通过非抗生素依赖性阳性选择筛选表达多基因转基因的细胞克隆的制作方法

通过非抗生素依赖性阳性选择筛选表达多基因转基因的细胞克隆
1.本技术要求2019年12月9日提交的美国临时申请号62/945,512的优先权和权益，其全部内容通过援引并入本文。
技术领域
2.本发明的领域是在不使用抗生素的情况下用于阳性选择经修饰的真核细胞克隆的方法和细胞组合物。


背景技术：

3.以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
4.用于在真核细胞中表达转基因因子的真核细胞的基因工程可以使用若干种已建立的转染方法(病毒转导、脂质转染、电穿孔等)中的一种进行，所有这些方法都需要选择步骤来分离或富集表达转基因的细胞。选择可以通过若干种方法(例如，抗生素或其他药物抗性、纯化柱或细胞分选)完成，所有这些方法都繁琐、耗时、容易丢失材料或产率明显低于100％的纯度。此外，经工程改造以表达多于一种转基因的细胞通常需要连续轮的转染，其中每一轮都需要适当的选择步骤。另外，经工程改造的细胞最通常需要持续的选择压力，以避免转基因表达的丧失。
5.用于细胞工程的dna载体通常包括选择标志物，该选择标志物通常是编码对抗生素(如嘌呤霉素或新霉素)的抗性、对药物(如更昔洛韦)的敏感性、荧光蛋白(如gfp)或小肽序列(如his标签或截短的cd20)的基因，这些小肽序列可通过相应的抗体进行检测或通过亲和层析进行选择。选择标志物在载体内的单独的启动子下表达，或者在荧光蛋白和肽标签的情况下，选择标志物通常表达为与感兴趣的转基因蛋白的融合物。
6.在简单的真核生物(如酵母)的特定情况下，该选择标志物可以是编码酶的基因，该酶允许生长培养基中存在的营养物的代谢。这允许在培养物中持续的选择压力，但也需要未转导的细胞是该营养物的营养缺陷型突变体。
7.虽然传统选择方法的缺点在出于研究目的培养的细胞中不一定是关键，但用于治疗用途的转染细胞必须受到严格调控且是稳定的。例如，尽管对细胞有害，且很少产生100％纯的群体，但使用抗生素进行选择是一种广泛使用的方法。此外，通常需要在培养物中持续使用抗生素以防止转基因沉默。此外，如果感兴趣的转基因和抗生素抗性基因处于单独的启动子的控制之下，沉默仍可能发生。对于标记的选择，虽然荧光蛋白允许基于表达强度进行细胞分选，但细胞分选器是昂贵的设备，需要额外的步骤以在分选过程中保持无菌条件，并且治疗量的细胞的选择通常是不切实际的。可能比费用更成问题的是，荧光蛋白标志物不适合在培养物中维持选择压力，并且作为融合蛋白，它们可能会影响感兴趣的转基因蛋白的功能。
8.关于另外的分选技术，暴露在细胞表面的肽标签、或细胞膜蛋白(如截短的cd20)可与荧光染料标记的抗体组合用于细胞分选，或用于使用亲和层析柱或抗体标记的磁珠进行纯化/富集。然而，虽然后一项的技术可以产生高度富集的细胞群体，但细胞回收率通常很低。此外，使用抗体结合蛋白质进行分选可能会具有触发特定信号传导途径的不想要的副作用。并且最后，使用柱或珠的纯化方案不维持培养物中的选择压力，并且通常必须进行多次才能产生合适的纯的群体。
9.因此，仍然需要一种用于产生经工程改造的细胞的克隆群体的方法，该方法易于选择和分离以稳定表达所需的一种或多种转基因。
10.本文中鉴定的所有出版物均通过援引并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指示通过援引并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。


技术实现要素：

11.本发明的主题提供了用于产生来源于单个细胞的经转染的真核细胞的克隆群体的组合物和方法。预期的方法包括用多顺反子核酸载体转染真核细胞的群体，该多顺反子核酸载体包括与启动子可操作地连接的多于一种转基因，其中该多于一种转基因包含选择元件。转染后，选择表达该选择元件的转染细胞以形成推定转染细胞的池。通过克隆稀释来稀释该推定转染细胞的池以形成多个推定转染克隆，这些推定转染克隆在表型、功能和/或基因组上被表征。在特别优选的实施例中，这些真核细胞是nk
‑
92细胞。
12.在典型的实施例中，这些真核细胞是哺乳动物的。在更典型的实施例中，这些真核细胞是人细胞。最典型的是，该克隆群体是由人自然杀伤(nk)细胞、nkt细胞、t细胞或其他免疫细胞的转染和选择产生的。
13.在如本文披露的优选方法中，该多顺反子载体的选择元件是自分泌蛋白、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)或其组合。
14.在大多数实施例中，该推定转染细胞的表征包括至少一种功能表征和至少一种基因组表征。基因组表征包括基因组步移测定和全基因组测序(wgs)。功能表征可以根据细胞类型和选择元件而变化。例如，表达cd16转基因的nk细胞可以使用adcc测定进行功能表征(例如，验证)。另外的功能测定包括天然细胞毒性、靶向细胞毒性、倍增时间和/或该选择元件的分泌。
15.在其他实施例中，用于产生转染的真核细胞的克隆群体的方法还包括分析该多于一种转基因在第一选择的转染细胞组的基因组中的掺入以确定稳定的基因组整合，其中稳定的基因组整合的确认将该第一选择的转染细胞组分类为第二选择的转染细胞组。
16.本文进一步披露了一种用于产生转染的nk
‑
92细胞的克隆群体的方法，该方法包括：用包含阳性选择标志物和至少一种转基因的多顺反子核酸载体转染nk
‑
92细胞，其中该阳性选择标志物是er
‑
il2或er
‑
il15；在不存在il
‑
2或il15的细胞培养基中培养这些转染的nk
‑
92细胞；在不存在il
‑
2或il15的情况下，通过克隆稀释来稀释这些培养的nk
‑
92细胞，以形成多个转染的nk
‑
92克隆；以及表型和基因组筛选该多个转染的nk
‑
92克隆以选择如下克隆，这些克隆(i)表达该至少一种转基因并且(ii)显示该至少一种转基因的单一、非外显
子整合。该表型筛选可以通过流式细胞术和/或elisa进行。该基因组筛选可以通过全基因组测序和/或基因组步移进行。
17.在一个实施例中，该转基因选自由以下组成的组：fc受体、归巢受体、g蛋白偶联受体(gpcr)、趋化因子受体、细胞因子受体、分泌的细胞因子、细胞粘附分子、选择素或整合素、抗原结合蛋白、肿瘤相关抗原及其组合。该fc受体优选为cd16或高亲和力cd16。该趋化因子受体预期为ccr7、cxcr2、或cxcl14的受体，并且该细胞粘附分子选自l
‑
选择素(cd62l)、α4β7整合素、lpam
‑
1和lfa
‑
1。该分泌的细胞因子可以是il
‑
12、tgf
‑
β阱(tgf
‑
beta trap)、tgfβrii分子的细胞外结构域和/或tgf
‑
β受体ii胞外域(tgfβriiecd)的单链二聚体。在一个实施例中，该抗原结合蛋白优选结合肿瘤中选自ctla
‑
4、pd
‑
1、ido
‑
1、cd39或cd73的免疫调节蛋白。在一个实施例中，该抗原结合蛋白特异性结合选自cd19、cd20、gd2、her
‑
2、cd30、egfr、fap、cd33、cd123、pd
‑
l1、igf1r、cspg4或b7
‑
h4的肿瘤相关抗原。在一个实施例中，该抗原结合蛋白包含嵌合抗原受体(car)，诸如cd19
‑
car、pd
‑
l1
‑
car、her2car、bmca
‑
car和/或cd33
‑
car。
18.用于转染nk
‑
92细胞的该核酸载体优选包含启动子。在一个实施例中，该启动子包含至少一个活化t细胞核因子(nfat)结合结构域。产生nk
‑
92克隆群体的方法中的培养和稀释步骤预期在不存在il
‑
2或il
‑
15的情况下进行。
19.在一个实施例中，通过本文披露的方法产生的克隆进一步针对所表达的转基因因子的功能进行表征。该功能表征包含抗体依赖性细胞毒性(adcc)、天然细胞毒性、car介导的细胞毒性、倍增时间和/或il
‑
2或il
‑
15分泌。这些克隆也可以针对未改变的内在的、非转基因相关的功能进行表征。
20.如本文披露的产生nk
‑
92克隆细胞的方法可以进一步包括用至少一种增殖增强因子(如htert、ras、sv40、myc、cdk4或其组合)转染这些真核细胞的群体。
21.在进一步的实施例中，提供了一种治疗有需要的患者中的癌症的方法，该方法包括：向该患者施用转染的nk
‑
92细胞的克隆群体，其中该转染的nk
‑
92细胞的克隆群体通过本文披露的方法产生。
22.根据优选实施例的以下详细描述以及附图(其中相同的附图标记表示相同的组件)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加清楚。
附图说明
23.图1是用于设计、产生和选择/分离nk细胞克隆的示例性方法的流程图。
24.图2是示例性多(四)顺反子载体(基于pneukv1的载体)的一部分的示意图，描绘了编码细胞因子、car(嵌合抗原受体)、cd16和eril
‑
2(具有er保留修饰的il
‑
2的蛋白融合物)中的每一种的dna序列，其中从该载体表达的每种相应蛋白质也被描绘为经标记的。
25.图3是在160天期间的nk
‑
92细胞中cd16表达百分比的图，这些nk
‑
92细胞用双顺反子cd16
‑
eril2 dna构建体电穿孔，自电穿孔之日起在没有il
‑
2的培养物中生长。
26.图4是用于产生和选择/分离t
‑
hank细胞克隆候选物的示例性方法的流程图。
27.图5是示出了在没有外源性il
‑
2的5％hs培养基中培养6周后的hank003细胞中与cd16表面表达对应的百分比和中值荧光强度(mfi)的图。
28.图6说明了在有限稀释后在不存在外源性il
‑
2的情况下分离和培养的nk细胞克隆
(#1、#2、#4、#5和#7)中cd19.car、cd16和cd19car/cd16的表面表达。
29.图7说明了在选择的pd
‑
l1 t
‑
hank克隆中pd
‑
l1.car和cd16的表面表达。
30.图8说明了在选择的her2 t
‑
hank克隆中her2.car和cd16的表面表达。
31.图9说明了在选择的bcma t
‑
hank克隆中bcma.car和cd16的表面表达。
32.图10说明了在选择的cd33 t
‑
hank克隆中cd33.car和cd16的表面表达。
33.图11说明了在选择的pd
‑
l1(tgfβ
‑
阱)t
‑
hank克隆中pd
‑
l1.car和cd16的表面表达。
具体实施方式
34.本发明的主题包括一种克服传统转基因转染和选择方法的缺点的方法。预期的方法使用单一的多顺反子转染载体，该载体包括赋予转染细胞选择性优势的阳性选择标志物。本发明的主题还概述了通过表型表征步骤和基因组表征步骤的组合来选择合适的转基因克隆的方案(图1)。如图1中示意性概述的，本发明披露的方法提供1)容易地选择转染细胞的池，2)任选地验证推定转染细胞的池，3)通过有限稀释将这些推定转染细胞的池减少为克隆，4)使用表型表征、功能表征和基因组表征筛选这些克隆以呈现“最佳的”克隆组(组1)，和5)确认组1克隆中的转基因整合和/或稳定性以呈现“顶优的”克隆组(组2)，其中这些组2克隆、和这些组1克隆的一些或全部代表来源于单个细胞的经所需修饰的细胞的克隆群体。
35.继续参考图1，用于产生和选择具有所需转基因因子/元件的克隆细胞的预期方法包括产生编码待在转染的细胞中表达的所需因子(例如，蛋白质)的核酸多顺反子载体。除了至少一种选择元件(例如基因)之外，载体中编码的转基因元件还可以包括靶向和/或治疗因子。转染的细胞可以是任何真核细胞。通常，细胞是哺乳动物细胞，并且尤其是用合适的多顺反子载体转染的nk细胞，该多顺反子载体编码一种或多种非抗生素选择的自分泌因子或一种或多种自我选择的自分泌因子与其他所需转基因元件的组合。
36.在本发明主题的一般方面，多顺反子载体中编码的选择元件表达阳性或阴性选择标志物，该标志物允许从那些未转染和/或不表达编码的转基因的细胞中选择转染的细胞。因此，选择元件可以编码为该转染的细胞提供分化功能的蛋白质、shrna或mirna。如本文所举例说明的，选择元件可以编码蛋白质，例如，细胞因子il
‑
2或il
‑
15。由于自然杀伤(nk)细胞在没有外源性il
‑
2的情况下通常不会增殖，因此能够表达非分泌的il
‑
2或il
‑
15的nk细胞可以“拯救”自己，而只要未向未转染的nk细胞提供il
‑
2或il
‑
15，该未转染il
‑
2或il
‑
15的nk细胞将无法增殖。
37.对于可选择蛋白质(例如，il
‑
2或il
‑
15)，可替代地或另外地是，选择元件可以编码微小rna(mirna)或短发夹rna(shrna)。在转染细胞中表达的mirna和shrna均可靶向并抑制其互补mrna在细胞中的表达。取决于被沉默的mrna，mrna或shrna的转染和表达可以是阳性或阴性选择。
38.此外，多顺反子载体还可以编码一种或多种转基因因子，这些因子赋予原代细胞增强的增殖潜力(例如，永生化)。因此，表达增殖增强因子的转染细胞的选择基于这些赋予永生性的因子的表达，从而允许转染细胞在培养物中持续生长，而未转染的原代细胞不能被持续培养并且最终会死亡。这些增殖因子的实例包括htert、ras、sv40、myc和cdk4，它们
可以单独或以任何组合表达。
39.将多基因或多顺反子构建体递送到细胞中包括使用电穿孔或任何其他合适的转染方法。如本文所用，术语“转染”是指将核酸(例如，重组核酸)插入细胞中。可以使用允许核酸进入细胞的任何方式进行转染。dna和/或mrna可以被转染进入细胞中。转染可以通过病毒转导、脂质转染或电穿孔进行。优选地，转染的细胞表达由核酸编码的基因产物(即，蛋白质)。
40.如本文所举例说明的，通常待用多顺反子载体转染并相应选择的哺乳动物细胞是人细胞。也如本文所举例说明的，转染的人细胞可用于使用转染的自然杀伤(nk)细胞原代t细胞或其他免疫细胞的免疫疗法。
41.如本文所用，“自然杀伤(nk)细胞”是免疫系统的细胞，其在没有特定抗原刺激的情况下杀伤靶细胞，并且根据主要组织相容性复合物(mhc)类别没有限制。nk细胞的特征在于存在cd56和不存在cd3表面标志物。
42.如本文更详细披露的，虽然可以使用任何合适的nk细胞系，但该nk
‑
92细胞系是适用于转染和免疫疗法的永生化细胞系。因此，术语“nk
‑
92”是指源自gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特圭斯特公司(nantkwest,inc.)所有)的自然杀伤细胞(以下简称“nk
‑
92细胞”)。永生化的nk细胞系最初获自患有非霍奇金淋巴瘤的患者。除非另有说明，否则术语“nk
‑
92”是指原始的nk
‑
92细胞系以及已经修饰(例如，通过引入外源基因)的nk
‑
92细胞系。nk
‑
92细胞及其示例性和非限制性的修饰描述于美国专利号7,618,817；8,034,332；8,313,943；9,181,322；9,150,636；和公开的美国申请号10/008,955中，这些专利均通过援引以其全文并入本文，并且包括野生型nk
‑
92、nk
‑
92
‑
cd16、nk
‑
92
‑
cd16
‑
γ、nk
‑
92
‑
cd16
‑
ζ、nk
‑
92
‑
cd16(f176v)、nk
‑
92mi和nk
‑
92ci。nk
‑
92细胞是本领域普通技术人员已知的，可从南特圭斯特公司容易获得此类细胞。
43.术语“ank”是指源自gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特圭斯特公司所有)的未修饰的自然杀伤细胞(以下简称“ank细胞”)。术语“hank”是指源自gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特圭斯特公司所有)，经修饰以在细胞表面上表达cd16的自然杀伤细胞(以下简称“cd16 nk
‑
92细胞”或“hank细胞”)。在一些实施例中，cd16 nk
‑
92细胞在细胞表面上包含高亲和力cd16受体。术语“tank”是指源自gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特圭斯特公司所有)，经修饰以表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(以下简称“car修饰的nk
‑
92细胞”或“tank细胞”)。术语“t
‑
hank”是指源自gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特圭斯特公司所有)，经修饰以在细胞表面上表达cd 16并表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(以下简称“car
‑
修饰的cd16 nk
‑
92细胞”或“t
‑
hank细胞”)。在一些实施例中，t
‑
hank细胞在细胞表面上表达高亲和力cd16受体。
44.术语“fc受体”是指在某些细胞(例如，自然杀伤细胞)的表面发现的蛋白，其通过与称为fc区的抗体的一部分结合而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的fc区与细胞的fc受体(fcr)的结合经由抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)来刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。fcr根据其识别的抗体类型进行分类。例如，fc
‑
γ受体(fcγr)与igg类抗体结合。fcγriii(也称为cd16)是与igg抗体结合并激活adcc的低亲和力fc受体。fcγriii通常在nk细胞上发现。nk
‑
92细胞不表达fcγriii。fcε受体(fcεr)结合至ige
抗体的fc区域。
45.此外，转染的nk
‑
92细胞还可包括具有被引入启动子的nfat结合结构域(序列)的启动子以表达归巢受体或分泌的分子。经工程改造以在活化t细胞核因子(nfat)转录因子启动子序列的控制下表达荧光素酶报告基因的nk
‑
92细胞已被证明响应于通过nfat途径发出信号的活化受体(如募集cd3ζ或fcεriγ衔接子分子的受体)的刺激来诱导高荧光素酶表达。因此，分泌的分子的这种诱导型表达依赖于被合适靶标激活的细胞，而不依赖于外部诱导分子。
46.如在pct/us 19/44655(其全部内容通过援引并入本文)中披露的，通过nfat转录因子的活化及其核易转位，证实在nk
‑
92细胞中识别易感细胞系的靶标接合。涉及fcεriγ或cd3ζ途径的靶标结合(包括adcc或car介导的靶标识别)足以在nk
‑
92细胞中诱导nfat活化。这是通过插入含有3个nfat响应元件和驱动萤火虫荧光素酶的最小启动子的报告基因盒来证明的。通过将cd19 car mrna电穿孔到该报告细胞系中，通过cd3ζ途径激活nfat，接着与sup
‑
b15(cd19 ，但对非特异性细胞毒性有抵抗力)共同培养，引起荧光素酶表达。
47.如本文所用，术语“细胞毒性的”和“细胞溶解的”当用于描述效应细胞(诸如nk
‑
92细胞)的活性时，旨在同义。通常，细胞毒性活性涉及通过多种生物学、生化或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。细胞溶解更具体地是指效应子裂解靶细胞的质膜从而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀灭。不希望受理论的约束，认为nk
‑
92细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。
48.在一些实施例中，多顺反子载体编码car。如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(car)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。car可以在t细胞或nk细胞中表达以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对目的细胞上发现的抗原具有特异性的scfv。基于scfv结构域的特异性，将表达car的nk
‑
92细胞靶向在细胞表面上表达某些抗原的细胞。可以对scfv结构域进行工程改造以识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。例如，cd19car识别cd19，cd19是某些癌症表达的细胞表面标志物。
49.在另外的实施例中，多顺反子载体编码tgf
‑
β抑制剂。已知肿瘤内的tgf
‑
β表达会抑制肿瘤微环境中白细胞的抗肿瘤活性。因此，在一些实施例中，多顺反子载体包括重组核酸构建体，该重组核酸构建体编码tgf
‑
β抑制剂，例如抑制tgf
‑
β的肽。在一些实施例中，核酸构建体编码tgf
‑
β阱。在一些实施例中，tgf
‑
β阱包括tgfβrii分子的细胞外结构域。在一些实施例中，tgf
‑
β阱包括tgfβrii分子的细胞外结构域的单链二聚体，并且最优选地包括tgf
‑
β受体ii胞外域的单链二聚体。
50.在其他实施例中，多顺反子载体编码抗原结合蛋白(“abp”)。在一些实施例中，抗原结合蛋白特异性结合肿瘤相关抗原。在一些实施例中，abp包括抗体的片段，诸如scfv。在一些实施例中，抗原结合蛋白包括嵌合抗原受体(car)或是嵌合抗原受体(car)的一部分，嵌合抗原受体(car)可以是第一代car、第二代car或第三代car。在一些实施例中，核酸编码特异性结合以下物质的abp或car：cd19、cd20、nkg2d配体、cs1、gd2、cd138、epcam、her
‑
2、ebna3c、gpa7、cd244、ca
‑
125、muc
‑
1、eta、mage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c
‑
met、egfr、fap、wt
‑
1、psma、ny
‑
eso1、cspg
‑
4、igf1
‑
r、flt
‑
3、cd276、cd123、pd
‑
l1、bcma、cd33、b7
‑
h4或41bb。
51.另外地或可替代地，多顺反子载体编码结合肿瘤中免疫调节蛋白的抗原结合蛋
白。在肿瘤中发现的免疫调节蛋白的实例包括ctla
‑
4、pd
‑
1、ido
‑
1、cd39和cd73。
52.如本文所用的术语“肿瘤特异性抗原”或“肿瘤相关抗原”是指存在于癌细胞或赘生性细胞上但不能在来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞上检测到的抗原。如本文所用，肿瘤特异性抗原还指肿瘤相关抗原，即与来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞相比，在癌细胞上以更高水平表达的抗原。
53.术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后进行核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施例既涵盖双链形式，也涵盖已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。
54.多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(a)；胞嘧啶(c)；鸟嘌呤(g)；胸腺嘧啶(t)；当多核苷酸为rna时，为胸腺嘧啶的尿嘧啶(u)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。
55.在将多顺反子核酸载体转染到所需的真核细胞中之后，选择转染的细胞或进行至少一次细胞培养传代以允许转染的细胞自我选择，从而产生稳定的至少推定地(即，未确认的、未验证的)转染的细胞的池。
56.在一些实施例中，稳定的推定转染细胞的池可以通过有限稀释来稀释以分离单细胞克隆。然而，在其他实施例中，稳定的显著转染细胞的池在有限稀释之前被验证。为了验证推定转染细胞的池，测定细胞池的至少一种转基因的表达。通常，针对选择元件选择/测定细胞池，并且因此，合适的验证测定包括针对多顺反子载体中的其他元件之一的测定。
57.为了获得转染细胞的单克隆群体，稳定的推定转染细胞的池(进行或没有进行转基因验证)被稀释。通过这种稀释克隆(即，通过有限稀释进行克隆)，所选择的克隆通过表达分析被筛选。因此，测定从稀释的细胞中分离的克隆的多顺反子载体中至少一种元件的表达。转基因元件的表达可以在表型、功能和/或基因组上被表征。
58.参考图2，在预期方法的一个实例中，用多顺反子(例如，四顺反子)载体转染的nk
‑
92细胞可以编码细胞因子、car、cd16、和eril
‑
2的选择元件。对于用这种四顺反子载体转染的nk
‑
92细胞，可以在克隆稀释后测定cd16(其激活adcc)的百分比表达以及adcc活性(图3至4)。另外的克隆细胞表征包括全基因组测序、基因组步移测定、天然细胞毒性、car介导的细胞毒性、倍增时间(例如，增殖)和il
‑
2分泌。除了测量细胞的倍增时间外，增殖细胞还可以很容易地用cfse(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)染料标记。使用已建立的cfse方法，可以使用流式细胞术对经标记的细胞的增殖进行定量。
59.参考图4，优选地，每个克隆还通过全基因组测序(wgs)在基因组上表征。
60.关于基因组步移(genome walking)或基因组步移测定(genome walker assay)，本领域技术人员已知基因组步移是用于测定已知dna序列区域侧翼的未知基因组区域的
dna序列的方法。本文尤其考虑的一种基因组步移方法如通用基因组步移试剂盒(bd生物科学克罗泰克公司(bd biosciences clontech)，加利福尼亚州，帕洛阿尔托)所述。基因组步移的其他方法也是本领域已知的，例如devon等人,(1995)nucleic acids research[核酸研究]23(9):1644
‑
1645(通过援引并入本文)中概述的方案。在本文披露的方法中考虑了所有已知的基因组步移方法。
[0061]
通过分离的克隆的表征测定以及基因组步移测定，可以选择至少一个并且优选一些“最佳的”(例如，组1)克隆(例如，n＝2
‑
5)。这些组1克隆可用于进一步的治疗性研究和/或施用。然而，在一些实施例中，可以对组1克隆进行另一层选择。组1克隆的这种另外的选择包括通过全基因组测序(wgs)确认转基因的整合，同时考虑插入的序列和位置以及稳定性以呈现“顶优的”组2克隆(例如，n＝2
‑
5)。
[0062]
在图2至6的示例性方法中，所需转基因细胞的选择利用了在维持nk
‑
92细胞活力方面对外源性il
‑
2的需要。具体而言，必须向nk
‑
92细胞培养物的培养基提供外源性il
‑
2，以便存活和增殖。值得注意的是，经过修饰以保留在细胞内的il
‑
2变体(即通过将er保留肽序列添加到il
‑
2蛋白的c末端而靶向内质网)不会被分泌并且仍然可以自分泌方式发出信号。参见konstantinidis等人“targeting il
‑
2to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to nk
‑
92cells[使il
‑
2靶向内质网将自分泌生长刺激限制于nk
‑
92细胞中]”exp hematol.[实验血液学]2005年2月；33(2):159
‑
64。当在生长培养基中没有外源性il
‑
2的情况下培养时，表达eril
‑
2的nk
‑
92细胞比未修饰的nk
‑
92细胞具有选择性优势。此外，只要不存在外源性il
‑
2，eril
‑
2转基因就会确保其自身的稳定表达，因为使转基因沉默的细胞将死于il
‑
2饥饿。
[0063]
eril
‑
2作为选择标志物理想地适合nk
‑
92细胞。可以使用以自分泌方式促进单个nk
‑
92细胞存活和增殖的其他细胞因子(如eril
‑
15)。
[0064]
参考图2，在单个转录启动子下从单个mrna转录物表达多个多肽可以通过以下方式实现：1)在相同mrna上的2个开放阅读框(orf)(例如，图2中的cd16和eril
‑
2)之间引入ires序列，2)在2个orf(例如，图2中的细胞因子和car，以及car orf和cd16 orf)之间的框中添加2a肽序列，或3)两者的组合。ires允许翻译起始独立于科扎克序列，而2a序列导致多肽在没有核糖体去组装和翻译终止的情况下从核糖体中提前释放。当eril
‑
2基因包括在这种多顺反子形式中时，它确保了多顺反子mrna的稳定表达，从而促进了由mrna编码的各种多肽的稳定表达。
[0065]
用编码eril
‑
2和cd16(由ires分隔)或eril
‑
2和cd16以及car(最后2个由2a序列分隔)的dna构建体转染的nk
‑
92细胞在il
‑
2缺陷培养条件下成功扩增，并在培养约3周内自我选择为准纯群体。当这些群体通过有限稀释产生克隆时，单个转基因nk
‑
92细胞在没有il
‑
2的情况下培养3
‑
4周内扩增为克隆群体。在不存在il
‑
2的情况下培养时，克隆保持转基因的表达长达6个月。
[0066]
用dna序列转染的细胞通常会将这些序列整合到它们的基因组中(特别是如果序列在病毒载体中)。整合可以以随机方式发生，这可能导致来自单个基因或多个基因的外显子、内含子或调控序列的破坏。需要表征步骤来鉴定具有有利的整合谱以及适当的转基因表达和表型/功能特征的细胞。用含有eril
‑
2序列的多基因dna构建体电穿孔的nk
‑
92细胞在不存在il
‑
2的情况下培养3周，然后在不存在il
‑
2但存在稀释的条件培养基的情况下从
其自身培养物进行有限稀释克隆工艺。通常每个96孔板有1至20个克隆成功扩增。通过流式细胞术和/或elisa，针对多基因转基因(减去eril
‑
2)的所有组分的表达筛选单个克隆。然后通过基因组步移技术筛选表达合适水平的这些组分的克隆，以确定它们的基因组整合谱(无论是单一整合或多整合、串联重复整合和外显子/内含子/基因间整合)。显示单一、非外显子整合的克隆针对所表达的转基因因子的功能(即针对合适的靶细胞系的car介导的细胞毒性(对于car蛋白的表达)，和/或adcc(对于cd16蛋白的表达))，以及未改变的内在、非转基因的相关功能(即针对已知标准靶细胞系的天然细胞毒性、培养倍增时间和一组表面标志物的表达)进行表征。以上概述的选择工艺通常会产生2
‑
6个具有所需特征的稳定克隆。
[0067]
鉴于本文的披露内容和图1至6，使用阳性、细胞含有的选择标志物(例如，eril
‑
2)消除了通过抗生素或药物进行选择的需要。它优于两者(抗生素或药物)，因为它不通过降解外源性有害化学物质来起作用，因为它不会降低培养物中选择剂的浓度(这会降低选择效率)，并且因为它充当自我选择剂。
[0068]
特别地，本发明人考虑了通过本文方法产生的nk
‑
92细胞克隆用于疫苗的大规模生产和制造。虽然抗生素(如嘌呤霉素或新霉素)和药物(例如更昔洛韦)先前已在本领域中用作转染和增殖细胞系的阳性选择标志物，尤其是在研究实验室规模中，但发现这些具有抗生素或药物的现有技术细胞系不适合大规模生产人疫苗，特别是癌症疫苗。本披露内容的发明人现已发现在nk
‑
92细胞中使用阳性选择标志物(如er
‑
il2或er
‑
il15)消除了通过抗生素或药物进行选择的需要，从而使这些细胞适用于大规模生产人疫苗。
[0069]
具体而言，在受单个启动子控制的含有ires和/或2a序列的多顺反子构建体中使用eril
‑
2基因消除了单独的启动子独立沉默的风险。它还将多顺反子mrna的表达与细胞的存活联系起来，从而在培养物中维持持续的选择压力。
[0070]
图6至11说明了不同t
‑
hank细胞克隆的表面表达。具体地，图6说明了在有限稀释后在不存在外源性il
‑
2的情况下分离和培养的nk细胞克隆(#1、#2、#4、#5和#7)中cd19 car、cd16和cd19car/cd16的表面表达。在这方面，cd19 car是指靶向cd19分子以杀死肿瘤细胞的t
‑
hank细胞克隆。图7说明了在选择的pd
‑
l1 t
‑
hank克隆中pd
‑
l1 car和cd16的表面表达。图8说明了在选择的her2 t
‑
hank克隆中her2 car和cd16的表面表达。图9说明了在选择的bcma t
‑
hank克隆中bcma car和cd16的表面表达。图10说明了在选择的cd33 t
‑
hank克隆中cd33 car和cd16的表面表达。图11说明了在选择的pd
‑
l1(tgfβ
‑
阱)t
‑
hank克隆中pd
‑
l1 car和cd16的表面表达。如所述，cd19 t
‑
hank、pd
‑
l1 t
‑
hank、her2 t
‑
hank、bcma t
‑
hank和cd33t
‑
hank分别是指特异性靶向cd19、pd
‑
l1、her2、bcma和cd33的nk
‑
92细胞。本文披露的方法还可以用于产生cd19、pd
‑
l1、cd33、cd123、her2、egfr、bcma、b7
‑
h4、cd30、igf1r、gp120 t
‑
hank克隆，以及产生4 顺反子t
‑
hank产物。
[0071]
本披露内容中提供的一些实例利用eril
‑
2作为选择标志物。eril
‑
2作为选择标志物理想地适合nk
‑
92细胞。在一些实施例中，考虑以自分泌方式促进单个nk
‑
92细胞存活和增殖的其他细胞因子(如eril
‑
15)作为选择标志物。eril
‑
15选择标志物尤其优选用于其他nk细胞系、原代nk细胞、原代t细胞或其他免疫细胞。
[0072]
本披露内容中所述的克隆选择工艺不限于nk
‑
92细胞或nk细胞，而是可用于各种哺乳动物细胞或非哺乳动物真核细胞(如植物细胞)。这将有利地赋予限于转染的哺乳动物
真核细胞或非哺乳动物真核细胞的选择性生长优势。例如，单独或组合的htert、ras、sv40、myc或cdk4可以赋予原代细胞增强的增殖潜力(即永生性)。这可用于各种真核(哺乳动物或非哺乳动物)细胞。
[0073]
在一个实施例中，本文披露的克隆选择方法可进一步包括其他阴性选择标志物和阳性选择标志物。此外，该方法可应用于使用电穿孔或其他转染方法引入细胞的多基因构建体或多顺反子构建体。
[0074]
应当注意，本方法不限于仅编码多肽的多基因构建体，还可以应用于驱动转染细胞中shrna或mirna的表达。
[0075]
还提供了用如本文所述的经修饰的nk
‑
92细胞治疗患者的方法。在一些实施例中，患者患有癌症或感染性疾病。如上所述，可以进一步修饰nk
‑
92克隆以表达靶向在患者癌细胞表面上表达的抗原的car。在一些实施例中，fc受体(例如cd16)也可以被表达。在一些实施例中，用经修饰的nk
‑
92细胞和抗体治疗患者。
[0076]
此外，经修饰的nk
‑
92细胞克隆可以在施用于个体之前进行辐照。辐照使细胞不能生长和增殖。用于施用的nk
‑
92细胞可以在治疗设施处或在治疗患者之前的其他时间点进行辐照。理想情况下，辐照和输注之间的时间不超过四小时，以保持最佳活性。可替代地，经修饰的nk
‑
92细胞克隆可以通过另一种机制灭活。
[0077]
本文披露的经修饰的nk
‑
92细胞可以以细胞的绝对数量向个体施用，例如，可以向所述个体施用约1000个细胞/注射至多达约100亿个细胞/注射，诸如每次注射约、至少约或至多约1
×
108、1
×
107、5
×
107、1
×
106、5
×
106、1
×
105、5
×
105、1
×
104、5
×
104、1
×
103、5
×
103个(等等)nk
‑
92细胞，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。
[0078]
在其他实施例中，可以以约1000个细胞/注射/m2至多达约100亿个细胞/注射/m2向所述个体施用，诸如每次注射约、至少约或至多约1
×
108个/m2、1
×
107个/m2、5
×
107个/m2、1
×
106个/m2、5
×
106个/m2、1
×
105个/m2、5
×
105个/m2、1
×
104个/m2、5
×
104个/m2、1
×
103个/m2、5
×
103个/m2(等等)nk
‑
92细胞，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。
[0079]
在其他实施例中，经修饰的nk
‑
92细胞克隆可以以细胞的相对数量向此类个体施用，例如，可以向所述个体施用约1000个细胞至多达约100亿个细胞/千克个体，诸如约、至少约或至多约1
×
108、1
×
107、5
×
107、1
×
106、5
×
106、1
×
105、5
×
105、1
×
104、5
×
104、1
×
103、5
×
103个(等等)nk
‑
92细胞/千克个体，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。
[0080]
在其他实施例中，总剂量可以按m2体表面积来计算，包括约1
×
10
11
、1
×
10
10
、1
×
109、1
×
108、1
×
107个/m2，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。人平均为约1.6至约1.8m2。在优选的实施例中，向患者施用约10亿至约30亿的nk
‑
92细胞。在其他实施例中，每次剂量注射的nk
‑
92细胞的量可以按m2体表面积来计算，包括1
×
10
11
、1
×
10
10
、1
×
109、1
×
108、1
×
107个/m2。人平均为1.6
‑
1.8m2。
[0081]
经修饰的nk
‑
92细胞以及任选地其他抗癌剂可以在疗法期间向患有癌症的患者施用一次或其可以施用多次，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更多周一次，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。
[0082]
在一些实施例中，以包含经修饰的nk
‑
92细胞克隆和培养基，诸如人血清或其等效
物的组合物形式施用经修饰的nk
‑
92细胞克隆。在一些实施例中，培养基包含人血清白蛋白。在一些实施例中，培养基包含人血浆。在一些实施例中，培养基包含约1％至约15％的人血清或人血清等效物。在一些实施例中，培养基包含约1％至约10％的人血清或人血清等效物。在一些实施例中，培养基包含约1％至约5％的人血清或人血清等效物。在一个优选的实施例中，培养基包含约2.5％的人血清或人血清等效物。在一些实施例中，血清是人ab血清。在一些实施例中，使用可接受用于人治疗剂的血清替代物代替人血清。此类血清替代物可能是本领域已知的，或者将来会开发。尽管可以使用超过15％的人血清浓度，但是考虑到大于约5％的浓度将是成本高昂的。在一些实施例中，以包含nk
‑
92细胞和支持细胞活力的等渗液体溶液的组合物形式施用nk
‑
92细胞。在一些实施例中，以从冷冻保存的样品重构的组合物形式施用nk
‑
92细胞。
[0083]
药学上可接受的组合物可以包括多种载剂和赋形剂。可以使用各种水性载剂，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不需要的物质。合适的载剂和赋形剂及其配制品描述于remington:the science and practice of pharmacy[雷明顿:药物科学与实践],第21版,david b.troy编辑,lippicott williams&wilkins[利品考特威廉姆斯&威尔金斯公司](2005)中。药学上可接受的载剂意指不是生物学上或其他方面不希望的材料，即，向受试者施用该材料不会引起不希望的生物学效应或以有害的方式与药物组合物中含有的其他组分相互作用。如果向受试者施用，则任选地选择载剂以最小化活性成分的降解和最小化受试者的不良副作用。如本文所用，术语药学上可接受与生理学上可接受以及药理学上可接受同义使用。药物组合物通常包含用于在储存中缓冲和保存的药剂，并且可以根据施用途径而定包括用于适当递送的缓冲剂和载剂。
[0084]
用于体内或体外使用的这些组合物可以通过用于细胞的灭菌技术来灭菌。这些组合物可以含有接近生理条件所需的可接受的辅助物质，诸如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制品和/或其他药剂中的细胞浓度可以变化，并且将根据所选择的特定施用模式和受试者的需要，主要根据流体体积、粘度、体重等进行选择。
[0085]
在一个实施例中，将经修饰的nk
‑
92细胞克隆与用于所治疗癌症的一种或多种其他治疗一起施用至患者。在一些实施例中，用于所治疗癌症的两种或更多种其他治疗包括例如抗体、辐射、化学疗法、干细胞移植或激素疗法。
[0086]
在一个实施例中，将经修饰的nk
‑
92细胞克隆与靶向患病细胞的抗体一起施用。在一个实施例中，经修饰的nk
‑
92细胞克隆和抗体例如在相同的配制品中，一起施用至患者；例如在单独的配制品中，同时单独地施用于受试者；或者可以例如以不同的给药时间表或在一天中的不同时间单独地施用。当单独施用时，抗体可以任何合适的途径施用，诸如静脉内或口服施用。
[0087]
以下讨论提供了本发明主题的许多示例性实施例。尽管每个实施例代表发明要素的单个组合，但是本发明的主题被认为包括所披露的要素中的所有可能的组合。因此，如果一个实施例包含要素a、b和c，并且第二实施例包含要素b和d，则本发明的主题还被认为包括a、b、c或d的其他剩余组合，即使不是明确披露。
[0088]
在一些实施例中，用于描述和要求保护本发明某些实施例的表达成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实
施例中，书面说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例试图获得的所需特性而变化。在一些实施例中，数值参数应当按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术来解释。虽然阐述本发明一些实施例的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可行地精确地报告。在本发明的一些实施例中呈现的数值可以含有必然由其各自测试测量中所发现的标准偏差引起的某些误差。
[0089]
除非上下文指明相反，否则本文阐述的所有范围应当被解释为包括其端点，并且开放式范围应当被解释为仅包括商业实用值。类似地，除非上下文指明相反，否则应将所有值的列表视为包含中间值。
[0090]
如本文的说明书和随后的整个权利要求中所使用，“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该/这些(the)”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如本文的说明书中所使用，“在
……
中(in)”的含义包括“在
……
中(in)”和“在
……
上(on)”，除非上下文另有明确说明。
[0091]
本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另外指示，否则具有一定范围的每个单独的值被并入本说明书中，如同其在本文中单独陈述一样。除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。关于本文某些实施例提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对原本要求保护的本发明范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。
[0092]
本文披露的本发明的可替代的要素或实施例的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独或以与组中其他成员或本文发现的其他要素的任何组合被提及和要求保护。出于方便和/或专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从组中删除。当发生任何这种包括或删除时，在本文中认为本说明书含有经修改从而满足所附权利要求中使用的所有马库什群组(markush group)的书面描述的组。
[0093]
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了在所附权利要求的精神中之外，本发明主题不受限制。此外，在解释本说明书和权利要求时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含/包括”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在本说明书的权利要求提及选自由a、b、c...和n组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要该组中的一种要素，而不是a加n或b加n等。