一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法及其应用

技术特征：
1.一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，以艰难梭菌体内的pfor酶为靶点，通过测试fmt供体提供的粪菌液对pfor酶的抑制率，筛选预测和/或评价fmt对于艰难梭菌感染的治疗效果。2.根据权利要求1所述的一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）培养带有pfor酶质粒的大肠杆菌；（2）诱导带有pfor酶质粒的大肠杆菌产生pfor酶；（3）提取大肠杆菌产生pfor酶；（4）制备fmt供者所提供的粪菌液；（5）配制pfor酶的反应体系，通过体外实验，检测fmt供者所提供的粪菌液在pfor酶的反应体系中，对pfor酶的抑制情况；（6）根据fmt供体提供的粪菌液对pfor酶的抑制率，判断感染症状缓解的指标判断fmt供体对艰难梭菌的抑制作用。3.根据权利要求1或2所述的一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中，培养带有pfor酶质粒的大肠杆菌的具体如下：（1.1）制备lb培养基，具体包括液体培养基和固定培养基：（1.1.1）液体培养基的配制：将5glb肉汤粉末溶于500ml蒸馏水，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压灭菌15min，培养瓶内液体体积不超过瓶本身量程的1/3，待其冷却后加入氨苄青霉素，使其终浓度为100μg/ml，混匀即可；（1.2.1）固体培养基的配制：将3.5glb琼脂粉末溶于100ml蒸馏水，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压灭菌15min，65℃左右将培养基从高温灭菌锅中取出，在固体培养基凝固之前加入终浓度为100μg/ml氨苄青霉素后混匀，然后将培养基倒入培养皿中，静置待其冷却凝固；（1.2）选取带有pfor酶质粒的大肠杆菌进行平板接种：挑取单菌落，在已加入氨苄青霉素的固体培养基中进行平板划线，置于细菌培养箱中，37℃，培养12小时左右；（1.3）培养约12小时后，在已经生长细菌得到平板上挑取单菌落到含有50ml已加入氨苄青霉素的液体培养基的离心管中，放在震荡培养箱中，37℃，220rpm,约200min，震荡约200分钟后，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷进行诱导，（iptg终浓度为0.5mmol/ml），置于震荡培养箱中，25℃，220rpm，20h。4.根据权利要求1或2所述的一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）中，诱导带有pfor酶质粒的大肠杆菌产生pfor酶的具体过程为：使用100μg/ml浓度氨苄青霉素诱导大肠杆菌质粒表达，使用终浓度为0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导pfor酶的产生。5.根据权利要求1或2所述的一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（3）中，提取大肠杆菌产生pfor酶的具体过程为：取50ml诱导菌液，12000g，4℃，5min，离心去上清；纯水等体积重悬，再次离心去上清；然后10ml纯水重悬，10ml菌液冰上400w超声5s，间隔5s，大约持续10min，所获得的溶液即含有pfor的粗酶液。6.根据权利要求1或2所述的一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（4）中，制备fmt供者所提供的粪菌液的具体过程为，挑选健康状况、饮食习惯
良好的fmt供者既往提供的粪便，将其均质，在最终浓度为50mg粪便/ml的无菌盐水中稀释，收集的样本以100g离心2分钟，收集上清液并通过70μm和0.22μm滤膜，收集上清。7.根据权利要求1或2所述的一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（5）中，pfor酶的反应体系具体为，100mm磷酸钾缓冲液（ph=7.4）、10mm丙酮酸钠、5mm1,1'-二苄基-4,4'-联吡啶鎓盐二氯化物水合物(ε=9.2mm-1，cm-1at546nm)、0.18mm辅酶a、1mmmgcl2。8.根据权利要求1或2所述的一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（5）中，通过体外实验检测fmt供者所提供的粪菌液对pfor酶抑制情况的具体过程为：在pfor酶的反应体系中加入50μl粗酶液和10μl粪无菌液，定容至200μl。9.根据权利要求1或2所述的一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，其特征在于，所述步骤（6）中，所述判断感染症状缓解的指标为腹泻缓解次数、血液白细胞减少数目和白介素6下降数目。10.一种fmt供体筛选的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为能够营造无氧环境的anaeropack培养盒，其内包含pfor酶反应体系作为检测试剂，所述检测试剂采用权利要求1~9所述基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法对fmt供体的粪便菌液进行检测。

技术总结
本发明公开了一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法，以艰难梭菌体内的PFOR酶为靶点，通过测试FMT供体提供的粪菌液对PFOR酶的抑制率，筛选预测和/或评价FMT对于艰难梭菌感染的治疗效果。本发明以艰难梭菌内的PFOR酶为靶点，通过培养带有PFOR酶质粒的大肠杆菌，并诱导其在IPTG的作用下产生PFOR酶，通过体外实验检测FMT供者所提供的粪菌液对PFOR酶的抑制率，即可初步判断基于该供体的FMT对于艰难梭菌感染的治疗疗效，可用于筛选FMT的供体，或者评价所提供的粪便质量的优劣，既避免了直接培养艰难梭菌的复杂过程，通过酶反应，即可推断FMT供者所提供的粪菌液对于艰难梭菌的抑制作用，且PFOR酶为艰难梭菌获取能量的步骤，对于艰难梭菌的意义重大。于艰难梭菌的意义重大。于艰难梭菌的意义重大。


技术研发人员：梁思成 肖丽君 吕沐瀚 阳泰 钟晓琳 齐晓怡 邓明明
受保护的技术使用者：西南医科大学附属医院
技术研发日：2022.01.27
技术公布日：2022/5/17