一种蠋蝽病毒特异性CP检测引物及PCR检测方法与流程

技术特征：
1.一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、蠋蝽总rna的提取，依次进行研磨、提取和提纯；s2、蠋蝽cdna的制备；s3、检验acv-1的特异性引物的合成；s4、pcr扩增反应、pcr扩增程序与pcr产物的鉴定；s5、对检验结果进行复检。2.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据s1中的操作步骤，蠋蝽样本研磨后，取0.1 g于1.5 ml 无菌无酶离心管中，加入trizol
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reagent混匀，室温静置5 min，加入200
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l三氯甲烷，上下剧烈震荡25-30 s，室温静置3min后，4℃ 12000 rpm，离心15 min，离心完毕后，吸取400
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l上清于新的1.5 ml无菌无酶离心管中，加入500
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l异丙醇，混匀，室温静置10 min后，4℃ 12000 rpm，离心10 min，弃上清，加入1 ml 75%乙醇，吹打沉淀使其悬浮，洗涤结束后，4℃ 7500 rpm，离心5 min，弃上清，4℃ 7500 rpm，离心1 min，将剩余上清吸净，晾干。3.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据s1中的操作步骤，用50-100
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l depc水溶解rna，检测rna浓度和纯度后，置于-80℃ 冰箱中保存备用。4.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据s2中的操作步骤，参照transscript
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one-step gdna removal and cdna synthesis supermix（transgen, beijing, china）试剂盒合成acv-1基因组的第一链cdna，反转录体系：total rna 2
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l、oligo(dt) 1
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l、rnase-free water 5
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l混匀65℃ 孵育5 min，冰浴2 min后，再向体系内加入2
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ts reaction mix 10
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l、transscript
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rt/ri enzyme mix 1
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l、gdna remover 1
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l，反应条件为42℃ 30 min、85℃ 5 s，得到的cdna储存于-20℃。5.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据31中的操作步骤，acv-1f：cacaggggattttactgaagc。6.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据s3中的操作步骤，acv-1r: cgtcgggtgtacctgtagaaa。7.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据s4中的操作步骤，反应体系为20
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l，其中2
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easytaq
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pcr super mix（transgen, beijing, china） 10
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l、forward primer 0.5
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l、reverse primer 0.5
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l、ddh2o 8
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l、cdna 1
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l。8.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据s4中的操作步骤，94℃ 预变性5 min；94℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 30 sec，35个循环。9.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据s4中的操作步骤，取5
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l pcr产物用含有核酸染料的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。10.根据权利要求1所述的一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：根据s5中的操作步骤，分别使用特异性引物acv-1f/r及蠋蝽actin引物
检测携带/不携带acv-1蠋蝽样本，用蠋蝽actin引物检测样本以确保蠋蝽cdna样本可用性，ac-actin引物检测样本及阳性对照均有条带且阴性对照无条带，说明检测样本cdna均可用；acv-1f/r检测结果中阳性对照有条带，阴性对照无条带，说明检测结果可信，对照（即不携带acv-1）蠋蝽样本无扩增产物，yc1-yc13为携带acv-1蠋蝽样本均扩增出了725 bp的目的条带，判定所设计的acv-1f/r引物特异性强。

技术总结
本发明公开了一种蠋蝽病毒特异性CP检测引物及PCR检测方法，属于基因检测技术领域，该蠋蝽病毒特异性CP检测引物及PCR检测方法，包括以下步骤：步骤一、蠋蝽总RNA的提取，依次进行研磨、提取和提纯，步骤二、蠋蝽cDNA的制备，步骤三、检验AcV-1的特异性引物的合成，步骤四、PCR扩增反应、PCR扩增程序与PCR产物的鉴定，步骤五、对检验结果进行复检。不仅可对蠋蝽单头成虫、5龄若虫和4龄若虫进行检测，也可检测单头3龄若虫、2龄若虫、初孵若虫及卵块，操作简便快捷，本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效，一般整个过程可在2个小时内完成，特异性强，本发明设计的特异性引物只对AcV-1具有扩增能力。具有扩增能力。具有扩增能力。


技术研发人员：孙梅雪 徐蓬军 任广伟 王秀芳 王新伟
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）
技术研发日：2021.10.26
技术公布日：2022/2/6