一种治疗难治性口腔溃疡的高效抗菌天然茶树精油纳米乳制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种治疗难治性口腔溃疡的高效抗菌天然茶树精油纳米乳制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.口腔溃疡，又被称为“口疮”，在我国发病率高，尤其是川渝地区更高，是一种常见并多发的口腔黏膜性疾病。其中，难治性口腔溃疡现阶段并无特效药物治疗，其在全球发病率为10％～20％，口腔溃疡有多种发病原因，如免疫因素，病毒细菌感染，遗传因素，维生素的缺乏，精神因素，心理应激，创伤因素等。
3.目前国内大多研究显示，幽门螺杆菌(hp)是导致难治性口腔溃疡的重要原因，口腔溃疡患者口腔中幽门螺杆菌检出率远高于正常人群。该菌导致口腔溃疡可能存在两种过程：一是幽门螺杆菌直接作用于人体细胞，改变人体细胞的抗原性，促使机体产生抗口腔粘膜的自身抗体，引发免疫反应；二是在幽门螺杆菌感染后，其代谢物和酶引发局部炎症反应，炎症产生的氧自由基和细胞因子会进一步加重伤害。同时口腔中的变形链球菌和白色念珠球菌也会加重口腔溃疡感染。然而随着口腔溃疡这一问题逐渐被重视，越来越多的治疗方法逐渐被发现。目前治疗口腔溃疡多以抗菌药，补充维生素b，口服甲硝唑联合口腔溃疡散，硫酸锌口服液或者涂抹蒙脱石散为主。但这些药物都对口腔黏膜有着很大的伤害。虽然三联或四联制剂、茶多酚和洗必泰等制剂能够部分清除幽门螺杆菌，但治疗效果欠佳，因此急需研制出新型高效理想制剂。
4.而茶树精油作为天然的抗菌剂，在国内研究较少，然则在国外提及较多。groppo等报道40个受试者连续1周每天使用1次含0.2％茶树精油的漱口水后，口腔致病菌(变异链球菌)数量及口腔细菌总量较安慰剂组显著降低。arweiler和soukouli分别用0.34％茶树精油漱口水、2.5％茶树精油口腔凝胶剂研究了其对菌斑形成及其活性的影响，得到相似结论：茶树精油可减少口腔细菌数量，降低口腔炎症水平。但茶树精油及其纳米乳制剂对口腔溃疡处感染的幽门螺杆菌是否具有清除作用，还有待进一步研究。由于茶树精油是油性物质，难以溶于水，在水中呈不均匀分布，使其开发与应用严重受限。因此，急迫需要对其剂型进行改造。
5.纳米乳是一种热动学稳定的油水分散体系，可溶解并递送水溶性弱的药物，保护活性成分避免降解，延缓释放。还可很好地将药物靶向作用到位点，增加药物载药量、溶解度和生物利用度，提高稳定性，减少相互渗透，使分散更加均匀，使得其得到越来越多的关注，已经被广泛应用在各领域中。但是由于茶树精油为油性物质，使用常规纳米乳制备方法制得稳定性差，因此急需一种稳定性好的纳米乳制备方法，期望能从根本上解决口腔溃疡感染幽门螺杆菌所导致的难治性口腔溃疡这一难题，并期望将其推广至更广泛的疾病治疗当中，如口腔中变形链球菌、白色念珠球菌感染导致的口腔疾病以及金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌导致的创伤感染中去。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种茶树精油纳米乳制剂，包含下述质量份数的组分：茶树精油0.01
‑
15份，表面活性剂1
‑
30份，助表面活性剂0.1
‑
15份，油相0.1
‑
10份，水30
‑
98.79份，质量稳定，分散性良好；本发明的目的之二在于提供所述茶树精油纳米乳制剂的制备方法；本发明的目的之三在于提供所述茶树精油纳米乳制剂在制备治疗难治性口腔溃疡的药物中的应用；本发明的目的之四在于提供所述的茶树精油纳米乳制剂在制备抑制变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠球菌的药物中的应用。
7.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.1、一种茶树精油纳米乳制剂
9.包含下述质量份数的组分：茶树精油0.01
‑
15份，表面活性剂1
‑
30份，助表面活性剂0.1
‑
15份，油相0.1
‑
10份，水30
‑
98.79份。
10.优选的，所述表面活性剂为吐温
‑
60、吐温
‑
80、吐温
‑
85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或聚氧乙烯蓖麻油中任一种或多种组合。
11.优选的，所述助表面活性剂为司盘
‑
80、司盘
‑
85、无水乙醇、丙二醇、甘油、1，3
‑
丁二醇中任一种或多种组合。
12.优选的，所述油相为乙酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、大豆卵磷脂、棕榈酸乙酰酯、角鲨烷、角鲨烯或油酸乙酯中任一种或多种组合。
13.进一步优选的，包含下述质量份数的组分：茶树精油0.1
‑
10份，聚氧乙烯蓖麻油或聚氧乙烯氢化蓖麻油1
‑
30份，丙二醇或甘油1
‑
5份，大豆卵磷脂1
‑
10份，水45
‑
96.9份。
14.优选的，所述茶树精油纳米乳制剂的粒径分布在1～300nm之间，分散指数小于0.3，zeta电位绝对值小于30mv。
15.2、所述茶树精油纳米乳制剂的制备方法，包含如下步骤：
16.将茶树精油充分溶解于油相和助表面活性剂中，然后加入表面活性剂，再次混匀，最后边搅拌边缓慢滴加水，即得澄清透明的茶树精油纳米乳制剂。
17.3、所述茶树精油纳米乳制剂在制备治疗难治性口腔溃疡的药物中的应用
18.优选的，所述难治性口腔溃疡是由幽门螺杆菌感染所致。
19.4、所述茶树精油纳米乳制剂在制备抑制变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠球菌药物中的应用。
20.本发明的有益效果在于：
21.本发明公开了一种治疗难治性口腔溃疡的高效抗菌天然茶树精油纳米乳制剂及其制备方法和应用，该制剂由茶树精油、表面活性剂、助表面活性剂和油相、水相通过低能乳化法工艺制备而成，粒径为1
‑
300nm范围，分散性指数小于0.3，电位对数值小于30mv，高速离心，且质量稳定，分散性良好。通过体外对难治性口腔溃疡的幽门螺杆菌的mic、mbc抗菌增效作用发现，制备的茶树精油纳米乳对幽门螺杆菌的mic值为48.8μg/ml，mbc值为97.5μg/ml，而茶树精油混悬液的mic值为195μg/ml、mbc值为390μg/ml，提高抗菌效果4倍，具有显著体外抗菌增效作用；而后通过冰乙酸导致口腔溃疡并用幽门螺杆菌感染，首次成功建立大鼠难治性口腔溃疡模型，在此基础上，研究发现天然茶树精油纳米乳制剂能显著减低难治性口腔溃疡处幽门螺杆菌的细菌定植量，促进难治性口腔溃疡愈合。
22.本发明制备的天然抗菌植物茶树精油纳米乳具有良好的体内外抗菌增效作用，能够高效地清除大鼠口腔溃疡处所感染的幽门螺杆菌，降低炎症水平，促进口腔溃疡的愈合。同时本发明专利对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌可提高抗菌效果2
‑
8倍。本发明专利对多种菌株均具有极其显著的抗菌增效作用，尤其适用于难治性口腔溃疡的治疗，具有极大的临床应用价值和广阔的市场前景。
附图说明
23.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
24.图1不同配方制备的茶树精油纳米乳；
25.图2为制备的茶树精油纳米乳的表征及稳定性检测结果(a分别为透射电镜120k、30k、12k；b分别为扫描电镜15k，5k，2k；c：粒度分布；d：电位分布；e：13000rpm,30min高速离心结果)；
26.图3为对幽门螺杆菌的体外抗菌增效作用图(a：mic；b：mbc)；
27.图4为对变形链球菌的体外抗菌增效作用图：(a：mic；b：mbc)；
28.图5为对铜绿假单胞菌的体外抗菌增效作用图：(a：mic；b：mbc)；
29.图6为对金黄色葡萄球菌的体外抗菌增效作用图：(a：mic；b：mbc)；
30.图7为对鲍曼不动杆菌的体外抗菌增效作用图：(a：mic；b：mbc)；
31.图8为对白色念珠球菌的体外抗菌增效作用图(a：mic；b：mbc,c:不同配方对白色念珠球菌的抗菌效果)；
32.图9为大鼠难治性口腔溃疡模型的建立(a：单个大鼠口腔溃疡照片；b：各分组全部大鼠口腔溃疡照片)；
33.图10大鼠难治性口腔溃疡体内抗菌增效作用图(a：1
‑
5组大鼠口腔溃疡照片；b：大鼠口腔溃疡面积折线图；c：大鼠口腔溃疡病理切片；d：第0，7天大鼠口腔溃疡细菌定植量)。
具体实施方式
34.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
35.实施例1、茶树精油纳米乳(tne)的配方筛选
36.配方1茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油1g、吐温
‑
60 2g、甘油2g、ipm 10g、蒸馏水85g。
37.配方2茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油0.1g、吐温
‑
60 30g、丙二醇10g、辛癸酸甘油酯(gtcc)10g、蒸馏水49.9g。
38.配方3茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油2g、吐温
‑
80 5g、乙醇0.1g、乙酸乙酯0.1g、蒸馏水92.8g。
39.配方4茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油5g，聚氧乙烯蓖麻油20g，丙二醇4g，大豆卵磷脂6g，蒸馏水65g。
40.配方5茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油2g、吐温
‑
20 30g、1,3丁二醇10g、gtcc 15g、蒸馏水43g。
41.配方6茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油1g、吐温
‑
85 2g、丙二醇0.2g、甘油0.1g、gtcc0.1g、ipm 0.1g、蒸馏水96.5g。
42.配方7茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油15g、吐温
‑
85 30g、丙二醇1g、石蜡油0.1g、蒸馏水53.9g。
43.配方8茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油0.1g、吐温
‑
60 1g、吐温
‑
85 2g、司盘
‑
60 0.1g、肉豆蔻酸异丙酯(ipm)0.1g、蒸馏水96.7g。
44.配方9茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油5g、rh40 5g、丙二醇0.5g、gtcc 0.5g、蒸馏水89g。
45.配方10茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油1g、el35 30g、乙醇0.5g、乙酸乙酯10g、蒸馏水58.5g。
46.配方11茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油2g、el40 30g、甘油10g、油酸乙酯10g、蒸馏水48g。
47.配方12茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油5g、el40 1g、丙二醇0.1g、石蜡油0.5g、蒸馏水93.4g。
48.配方13茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油10g、吐温
‑
60 1g、司盘
‑
60 0.1g、角鲨烯0.1g、蒸馏水88.8g。
49.配方14茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油5g、吐温
‑
80 5g、司盘
‑
60 0.1g、角鲨烯0.5g、蒸馏水89.4g。
50.配方15茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油0.01g、吐温
‑
80 25g、司盘
‑
80 10g、角鲨烷10g、蒸馏水54.99g。
51.配方16茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油10g、吐温
‑
85 5g、司盘
‑
86 1g、角鲨烷0.1g、角鲨烯0.5g、生理盐水83.4g。
52.配方17茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油2g、吐温
‑
85 25g、司盘
‑
85 15g、角鲨烯10g、蒸馏水48g。
53.配方18茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油5g、el35 10g、司盘
‑
80 0.1g、角鲨烯0.1g、蒸馏水84.8g。
54.配方19茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油6g、吐温80 30g、司盘80 15g、角鲨烯5g、蒸馏水44g。
55.配方20茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油2g、el40 20g、甘油1g、油酸乙酯0.5g、蒸馏水76.5g。
56.配方21茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油0.5g、rh40 30g，1，3丁二醇1g、大豆磷脂15g、蒸馏水53.5g。
57.配方22茶树精油纳米乳(100g)：茶树精油2g、吐温
‑
20 1g，司盘60 10g、大豆磷脂5g、蒸馏水82g。
58.对表面活性剂(sf)，如：吐温
‑
80、吐温
‑
85、吐温
‑
60、吐温
‑
20和聚氧乙烯蓖麻油(el40、el35)、聚氧乙烯氢化蓖麻油等进行筛选，根据高速离心稳定实验、粒度和电位等检测，发现上述处方及其范围内均可形成茶树精油纳米乳。
59.将上述配方稀释100倍用纳米电位分析仪进行粒度和分散性检测；用高速离心13，000rpm，30min观察离心前后的是否分层、絮凝，药物析出、破乳等不稳定性现象发生。
60.其检测结果如表1所示：
61.表1、不同配方检测结果
62.配方平均粒度分散性分层絮凝药物析出破乳1524.50.132分层絮凝未析出未破乳26200.22分层絮凝析出未破乳31010.13分层未絮凝未析出未破乳42120.124未分层未絮凝未析出未破乳5225.30.14未分层未絮凝未析出未破乳61020.135未分层未絮凝未析出未破乳72350.252未分层未絮凝未析出未破乳8810.221分层絮凝析出未破乳92250.138分层絮凝未析出未破乳10145.90.142未分层未絮凝未析出未破乳1160.80.411未分层未絮凝未析出未破乳12171.00.421未分层未絮凝未析出未破乳13262.90.113未分层絮凝未析出未破乳14227.30.42未分层未絮凝未析出未破乳15150.00.292未分层未絮凝未析出破乳16124.90.124未分层未絮凝未析出未破乳17140.10.153未分层未絮凝未析出未破乳18344.00.224未分层未絮凝析出未破乳19214.00.121未分层未絮凝未析出未破乳2088.00.134未分层絮凝未析出未破乳21242.00.132未分层未絮凝未析出未破乳22212.00.145未分层未絮凝未析出未破乳
63.上述配方的纳米乳，用100倍纳米电位分析仪进行粒度和分散性检测；用高速离心13，000rpm，30min观察离心前后的是否有分层、絮凝，药物析出、破乳等不稳定性现象发生，若均满足要求，粒径在1
‑
300nm，分散性指数小于0.3，离心后未分层，未絮凝、药物未析出、未破乳，则为合格的茶树精油纳米乳配方。上述配方1
‑
9为后续研究的9个配方，如图1所示。制备的茶树精油纳米乳只要粒径范围在1
‑
300nm以内的，稳定性好的纳米乳在后续实施例中都有类似的结果。
64.实施例2、茶树精油纳米乳(tne)稳定性及表征
65.(1)将tne置于13000rpm离心30min观察tne是否有分层、絮凝等不稳定现象发生；
66.(2)粒径及zeta电位检测：用超纯水将制得的纳米乳稀释100倍，在nano zs动态光散射粒径电位仪中检测粒径及zeta电位；
67.(3)透射电镜(tem)检测：用超纯水将制得的纳米乳稀释100倍，取5μl于电镜铜网上，静置10分钟，使用滤纸小心吸干多余水分，滴加10μl 1％磷钨酸染色1分钟，用滤纸吸干多余水分，在tevnai10透射电镜下观察并采集图像；
68.(4)扫描电镜(sem)检测：用超纯水将制得的纳米乳稀释100倍，取5μl滴在硅片，静
置10分钟，使用滤纸小心吸干多余水分，喷金后扫描电镜观察。
69.配方4制备的茶树精油纳米乳的表征及稳定性检测结果，如图2所示。透射电镜(图2，a)与扫描电镜(图2，b)观察得到tne呈球形，分散性良好，无聚集，具有良好的质量特征。tne的粒径与zeta电位分布窄，平均粒径为212nm(图2，c)，zeta电位为
‑
20.5mv(图2，d)，满足纳米药物的要求。
70.取配方4制备的纳米乳1ml置于13000rpm，30min高速离心，观察离心前后是否有分层、絮凝，药物析出、破乳等不稳定性现象发生，若离心后的纳米乳未分层，未絮凝、药物未析出、未破乳，且平均粒度分布在1
‑
300nm，分散性指数小于0.3，为合格的茶树精油纳米乳配方。结果显示，本发明制备的纳米乳稳定性好。
71.实施例3、茶树精油纳米乳(tne)体外抗菌增效作用
72.对幽门螺杆菌的体外抗菌增效作用
73.将幽门螺杆菌ss1菌液(hp菌)在600nm处的od值调为1，hp菌液体培养基调整菌液浓度为1
×
108cfu/ml，将调整后的菌液与配方4制备的茶树精油纳米乳药物按1：9的比例加入96孔板中，使药物终浓度为390、195、97.5、48.8、24.4、12.2、6.1、3.1μg/ml。每个配方浓度3个重复，另外三孔阳性各加入200μl菌液，三孔阴性各加入200μl幽门螺杆菌液体培养基，而后将96孔板置于微需氧培养箱中以37℃，10％co2，85％n2，5％o2和150rpm的条件培养24h，24h后测定96孔板各孔在595nm处的吸光度值。
74.结果如图3所示，mic(图3，a)和mbc(图3，b)结果表明，tne对hp菌的mic为48.8μg/ml，mbc为97.5μg/ml。而茶树精油混悬液(tto)对hp的mic为195μg/ml，mbc为390μg/ml。tto的mic值是tne的4倍，mbc值为tne的4倍。可见，tne对幽门螺杆菌具有良好的体外抗菌增效作用。
75.对其他菌株的抗菌增效作用
76.茶树精油纳米乳对变形链球菌(atcc 700610)、铜绿假单胞菌(atcc27853.)、金黄色葡萄球菌(atcc 252)、鲍曼不动杆菌(atcc 17978)和白色念珠球菌(atcc 10231)的mic的检测
77.利用微量稀释法检测茶树精油混悬液和茶树精油纳米乳的最低抑菌浓度mic值。变形链球菌使用的固体、液体培养基分别为轻唾琼脂培养基(ms)和脑心浸出液肉汤培养基(bhi)；铜绿假单胞菌使用的固体、液体培养基分别为lb营养琼脂培养基和lb肉汤培养基；金黄色葡萄球菌使用的固体、液体培养基分别为肉汤固体培养基(mueller hinton broth，mha)和肉汤液体培养基(mueller hinton broth，mhb)；鲍曼不动杆菌使用的固体、液体培养基分别为胰蛋白胨大豆琼脂(tsa)和胰蛋白胨大豆肉汤(tsb)；白色念珠球菌使用的固体、液体培养基分别为脑心浸出液琼脂培养基(bhi)和脑心浸出液肉汤培养基(bhi)。
78.测定二次活化后的变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌在波长a为600nm处的吸光度(od
600
)，并将菌液调节至od
600
＝1.0，此时对应的菌液浓度为1
×
109cfu/ml。菌液稀释1000倍后，180μl的菌液分别与20μl相同浓度的茶树精油混悬液和茶树精油纳米乳混合，倍比稀释后，37℃培养16
‑
18h，其中变形链球菌放入微需氧培养箱(37℃，10％co2，85％n2，5％o2)，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌则于37℃恒温培养箱内培养。用酶标仪在595nm波长处检测其吸光度数值，od595＜0.1为阴性，其余为阳性，以各剂型最后一组阴性孔所对应浓度为其mic值。同时检
测上述选择的9个合格配方对于白色念珠球菌的mic值。
79.mbc：吸取上述mic培养的菌液2μl，滴入固体培养板，37℃孵育24h，观察细菌的生长情况。
80.结果表明：茶树精油纳米乳对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌mic的检测结果如图4～8所示，本发明的茶树精油纳米乳对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌的mic分别为0.49mg/ml(图4，a)、3.91mg/ml(图5，a)、1.95mg/ml(图6，a)、0.24mg/ml(图7，a)和0.12mg/ml(图8，a)。茶树精油混悬液(tto)对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌的分别是0.98mg/ml(图4，a)、31.25mg/ml(图5，a)、7.81mg/ml(图6，a)、0.98mg/ml(图7，a)和0.49mg/ml(图8，a)。本发明的茶树精油纳米乳对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌的抗菌效果分别是茶树精油混悬液的2倍，8倍，4倍，4倍和4倍。本发明专利在变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌的抗菌活性明显高于茶树精油混悬液。不同配方1
‑
9对白色念珠球菌mic结果是1.96、0.49、1.96、0.12、1.96、3.92、1.96、3.92、0.98mg/ml是茶树油混悬液(0.49mg/ml)的4、1、4、1/4、4、8、4、1和2倍(图8，c)。
81.茶树精油纳米乳对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌mbc的检测结果如图4～8所示，本发明的茶树精油纳米乳对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌的mbc分别为0.98mg/ml(图4，b)、3.91mg/ml(图5，b)、3.91mg/ml(图6，b)、0.24mg/ml(图7，b)和0.24mg/ml(图8，b)。茶树精油混悬液对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌的分别是1.95mg/ml(图4，b)、31.25mg/ml(图5，b)、7.81mg/ml(图6，b)、0.98mg/ml(图7，b)和0.49mg/ml(图8，b)。本发明的茶树精油纳米乳对变形链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和白色念珠球菌的杀菌效果分别是茶树精油混悬液的2倍，8倍，2倍，4倍和2倍。
82.实施例4、茶树精油纳米乳在难治性口腔溃疡治疗中的应用
83.1、sd大鼠难治性口腔溃疡模型的建立
84.实验分组及处理方案如下：
85.组1：于sd大鼠右侧颊部内侧注射20％冰醋酸水溶液0.1ml 感染hp；
86.组2：于sd大鼠右侧颊部内侧注射10％冰醋酸水溶液0.1ml 感染hp；
87.组3：将棉花填塞于5mm移液管中，蘸取90％冰醋酸溶液按压sd大鼠右侧颊部内侧2min 感染hp。
88.sd大鼠感染hp方法：使用1
×
109cfu/ml幽门螺杆菌活化菌液0.3ml漱口(反复冲洗大鼠颊部，3
‑
5次)，连续2次，间隔12h，连续14天内观察口腔溃疡愈合情况。
89.通过三种不同方法处理sd大鼠，造成口腔溃疡后，用幽门螺杆菌感染sd大鼠，从而建立难治性口腔溃疡模型，结果如图9所示。从图9可看出，组1sd大鼠口腔溃疡模型成功率为70％，组2sd大鼠口腔溃疡模型成功率为50％，组3sd大鼠口腔溃疡模型成功率为30％。由此可见，于sd大鼠右侧颊部内侧注射20％冰醋酸溶液0.1ml(组1)，24小时后大鼠口腔溃疡模型成功率较高，为建立大鼠难治性口腔溃疡模型的理想方法。
90.2、体内抗菌增效作用
91.实验分组及处理方案：
92.组1(感染组)：注射20％冰醋酸溶液0.1ml 感染hp tne 0.3ml/d漱口；
93.组2(感染组)：注射20％冰醋酸溶液0.1ml 感染hp tto 0.3ml/d漱口；
94.组3(感染组)：注射20％冰醋酸溶液0.1ml 感染hp bne 0.3ml/d漱口；
95.组4(感染组)：注射20％冰醋酸溶液0.1ml 感染hp；
96.组5(未感染组)：注射20％冰醋酸溶液0.1ml。
97.其中，bne为未添加茶树精油的空白纳米乳。于sd大鼠右侧颊部内侧注射20％冰醋酸溶液0.1ml造成大鼠口腔溃疡，再用幽门螺杆菌感染建立难治性口腔溃疡模型。24h后即观察到大鼠口腔溃疡的存在，第1
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14天每天用tto、tne、bne处理一次，连续处理14天，检测细菌定植量、愈合面积和溃疡部位的病理改变情况。
98.统计学分析：结果用spss17.0统计学软件分析，两组均数采用t检验，多组采用单因素方差分析。
99.结果如图10所示，显示第14天(图10，a)，组别1大鼠口腔溃疡基本完全愈合，组别2仍可见口腔溃疡痕迹，组别3
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5仍可见清楚的口腔溃疡及红肿热痛的炎症反应，由此可见组别1大鼠口腔溃疡愈合速度较快，口腔溃疡部位红肿热痛等炎症反应较小，说明tne能够促进大鼠口腔溃疡的愈合。图10，b可以清楚的看出组别1中大鼠口腔溃疡愈合速度明显快于组别2、3，细菌定植量也有明显的下降(p＝0.044)，(图10，d)。于此同时，tne能够有效的降低大鼠口腔溃疡处的炎症水平，促进伤口的愈合(图10，c)。总的来说，tne对幽门螺杆菌具有高效的体内抗菌增效作用，同时能够降低大鼠口腔溃疡处的炎症反应，促进伤口的愈合。
100.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。