本发明提供的具体产品为内服肠道乳杆菌与十字花科蔬菜提取物和i3c的混合制剂或分装的粉剂/颗粒剂/片剂或胶囊剂，方便储存、携带和食用。乳杆菌是公认的益生菌，西蓝花、青菜、白菜等十字花科蔬菜富含i3c。肠道乳杆菌既包括消化道内固有的土著居民，又包括从食物(如酸奶)招募的优秀移民；富含i3c的蔬菜人人食用；i3c纯品来源易得，故可按需设计不同剂量与乳杆菌同服，发挥类似(或至少不亚于)常用抗癌药的治疗作用。这些优势预示着本发明在肿瘤预防和治疗方面兼有重要意义。
24.(3)肠道乳杆菌十分独特，可在肠道内把蔬菜成分——吲哚
‑3‑
甲醇(indole
‑3‑
carbinol，简称：i3c)转化成具有较强抗肿瘤活性的二聚吲哚dim(3，3'
‑
diindolylmethane的简称)和 ltr1(2
‑
(indol
‑3‑
ylmethyl)
‑
3，3'
‑
diindolylmethane的简称)，提升蔬菜的抗
肿瘤作用。
附图说明
25.图1为本发明的不同肠道菌对i3c转化成dim和ltr1的能力也不同图。
26.图2为本发明的肠道乳杆菌通过产酸促进i3c转化为dim和ltr1图。
27.图3为本发明的酸性促进i3c向ltr1转化图。(a)mrs培养基中的ph值：加或不加i3c 或肠道乳杆菌。(b)i3c转化ltr1最适宜ph值摸索。
28.图4为本发明的抗生素除菌以及肠道乳杆菌定植效果验证图。裸鼠随机分成正常组(i)、抗生素清除组(ii)和肠道乳杆菌定植组(iii)。抗生素处理一周或者肠道乳杆菌定植三天后，取小鼠粪便进行相关检测。(a)分别用lb和mrs固体培养基平板检测粪便中的菌落情况。(b)盲肠的形态。
29.图5为本发明的借助16s rrna验证抗生素除菌及乳杆菌定植的效果图。裸鼠随机分成正常组(i)、抗生素清除组(ii)和肠道乳杆菌定植组(iii)。抗生素处理一周或者肠道乳杆菌定植三天后，取小鼠粪便进行16s rrna检测。
30.图6为本发明的定植肠道乳杆菌促进小肠部位的i3c向ltr1转化过程图。(a)实验方案。四周龄的裸鼠随机分成三组(i
‑
iii组，n＝5)。组i，灌胃给药i3c。组ii，先用复合抗生素(氨苄西林 粘菌素 链霉素)去除肠道微生物，然后灌胃给药i3c。组iii，先用复合抗生素除菌(第一周)，然后定植肠道乳杆菌，并灌胃给药i3c(从第二周开始)。(b)qpcr定量分析定植肠道乳杆菌组小鼠粪便的中各肠段乳杆菌丰度。(c
‑
j)三组小鼠不同消化道部位dim和ltr1 的含量。
31.图7为本发明的肠道乳杆菌定植可显著降低肠道微环境ph值图；
32.图8为本发明的i3c及其代谢产物的细胞毒活性比较(x表示ic
50
>10μm)图；
33.图9为本发明的a549细胞定植的裸鼠模型显示ltr1的抗肿瘤活性优于i3c和dim图。
34.(a)实验方案：四周龄的裸鼠随机分成四组(i
‑
iv，n＝6)。分别每天灌胃给药空白溶剂(100 μl，含2％dmso的玉米油)、i3c、dim和ltr1，150mg/kg/天，连续给药四周。(b
‑
d)给药四周后，比较移植瘤的肿瘤体积大小，发现ltr1的抗肿瘤活性优于i3c和dim。(e和f)ki67 免疫组化以及其表达水平等指标表明ltr1的抗肿瘤活性优于i3c和dim(e，标尺，ki67免疫组化20μm；上图中方框内放大到下层图中；f，每一个数据点代表一只小鼠肿瘤切片中的五个视野平均值.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001用two
‑
way anova检验 (c)和student’s t检验(d，f)，6个生物样品的平均值
±
sem与相应的对照对比。
35.图10为本发明的kras
g12d
小鼠模型显示ltr1的活性优于i3c、dim和培美曲塞二钠。(a)试验方案：五周龄的kras
g12d
小鼠随机分成五组(i
‑
v，n＝6)。组i
‑
iv，每天灌胃给药。组i：空白溶剂(100μl，含2％dmso的玉米油)；组ii
‑
iv：分别每天灌胃i3c、dim和ltr1，剂量均为150mg/kg/天。组v：腹腔注射培美曲塞二钠，150mg/kg/天，一周两次。所有组别连续给药十三周。(b
‑
d)比较i3c、dim、ltr1和培美曲塞二钠的抗肿瘤活性。依据指标：肺部形态、microct影像、h&e染色(标尺，2000μm；上图中方框内放大到下层图中(标尺，100μm))；肺组织的ki67免疫组化阳性细胞(标尺，100μm；上图中方框内放大到下层图中(标尺，20 μm)；小鼠肺部的肿瘤面积定量(c)和ki67免疫组化阳性率统计(d)。一个点代表一只小鼠肺部切片
中的五个视野平均值。student’s t检验，*p<0.05，****p<0.0001，数据为6个生物学重复的平均值
±
sem与相应的对照组对比统计。
具体实施方式
36.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明试验例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
37.实施例1
38.本发明的一种赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌，所述的赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏名：lactobacillusacidophilus，保藏地址是中国武汉大学；保藏日期：2021年07月12日；保藏编号：cctccm 2021863。本发明所述的赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌在制备食源性抗肿瘤药物中的应用。
39.本发明所述的肠道乳杆菌制备的肠道乳杆菌菌剂。其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
40.(a)所述的肠道乳杆菌的发酵培养物；
41.(b)所得肠道乳杆菌细胞的超声裂解上清；
42.(c)所得肠道乳杆菌细胞的超声裂解沉淀。
43.本发明所述的赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌在制备保健品中的应用。
44.所述的药物为内服药物，所述的内服药物为含有乳杆菌的粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。
45.所述的内服药物为乳杆菌与十字花科植物提取物或其成分i3c、其他益生菌，维生素以及其他酸敏感性成分以任意比例混合的粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂。
46.内服药物的制备方法：将乳杆菌接种到mrs液体培养基平板中，4％的接种量，在40℃条件下，兼性厌氧培养24小时，mrs经过离心，真空冷冻干燥，制得乳杆菌菌粉。
47.将获得乳杆菌菌粉，将乳杆菌菌粉与适宜的辅料或维生素或其他菌粉等按照比例混匀，制成颗粒，为颗粒剂；将颗粒灌装于胶囊中为胶囊剂，将颗粒压片制得片剂。
48.实施例2
49.实施例2与实施例1的区别在于：
50.内服药物的制备方法：将乳杆菌接种到mrs液体培养基平板中，5％的接种量，在34℃条件下，兼性厌氧培养18小时，mrs经过离心，真空冷冻干燥，制得乳杆菌菌粉。
51.实施例3
52.实施例3与实施例1的区别在于：
53.内服药物的制备方法：将乳杆菌接种到mrs液体培养基平板中，1％的接种量，在37℃条件下，兼性厌氧培养22小时，mrs经过离心，真空冷冻干燥，制得乳杆菌菌粉。
54.试验例1
55.高效转化i3c的肠道菌分离筛选
56.菌种来源：健康成年志愿者的食物代谢残渣(俗称：粪便)。
57.平板培养基：
58.2.1脑心浸液培养基配方(bhi)(g/l)：蛋白胨10.0、脱水小牛脑浸粉12.5、脱水牛心浸粉5.0、氯化钠5.0、葡萄糖2.0、磷酸氢二钠2.5和琼脂20.0。
59.2.2双歧杆菌bs培养基配方(g/l)：蛋白胨10.0、肝浸粉5.0、牛肉浸粉3.0、酵母浸粉 5.0、胰酪蛋白胨8.0、可溶性淀粉0.5、氯化钠1.0、磷酸氢二钾1.0、磷酸二氢钾1.0、葡萄糖10.0、feso4.7h2o 0.01，mnso
4 0.005、l
‑
半胱氨酸0.5和琼脂20.0。
60.2.3 mrs液体培养基配方(g/l)：蛋白胨10、牛肉浸粉8.6、酵母浸粉5、k2hpo
4 2、柠檬酸三铵2、乙酸钠5、葡萄糖20、吐温80ml、mgso4·
7h2o 0.58、mnso4·
4h2o 0.25和琼脂 20.0。
61.2.4 lb培养基的配方(g/l)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10和琼脂20.0。
62.2.5 gam培养基的配方(g/l)：大豆胨3、口胨10、消化血清粉13.5、酵母浸膏5、牛肉膏2.2、牛肝膏(粉)1.2、葡萄糖3、kh2po
4 2.5、可溶性淀粉5、l
‑
半胱氨酸盐0.3、硫乙醇酸钠0.3、肉汤(牛心汤)1000ml和琼脂20.0。
63.3、菌株的分离
64.由发明人利用无菌的粪便采集器，采集志愿者的粪便，样品取出后用75％酒精擦拭取样器表面，称取50g样品，在超净工作台中注入100ml无菌水，混匀后对样品液体做十倍梯度稀释，每个梯度各取100μl分别均匀涂布于上述五种固体平板培养基上，每种培养基各涂6 块板，分成两组，每三块板一组，随后一组置于厌氧培养箱(whitley dg250 anaerobicworkstation，uk)(气体组成20％co2、10％h2、70％n2)中，另外一组置于正常培养箱中， 37
゜
c条件下培养24小时。
65.次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取形态不同的菌落作二代划线纯化处理，平板继续培养24h后，所得菌株做16s rrna鉴定。
66.blast分析表明，分离获得的菌株与嗜酸乳杆菌dna序列具有99％的同源性。鉴定的序列长度1471bp，所述赋予食物成分抗癌效能的肠道乳杆菌菌株的16s rdna基因序列为seq idno.1所示的核苷酸序列。
67.试验例2
68.所分肠道菌株的i3c转化能力筛选
69.分离得到20株肠道菌(表1)，进行体外液相培养，接种于相应的培养基中进行体外培养，当菌体浓度达到od
600nm
＝2.50时，各取10ml，加入i3c(0.15mg/ml)，在相同条件下共培养24小时，各取100μl，加入等体积甲醇，涡旋，13000rpm离心15分钟，取上清，进hplc 分析。结果表明，乳杆菌菌株均具有最强的将i3c转化成为dim和ltr1的能力(图1)。用于筛选i3c转化能力的人肠道菌如表1所示：
70.表1
71.序号菌株名称序号菌株名称1bacteroides fragilis11clostridium clostridioforme2bacteroides thetaiotaomicron12clostridium perfringen3bacteroides vulgatus13enterococcus avium4bifidobacterium adolescentis14enterococcus casseliflavus5bifidobacterium angulatum15escherichia coli
6bifidobacterium bifidum16enterococcus faecalis7bifidobacterium breve17lactobacillus acidophilus8bifidobacterium catenulatum18lactobacillus gasseri9bifidobacterium longum subsp.longum19lactobacillus johnsonii10clostridium butyricum20streptococcus salivarius
72.试验例3
73.肠道乳杆菌体外转化i3c的酸依赖性研究
74.上述肠道乳杆菌的mrs培养液(od600nm＝2.50)分成6份，每份20ml，分别煮沸0(即不煮，用作对照)、1、5、10、30和60分钟以及120℃湿热灭菌30分钟。然后各分成3等份，每份6ml，调节ph分别至4.4、7.2和8.0。分装于2ml离心管中，每管1ml，加入i3c(0.15mg/ml)，于37℃培养2和24小时，分别取样100μl，加入等体积甲醇，涡旋，13000rpm离心15分钟，取上清进hplc分析。结果表明，肠道乳杆菌分泌的乳酸可显著促进i3c转化成为dim和ltr1(图 2)。
75.试验例4
76.i3c转化成ltr1的过程也是酸依赖的
77.分别取mrs培养基，接种肠道乳杆菌，到培养液的od
600nm
值等于或接近2.50时，分成6份，分装于2ml离心管中，每管1ml，加入或不加入i3c(0.15mg/ml)，于37℃需氧条件下震荡培养，分别于2、4、8、12、24、36小时取样检测ph值。结果表明肠道乳杆菌可以降低培养液中的ph值，使其维持在4.0
‑
4.5之间(图3a)。另将含有肠道乳杆菌的mrs培养液(od
600nm
＝ 2.50)分转成22份，每份100ml，分别调节ph值为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.4、 4.92、5.29、6.24、6.64、6.92、7.38、7.73、8.04、8.67、9.3、9.82、10.91、11.60和12.1。每种ph溶液分装成3份，每份1ml，加入0.15mg/ml的i3c溶液，37℃需氧条件下震荡培养24小时。分别取样100μl，加入等体积甲醇，涡旋，13000rpm离心15分钟，取上清液进行hplc 定量分析。结果表明，i3c到dim和ltr1的过程也与酸性介质有关；在ph位4.0左右时，其转化效率最高(图3b)。
78.图3为本发明的酸性促进i3c向ltr1转化。(a)mrs培养基中的ph值：加或不加i3c或肠道乳杆菌。(b)i3c转化ltr1最适宜ph值摸索。
79.试验例5
80.肠道乳杆菌的体内定植对i3c转化成dim和ltr1的影响
81.1.小鼠分组和前处理：
82.取四周龄的裸鼠75只，随机分成3组，每组25只，组i为正常组，组ii为抗生素组，组iii为定值组。抗生素组提前2周将复合抗生素(氨苄西林1mg/ml 粘菌素1mg/ml 链霉素5 mg/ml)的无菌水溶液给裸鼠替换饮用水。用平板法，盲肠形态，盲肠肠壁的h&e染色，以及16s rrna或者qpcr法检测和评价抗生素和定值效果。结果表明，联合抗生素具有很好的杀菌效果(图4)。此外，定植肠道乳杆菌后，肠道中的乳杆菌丰度得到较大的提高(图5和图 6b)。
83.图4为本发明的抗生素除菌以及肠道乳杆菌定植效果验证。裸鼠随机分成正常组(i)、抗生素清除组(ii)和肠道乳杆菌定植组(iii)。抗生素处理一周或者肠道乳杆菌定植三天后，取小鼠粪便进行相关检测。(a)分别用lb和mrs固体培养基平板检测粪便中的菌落情况。(b)盲肠的形态。
84.图5为本发明的借助16s rrna验证抗生素除菌及乳杆菌定植的效果。裸鼠随机分成正常组 (i)、抗生素清除组(ii)和肠道乳杆菌定植组(iii)。抗生素处理一周或者肠道乳杆菌定植三天后，取小鼠粪便进行16s rrna检测。
85.2.取样处理
86.小鼠灌胃i3c，分别于灌胃后5、10、20、40和60分钟处死，取胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠。分别称取内容物，用无菌水稀释5倍后检测ph值。同时，取内容物各100mg，用5倍体积的含有50ng/l酮康唑的乙酸乙酯提取，涡旋，离心，上清真空除去溶剂，用200μl 的色谱甲醇复溶，离心，各取50μl送测lc
‑
ms/ms分析。结果表明，抗生素杀菌后，i3c转化成为dim和ltr1的产率显著降低；肠道乳杆菌定植可显著降低肠道微环境ph值(图7)，i3c 转化成为dim和ltr1的产率显著提高(图6g
‑
j)。
87.图6为本发明的定植肠道乳杆菌促进小肠部位的i3c向ltr1转化过程。(a)实验方案。四周龄的裸鼠随机分成三组(i
‑
iii组，n＝5)。组i，灌胃给药i3c。组ii，先用复合抗生素(氨苄西林 粘菌素 链霉素)去除肠道微生物，然后灌胃给药i3c。组iii，先用复合抗生素除菌(第一周)，然后定植肠道乳杆菌，并灌胃给药i3c(从第二周开始)。(b)qpcr定量分析定植肠道乳杆菌组小鼠中各肠段乳杆菌丰度。(c
‑
j)三组小鼠不同消化道部位内容物中dim和 ltr1的含量。
88.试验例6
89.i3c及其代谢产物的细胞毒活性比较
90.从上海中乔新舟生物科技有限公司购买的人肿瘤细胞包括：非小细胞肺癌细胞a549、结肠癌细胞sw480、肝癌细胞hepg2、黑素瘤细胞a375、乳腺癌下包mcf
‑
7及卵巢癌细胞caov
‑
3，分别用dmem培养基(含10％胎牛血清，100units/l青霉素g钠和100μg/l的硫酸链霉素) 培养，接种至96孔板中，接种细胞量约10000个/孔，每孔体积200μl培养基,37℃，5％co2培养箱中培养24h。所有待测样品(i3a,i3ca,icz,i3c,dim,ltr1,阿霉素)用dmso配置终浓度为10mm的母液。以dmso稀释至不同浓度，加入96孔板中。同时,以dmso作为空白对照组。继续培养48小时后，加入20μl mtt(3
‑
(4,5
‑
dimethyl
‑2‑
thiazolyl)
‑
2,5
‑
diphenyl
‑2‑
h
‑
tetrazoliumbromide)溶液(5mg/ml)，继续培养4小时。终止培养,小心除去上清，每孔加入150μl dmso 溶解结晶，于酶标仪(490nm)上检测吸光度。计算半数抑制率ic
50
值。结果表明，在i3c 的系列代谢产物中，i3a,i3ca,icz,i3c的ic
50
都大于10μm；ltr1的体外细胞毒活性最好，优于i3c和dim(图8)。
91.试验例7
92.ltr1的体内抗非小细胞肺癌的效果优于i3c和dim
93.1.细胞接种：
94.a549细胞的磷酸盐缓冲液(pbs)混悬液100μl(6
×
106)将分别注入雌性裸鼠右腋窝。每三天对所有试验动物进行一次活力、生理状况、体重和肿瘤生长的监测。肿瘤体积按 1/2
×
l
×
w2公式计算，其中“l”和“w”分别是肿瘤的长直径和短直径(单位：cm)。当移植的肿瘤大小为20
×
40mm2(指定为“第0天”)，将小鼠随机分为治疗组和对照组。
95.2.抗肿瘤活性评价：
96.(a)试验方案：四周龄的裸鼠随机分成四组(i
‑
iv，n＝6)。分别每天灌胃给药空白溶剂 (100μl，含2％dmso的玉米油)、i3c、dim和ltr1，给药量150mg/kg/天，连续给药四周。
97.(b
‑
f)抗肿瘤活性评价：给药四周后，i3c、dim和ltr1的抗肿瘤活性分别通过：肿瘤的体积与重量、ki67免疫组化以及其表达水平等指标来评价。结果表明，在非小细胞肺癌细胞a549定植的裸鼠模型上，ltr1的抗肿瘤活性优于i3c和dim(图9)
98.图9为本发明的a549细胞定植的裸鼠模型显示ltr1的抗肿瘤活性优于i3c和dim图。(a) 实验方案：四周龄的裸鼠随机分成四组(i
‑
iv，n＝6)。分别每天灌胃给药空白溶剂(100μl，含2％dmso的玉米油)、i3c、dim和ltr1，150mg/kg/天，连续给药四周。(b
‑
d)给药四周后，比较移植瘤的肿瘤体积大小，发现ltr1的抗肿瘤活性优于i3c和dim。(e和f)ki67免疫组化以及其表达水平等指标表明ltr1的抗肿瘤活性优于i3c和dim(e，标尺，ki67免疫组化 20μm；上图中方框内放大到下层图中；f，每一个数据点代表一只小鼠肿瘤切片中的五个视野平均值.*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001用two
‑
way anova检验(c)和 student’s t检验(d，f)，6个生物样品的平均值
±
sem与相应的对照对比。
99.试验例8
100.kras
g12d
原位肺癌小鼠模型显示ltr1的抗癌效果优于i3c、dim和培美曲塞二钠
101.kras
g12d
小鼠与腺病毒感染和鉴定：
102.用以下引物对c57bl/6kras
g12d
小鼠进行鉴定：
103.正向引物：野生小鼠5
′‑
tgtctccagagt
‑3′
；突变小鼠5
′‑
gcaggtcg
‑
agggacctata
‑3′
。
104.反向引物：5
′‑
ctgcatagtacgctataccctgt
‑
3。
105.8％水合氯醛麻醉后，kras
g12d
小鼠经鼻给药15μl 2.7
×
107μg/ml的adcre病毒 (paav
‑
cmv
‑
bglobin
‑
cre
‑
egfp，上海吉凯基因化学技术有限公司，中国)产生内源性肺肿瘤。
106.2.活性评价：
107.(a)实验方案：五周龄的kras
g12d
小鼠随机分成五组(i
‑
v，n＝6)。组i
‑
iv，每天灌胃给药。组i：空白溶剂(100μl，含2％dmso的玉米油)；组ii
‑
iv：分别每天灌胃i3c、dim 和ltr1，150mg/kg/天。组v：腹腔注射培美曲塞二钠(阳性对照)，150mg/kg/天，一周两次。所有组别连续给药十三周。
108.(b)抗肿瘤活性评价：
109.给药13周后，通过ct图像分析评估给药疗效。最后一次给药15分钟后，眼眶取血，收集肺部，一部分液氮速冻，一部分用福尔马林固定。i3c、dim、ltr1和培美曲塞二钠的抗肿瘤活性评价：根据肺部形态、microct影像、h&e染色、肺组织的ki67免疫组化、小鼠肺部的肿瘤面积定量和ki67免疫组化阳性率等指标来进行评价。结果表明，在kras
g12d
原位肺癌小鼠模型上，ltr1的活性优于i3c、dim和培美曲塞二钠(图10)。
110.图10本发明的kras
g12d
小鼠模型显示ltr1的活性优于i3c、dim和培美曲塞二钠图。(a)试验方案：五周龄的kras
g12d
小鼠随机分成五组(i
‑
v，n＝6)。组i
‑
iv，每天灌胃给药。组i：空白溶剂(100μl，含2％dmso的玉米油)；组ii
‑
iv：分别每天灌胃i3c、dim和ltr1，剂量均为150mg/kg/天。组v：腹腔注射培美曲塞二钠，150mg/kg/天，一周两次。所有组别连续给药十三周。(b
‑
d)比较i3c、dim、ltr1和培美曲塞二钠的抗肿瘤活性。依据指标：肺部形态、microct影像、h&e染色(标尺，2000μm；上图中方框内放大到下层图中(标尺，100μm))；肺组织的ki67免疫组化阳性细胞(标尺，100μm；上图中方框内放大到下层图中(标尺，20 μm)；小
鼠肺部的肿瘤面积定量(c)和ki67免疫组化阳性率统计(d)。一个点代表一只小鼠肺部切片中的五个视野平均值。student’s t检验，*p<0.05，****p<0.0001，数据为6个生物学重复的平均值
±
sem与相应的对照组对比统计。
111.试验例9
112.肠道乳杆菌粉剂、颗粒剂、胶囊剂和片剂的制备
113.冻干菌粉的制备方法为：肠道乳杆菌接种到mrs液体培养基平板中，1％
‑
5％的接种量，在37
±3゜
c条件下，兼性厌氧培养18
‑
24小时，mrs经过离心，真空冷冻干燥，即得肠道乳杆菌的粉剂，制成颗粒，为颗粒剂；将颗粒灌装于胶囊中为胶囊剂，颗粒进一步压片即得其片剂。
114.试验例10
115.肠道乳杆菌粉与十字花科植物提取物复合制剂
116.取肠道乳杆菌粉与十字花科植物提取物，分别或混合制成(按“1～100比1～100”之比例混合)粉末，颗粒剂，胶囊剂或片剂，分别或同时服用。
117.试验例11
118.肠道乳杆菌粉与i3c复合制剂
119.取肠道乳杆菌粉与i3c，分别或混合制成(按“1～100比1～100”之比例混合)粉末，颗粒剂，胶囊剂或片剂，分别或同时服用。
120.试验例12
121.肠道乳杆菌粉的制备
122.取肠道乳杆菌粉与加氏乳杆菌lactobacillus gasseri,约氏乳酸杆菌lactobacillus johnsonii 菌粉单独或混合制成(按“1～100比1～100”之比例混合)粉末。
123.试验例13
124.肠道乳杆菌粉的制备
125.取肠道乳杆菌粉、加氏乳杆菌lactobacillus gasseri,约氏乳酸杆菌lactobacillus johnsonii 菌粉单独或混合后，再与辅料硬脂酸镁、二氧化硅等混合。
126.试验例14
127.肠道乳杆菌粉的制备
128.取肠道乳杆菌粉、加氏乳杆菌lactobacillus gasseri,约氏乳酸杆菌lactobacillus johnsonii 菌粉按照比例混匀，再加上适宜维生素e,b2等混合，再与辅料硬脂酸镁、二氧化硅等混合。
129.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述试验例的限制，上述试验例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。