一种叶斑菌病原菌LAMP检测引物、试剂盒及LAMP快速检测方法

技术特征：
1.一种叶斑病病原菌的lamp检测引物，其特征在于：所述引物包括正向外引物f3、反向外引物b3、正向内引物fip和反向内引物bip，所述引物系列如下：f3：5
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accagtgcggtggtatcg-3’；b3：5
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caagagcgcctgtcactc-3’；fip：5
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ggatcgatgggaagaagggcgcaagcgaaccatcgagaagt-3’；bip：5
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catacgacgactcgacaagcgcccaccacccaaaaaaacgac-3’。2.一种叶斑病病原菌的lamp检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的叶斑病病原菌的lamp检测试剂盒，其特征在于：试剂盒还包括dntps、bst dna聚合酶、10
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isothermal amplificationbuffer和mgso4。4.一种包含权利要求1所述引物的叶斑病病原菌的lamp检测反应体系，其特征在于：反应体系包括：10um的fip和bip引物各4μl，10um f3和b3引物各0.5μl，10mm dntps 2.5μl，8u/μl bst dna聚合酶1μl，50mm mgso44μl，10
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isothermal amplificationbuffer 2.5μl，用灭菌超纯水补平至25μl。5.一种基于权利要求4所述反应体系的叶斑病病原菌的lamp检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：获取叶斑病病原菌的ef-1α基因保守区利用primer explore v5在线设计引物；s2：制备25μl的权利要求4中的检测反应体系；s3：将待测样品总dna于s2所述的检测反应体系中进行lamp扩增，反应结束后，取反应产物；s4：将反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测；或/和用sybr greeni染料观察lamp反应液变化；s5：lamp反应产物在琼脂糖凝胶电泳出现连续呈弥散状条带为阳性，存在叶斑菌病原菌；和/或反应液呈现翠绿色为阳性，存在叶斑病病原菌，淡橙色为阴性，不存在叶斑病病原菌。6.根据权利要求5所述的lamp检测方法，其特征在于，所述反应体系中的反应条件为：温度为60℃、反应时间为60min。7.根据权利要求5所述的lamp检测方法，其特征在于，所述s1中获取叶斑病病原菌的操作步骤如下：步骤一：剪取罹病叶片病健交界部分的组织进行消毒，再用无菌水漂洗，用无菌滤纸吸干水分后将其放置于含有链霉素的pda平板上，26℃黑暗培养；步骤二：将长出的菌落转接至pda培养基，通过单孢分离进行纯化后用pda斜面保存于4℃备用，得到分离纯化的菌株。8.根据权利要求7所述的lamp检测方法，其特征在于，还包括对叶斑病病原菌的鉴定，包括以下步骤：sa：将分离纯化的菌株接种于pda培养基中培养出菌丝，然后提取真菌dna；sb：通过引物its4/its5和ef1-728f/ef1-986r扩增核糖体转录间区和翻译延长因子基因部分序列；sc：构建pcr反应体系，该pcr反应体系为2
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es taq master mix25μl、总dna模板2μl、
10μm上下游引物各2μl、ddh2o 19μl，扩展反应取反应产物；sd：反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，进行序列测定，获序列在ncbi数据库进行blastn比对分析，利用mega6软件中邻接法构建系统发育树。9.根据权利要求8所述的lamp检测方法，其特征在于，pcr反应条件94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。10.根据权利要求2所述的试剂盒在植物叶斑菌病原菌鉴定中的应用，所述植物为黄花菜。

技术总结
本发明提供一种叶斑病病原菌的LAMP检测引物，涉及植物病原菌检测的技术领域，所述引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP，所述引物系列如下：F3：5


技术研发人员：朱俊子 钟杰 李晓刚 马雅敏
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2022/5/16