一种杜梨花药愈伤的诱导及遗传转化方法与流程

技术特征：
1.一种杜梨花药愈伤的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)杜梨花蕾采回后，4℃预处理3
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7天；(2)对预处理后的花蕾进行消毒处理；(3)将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养20
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60天，获得花药愈伤组织；所述诱导培养基为：nn69 15
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30g/l蔗糖 1.0
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3.0mg/l 2,4
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d 0.5
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1.5mg/l 6
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ba 6
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10g/l琼脂；(4)将诱导出的花药愈伤组织接到增殖培养基中进行增殖培养，获得胚性愈伤组织；所述增殖培养基为：1/2ms 15
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30g/l蔗糖 1.0
‑
3.0mg/l 2,4
‑
d 0.5
‑
1.5mg/l 6
‑
ba 6g/l琼脂。2.根据权利要求1所述的一种杜梨花药愈伤的诱导及遗传转化方法，其特征在于，所述消毒处理为：将步骤(1)中的花蕾使用质量分数75％的酒精洗涤2
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3次，去除表面灰尘和部分微生物；然后再使用质量分数0.1％hgcl2及质量分数30％naclo再次进行消毒，无菌水清洗后利用无菌滤纸吸干花蕾表面水分，备用。3.根据权利要求1所述的一种杜梨花药愈伤的诱导及遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中暗培养温度为25
±
2℃。4.根据权利要求1所述的一种杜梨花药愈伤的诱导及遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)中增殖培养培养温度为25
±
2℃，保证黑暗环境，每20
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30天进行一次继代。5.一种杜梨花药愈伤的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用携带外源基因的根癌农杆菌转化权利要求1
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4任意一项方法获得的胚性愈伤组织，随后接种到共培养培养基中暗培养2
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4天；共培养培养基为：1/2ms 15
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30g/l蔗糖 1.0
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3.0mg/l 2,4
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d 0.5
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1.5mg/l 6
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ba 6g/l琼脂；(2)共培养结束后使用脱菌液洗涤2
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3次，无菌水洗涤3
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5次，在无菌滤纸上吸干水分后转移到筛选培养基中筛选；所述脱菌液为：1/2ms 15
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30g/l蔗糖 300
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500mg/l头孢霉素cef 100
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300mg/l羧苄青霉素carb。6.根据权利要求5所述的一种杜梨花药愈伤的遗传转化方法，其特征在于，转化条件为：使用携带外源基因的根癌农杆菌的重悬液浸泡胚性愈伤组织；浸泡侵染时间5
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15min，重悬液中乙酰丁香酮as工作浓度100
‑
300μmol/l。7.根据权利要求5所述的一种杜梨花药愈伤的遗传转化方法，其特征在于，共培养温度为25
±
2℃。8.根据权利要求5所述的一种杜梨花药愈伤的遗传转化方法，其特征在于，筛选培养基为：1/2ms 15
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30g/l蔗糖 1.0
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3.0mg/l 2,4
‑
d 0.5
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1.5mg/l 6
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ba 300
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500mg/l头孢霉素cef 50
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100mg/l卡那霉素 6
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10g/l琼脂。

技术总结
本发明公开了一种杜梨花药愈伤的诱导及遗传转化方法，属于植物组织培养技术领域，杜梨花药愈伤的诱导方法包括如下步骤：(1)杜梨花蕾采回后，4℃预处理3


技术研发人员：马辉 梁晔 许建锋 王鹏飞 张辽 张海霞 李涛 王瑞 李宇航 马浩川 张玉星
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2021.10.11
技术公布日：2021/12/7