用于扩增或检测新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸的引物组及其应用的制作方法

用于扩增或检测新型冠状病毒sars
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cov
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2核酸的引物组及其应用
技术领域
1.本技术涉及核酸扩增技术领域，尤其涉及用于扩增或检测新型冠状病毒sars
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cov
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2核酸的引物组及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒属于巢状病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)，具有目前发现的一类最大的rna病毒的特点，其基因组包含16个非结构蛋白基因(nsps)和4个结构蛋白基因(s，m，e和n蛋白)。通常采用荧光定量pcr法扩增其n基因和orf1ab基因。
3.但是，由于荧光定量pcr法的检测需要技术娴熟的技术人员、精确的检测仪器和昂贵紧缺的试剂作为条件，不能实现对其核酸进行快速扩增和分析。
4.环介导恒温扩增技术(loop
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mediated isothermal amplification,lamp)是2000年由日本学者notomi开发的一门新兴的基因扩增技术，具有特异性强、灵敏性高、等温高效、操作简便、成本低廉等优点。但由于lamp扩增是链置换合成，靶序列长度在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链dna的扩增。由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果，因此特别注意严谨操作，来防范非特异性扩增与污染。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术的目的在于仍然使用lamp
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pcr技术，提供一种能够扩增长度大于500bp(如新型冠状病毒n基因cdna序列长度大于500bp)的靶序列，且能够减少非特异性扩增与污染的问题。为此，本技术提供以下技术方案，能够在一定程度上解决这些问题中至少一个。
6.本技术实施例第一方面提供一种用于扩增或检测新型冠状病毒sars
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cov
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2核酸的引物组，包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；
7.所述第一引物对包括如seq id no.31和seq id no.32所示的核苷酸序列及如seq id no.31～32所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的如seq id no.31～32所示的核苷酸序列功能相同或相似的核酸序列；
8.所述第二引物对包括如seq id no.33和seq id no.34所示的核苷酸序列及如seq id no.33～34所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的如seq id no.33～34所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
9.所述第三引物对包括如seq id no.35和seq id no.36所示的核苷酸序列及如seq id no.35～36所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的如seq id no.35～36所示的核苷酸序列功能相同或相似的核酸序列。
10.在本技术实施例中，所述新型冠状病毒n基因的反转录cdna序列如seq id no.37所示，所述引物组靶向如seq id no.37所示序列的12～213nt区。
11.本技术实施例第二方面还提供用于扩增或检测新型冠状病毒sars
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cov
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2核酸的反应体系，包括所述引物组。
12.在本技术实施例中，所述的反应体系还包括bst dna聚合酶、dntps、耐高温转录酶、海藻糖、(nh)4so4、可视化荧光染料、牛磺酸、tris
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hcl、trionx
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100和含mg
2
的反应缓冲液中的至少一种。
13.在本技术实施例中，所述反应体系还包括阳性模板，所述阳性模板为具有如seq id no.37所示核苷酸序列的dna分子，或者由如seq id no.37所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的与seq id no.37所示核苷酸序列功能相同或相似的dna分子。
14.在本技术实施例中，所述反应体系的反应温度为55～62℃。
15.本技术实施例第三方面还提供了用于扩增或检测新型冠状病毒sars
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cov
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2核酸的试剂盒，包括第一方面所述的引物组以及用于病毒检测的可接受的助剂。
16.本技术实施例第四方面还提供所述引物组或者所述反应体系在制备用于检测新型冠状病毒的试剂和/或试剂盒中的用途。
17.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：
18.本技术提供这些引物组，针对新型冠状病毒n基因进行设计，并将该基因cdna的双链分为六个特异性区间，以便这些引物在扩增过程中形成两个环状结构，实现等温扩增，不仅能够有效扩增，而且其引物的特异性强、灵敏度高。
19.本技术还提供的一种检测新型冠状病毒的lamp试剂盒将上述引物组合与lamp技术结合，不但可以通过肉眼观察到检测结果，无需复杂的辅助设备，简单易用，而且可通过荧光染料法实现检测结果半定量，检测灵敏度高，为该新型冠状病毒相关疾病的诊断以及治疗药物的研究提供了便利而快速的手段。
附图说明
20.图1为本技术实施例提供的引物组在sars
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2 n基因序列上的为靶向区间示意图。
21.图2为本技术实施例提供的以不同标准品为模板采取不同ps1(图2a)、ps2(图2b)、ps3(图2c)引物组在不同温度下扩增后的dna产物电泳图以及扩增曲线。
22.图3为本技术实施例提供的以不同标准品为模板采取不同ps4(图3d)、ps5(图3e)、ps6(图3f)引物组在不同温度下扩增后的dna产物电泳图以及扩增曲线。
23.图4为本技术实施例提供的ps6引物组在不同扩增时间下对不同浓度模板的dna产物电泳图以及扩增曲线；以不同拷贝数浓度(10、103、105、107copies/μl)的标准品为模板，在恒温58℃分别进行不同时间(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45min)扩增。
24.图5为本技术实施例提供的ps6引物组对不同来源模板的dna产物电泳图以及扩增曲线，恒温58℃扩增40min。
具体实施方式
25.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于
限定本技术。
26.下方若无特别说明，本技术实施例采用的试剂和设备均为常规实验所用，不对本技术的实验效果产生限制。
27.引物组设计
28.以sars
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cov
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2 n基因作为靶向基因设计引物组，n基因nc_045512.2，gene id:43740575，1260bp ss
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rna，如seq id no.37所示，所述引物组靶向如seq id no.37所示序列的12～213nt区、441～635nt区、81～296nt区或429～641nt区，对应设计的引物组如表1所示，共设计了ps1
‑
ps6，6组引物。其中，f3/b3作为第一引物对，fip/bip作为第二引物对，lf/lb作为第三引物对。
29.表1
30.[0031][0032]
上述引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，用无菌无rna酶去离子水将所有引物dna干粉溶解为100μm浓度母液，然后取20μl母液加纯水80μl稀释成20μm的使用浓度。
[0033]
由此，应用第一引物对、第二引物对和第三引物对，能够提升扩增的效率和灵敏度，具体通过如下实施例验证。
[0034]
引物组扩增效果
[0035]
应用上述引物组，分别与文献提供的引物组对新型冠状病毒的核酸进行扩增和检测。
[0036]
利用上述本技术提供引物组进行比较，分别用depc
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h20配置成100μm的引物溶液，使用如表2所示反应体系对sars
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cov
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2 n基因质粒(南京金斯瑞公司)进行扩增，依次形成实施例1
‑
6。
[0037]
表2
[0038][0039][0040]
表2中，模板的制备方法为：经测定，携带sars
‑
cov
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2 n基因的质粒pcdna3.1
‑
n
‑
ha质量浓度为809ng/μl，质粒的总碱基数目为6000bp，其相对分子质量为计算为6000
×
660＝3.96
×
106。根据公式：[质粒拷贝数＝(质粒质量浓度
÷
分子量)
×
6.02
×
10
23
]，对原始质粒溶液使用ddh2o进行稀释，得到1
×
108拷贝数/μl、1
×
107拷贝数/μl、1
×
106拷贝数/μl、1
×
105拷贝数/μl、1
×
104拷贝数/μl、1
×
103拷贝数/μl、1
×
102拷贝数/μl和10拷贝数/μl的模板溶液。
[0041]
结果显示，实施例1未扩增出片段(图2a)；实施例2(图2b)、实施例3(图2c)、实施例4(图3d)和实施例5(图3e)均可在55℃，58℃和60℃可扩增出特异性片段，但未扩增出低拷贝数的模板，灵敏度不高。而实施例6在55℃，58℃和60℃可灵敏地扩增出片段，其在58℃时的反应灵敏度和特异性均达到最优(图3f)。
[0042]
ps6的反应时间和特异性的确定
[0043]
进一步的实施例中，以此58℃温度为恒温反应条件，检测ps6引物组在不同拷贝数浓度的反应时间，结果如图4所示，反应时间最快20min出现产物，25min已达最佳，35
‑
45min保持稳定。因此，该lamp反应体系灵敏度高，且快速稳定。
[0044]
进一步的实施例中，通过对不同来源的dna模板，包括腺病毒3型(简称为adv
‑
3，来自暨南大学广东省病毒学重点实验室)、普通流感病毒(h3n2
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cdna，来自暨南大学广东省病毒学重点实验室)、肺炎链球菌(strephtococcus pneumonia，购自中国典型培养物保藏中心)和金黄色普通球菌(straphylococcus aureus，购自中国典型培养物保藏中心)，sars
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cov
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2 n基因作为阳性对照，进行lamp法恒温扩增，结果如图5所示，仅sars
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cov
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2 n基因可扩增特异性条带，而其他常见的呼吸道病原体dna未扩增出条带。因此，该lamp反应体系检测特异性高，无交叉反应。
[0045]
核酸检测试剂盒
[0046]
本实施例利用上方的ps1
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ps6引物组试剂，配制新型冠状病毒sars
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cov
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2核酸的检测试剂盒，并利用该试剂盒对4000copies/ml的新冠患者咽拭子cdna(每个反应加5μl)进行lmap检测，同时以20copies标准品及空白水作为参照，采用多功能酶标仪于650nm波长处检测产物的吸光值od650。其lamp扩增反应体系如表3所示。
[0047]
表3反应体系
[0048][0049]
采用上述反应体系对8个咽拭子样品、1个nc样品及1个标准品(阳性对照)进行检测，结果如表4所示。
[0050]
由表4可知，对比例2
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5和实施例1均能实现对样品的正确检测，实施例1实验的ps6引物组扩增时间均早于对比例2
‑
5，扩增效率由于对比例2
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5。由此表明，本技术实施例提供的试剂盒能够仅需20min即可实现检测含20copies sars
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cov
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2的咽拭子样品，检测灵敏度
和效率高。
[0051]
表4 od650
[0052][0053]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。