靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法与流程

技术特征：
1.一组靶向小鼠cd274基因的grna，其特征在于，包括四条grna，其核酸序列分别为：grna1=seq id no 1=5
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gtatggcagcaacgtcacgatgg-3’；grna2=seq id no 2=5
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tgctgcataatcagctacggtgg-3’；grna3=seq id no 3=5
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tgcttgcgttagtggtgtactgg-3’；grna4=seq id no 4=5
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gacgtcaagctgcaggacgcagg-3’。2.一种小鼠cd274基因的基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1中的一组靶向小鼠cd274基因的grna。3.使用如权利要求1所述的一组靶向小鼠cd274基因的grna构建eae疾病小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括利用grna1、grna2、grna3、grna4将小鼠cd274基因敲除。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述grna1、grna2、grna3、grna4靶向切割小鼠cd274基因的第3个外显子的5＇端和3＇端的两侧。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述grna1、grna2、grna3将cd274基因第3个外显子之间的246bp的dna切除，切除后的基因在转录形成的mrna第2个外显子与第4个外显子剪切时融合，翻译蛋白质时形成移码突变。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）通过针对cd274基因设计、构建两对grna质粒，体外转录为rna后，与cas9 mrna一起原核显微注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为f0小鼠；提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物送测序，获得测序鉴定阳性的f0代阳性小鼠；2）f0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，获得pcr鉴定阳性的f1代杂合子小鼠；3）选择来自同一只f0代小鼠，基因型一致的f1代小鼠，达到性成熟后互配，获得f2代小鼠，对获得的f2代小鼠进行pcr及测序鉴定。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的测序引物为：pcr测序引物=seq id no 5= 5
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attatctagcttgcatcaccaccac-3’。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中pcr鉴定中的引物包括：f1=seq id no 6=5'-attatctagcttgcatcaccaccac-3'；r1=seq id no 7=5'-gaagtgtgtgaacgaacgaatgaac-3'。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中pcr鉴定中的阳性扩增产物长度为437 bp，阴性扩增产物长度为679 bp。10.如权利要求3-9任一项所述的方法构建获得的eae疾病模型小鼠。

技术总结
本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠CD274基因的gRNA及构建EAE疾病小鼠模型的方法；本发明设计了特异性靶向CD274基因的gRNA，利用Cas9将CD274基因的第3个外显子敲除，造成移码突变，从而达到将该基因敲除的目的。该方法简单易行，周期短，在小鼠受精卵内就可实施，获得阳性克隆的几率很高。由该方法获得的CD274基因敲除小鼠是作为研究EAE疾病的最佳模型，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并进一步开发针对该疾病的治疗方式。方式。方式。


技术研发人员：李雪 白颖 孔珊珊
受保护的技术使用者：赛业（苏州）生物科技有限公司
技术研发日：2021.09.22
技术公布日：2022/1/14