使神经细胞分化的方法及相关组合物和使用方法与流程

技术特征：
1.一种使神经细胞分化的方法，所述方法包括：(a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在所述第一次温育开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂；以及(b)进行第二次温育，包括在底物涂覆的培养器皿中在使所述细胞神经分化的条件下培养所述球体的细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二次温育开始于约第7天。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细胞暴露于所述tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂直至第7天当天或之前的一天。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞从第0天开始至第6天，包括每一天，暴露于所述tgf-β/激活nodal抑制剂。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂直至第7天当天或之前的一天。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞从第0天开始至第6天，包括每一天，暴露于所述至少一种shh信号传导激活剂。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于所述bmp信号传导抑制剂直至第11天当天或之前的一天。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞从第0天开始至第10天，包括每一天，暴露于所述bmp信号传导抑制剂。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于所述gsk3β信号传导抑制剂直至第13天当天或之前的一天。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞从第0天开始至第12天，包括每一天，暴露于所述gsk3b信号传导抑制剂。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在使所述细胞神经分化的条件下培养所述细胞包括将所述细胞暴露于(i)脑源性神经营养因子(bdnf)；(ii)抗坏血酸；(iii)胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)；(iv)二丁酰环amp(dbcamp)；(v)转化生长因子β-3(tgfβ3)(统称为“bagct”)；和(vi)notch信号传导抑制剂。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞从第11天开始暴露于bagct和所述notch信号传导抑制剂。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞从第11天开始暴露于bagct和所述notch信号传导抑制剂，直到收获所述神经分化细胞，任选地直到第18天，任选地直到第25天。14.一种使神经细胞分化的方法，所述方法包括：(a)进行第一次温育，包括在非贴壁培养器皿中在产生细胞球体的条件下培养多能干细胞，其中在所述第一次温育当天开始时(第0天)，将所述细胞暴露于(i)tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；(ii)至少一种音猬因子(shh)信号传导激活剂到第6天，包括每一天；(iii)骨形态发生蛋白(bmp)信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；和(iv)糖原合酶激酶3β(gsk3β)信号传导抑制剂到第6天，包括每一天；以及
至约1
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2或约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。34.根据权利要求29-33中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养在6孔板中进行并且包含约1
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
106个多能干细胞/孔至约10
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔、约10
×
106个多能干细胞/孔至约15
×
106个多能干细胞/孔或约15
×
106个多能干细胞/孔至约20
×
106个多能干细胞/孔。35.根据权利要求29-34中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养在24孔板中进行并且包含约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔、约1
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
105个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔、约5
×
105个多能干细胞/孔至约1
×
106个多能干细胞/孔或约1
×
106个多能干细胞/孔至约5
×
106个多能干细胞/孔。36.根据权利要求29-35中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养包含的细胞数目足以在约第7天产生包含约1,000个细胞至约5,000个细胞或约2,000个细胞至约3,000个细胞的球体。37.根据权利要求29-36中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养包含的细胞数目足以在约第7天产生包含约2,000个细胞的球体。38.根据权利要求29-36中任一项所述的方法，其中第0天多能干细胞的所述培养包含的细胞数目足以在约第7天产生包含约3,000个细胞的球体。39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中处理所述培养器皿以减少或消除细胞粘附。40.根据39所述的方法，其中所述处理所述培养器皿包括将所述培养器皿与普朗尼克酸一起温育。41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中，在所述第一次温育之前，将所述非贴壁培养器皿暴露于表面活性剂。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述表面活性剂是普朗尼克酸。43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述非贴壁培养器皿包括低或超低附着表面。44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，所述非贴壁培养器皿包括超低附着表面。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述底物是基底膜蛋白。46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述底物选自层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖以及它们的组合中的一种或多种。47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述底物是重组蛋白。48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述底物是重组层粘连蛋白。49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中，所述底物涂覆的培养器皿在用于培养所述细胞之前，暴露于聚-l-鸟氨酸。50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述tgf-β/激活nodal信号传导抑制剂为sb431542。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm，任选地约10μm的sb431542。52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述至少一种shh信号传导激活剂为shh或嘌吗啡胺。53.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述至少一种shh信号传导激活剂包含选自shh蛋白和嘌吗啡胺的两种shh信号传导激活剂。54.根据权利要求52或权利要求53所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约10ng/ml至500ng/ml、约20ng/ml至约400ng/ml、约50ng/ml至约200ng/ml或约75ng/ml至约150ng/ml，任选地约100ng/ml的shh。55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm，任选地约10μm的嘌吗啡胺。56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中所述bmp信号传导抑制剂为ldn193189。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约10nm至500nm、约20nm至约400nm、约50nm至约200nm或约75nm至约150nm，任选地约100nm的ldn193189。58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述gsk3β信号传导抑制剂为chir99021。59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约0.1μm至约5μm、约0.5μm至约4μm或约1μm至约3μm，任选地约2μm的chir99021。60.根据权利要求11-59中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml、约5ng/ml至约80ng/ml、约10ng/ml至约60ng/ml或约15ng/ml至约30ng/ml，任选地约20ng/ml的gdnf。61.根据权利要求11-60中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1ng/ml至约100ng/ml、约5ng/ml至约80ng/ml、约10ng/ml至约60ng/ml或约15ng/ml至约30ng/ml，任选地约20ng/ml的bdnf。62.根据权利要求11-61所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约0.1mm至5mm、约0.2mm至约4mm、约0.3mm至约3mm或约0.4mm至约2mm，任选地约0.5mm的dbcamp。63.根据权利要求11-62中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约0.05mm至约5mm、约0.1mm至约1mm或约0.2mm至约0.5mm，任选地约0.2mm的抗坏血酸。64.根据权利要求11-63中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约0.1ng/ml
至约5ng/ml、约0.3ng/ml至约3ng/ml或约0.5ng/ml至约2ng/ml，任选地约1ng/ml的tgfβ3。65.根据权利要求11-64中任一项所述的方法，其中所述notch信号传导抑制剂为dapt。66.根据权利要求11-65中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm，任选地约10μm的dapt。67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述第一次温育和/或所述第二次温育中的所述培养在包含血清或血清替代物的培养基中进行。68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述第一次温育和所述第二次温育中的所述培养在包含血清或血清替代物的培养基中进行。69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述细胞从约第0天至约第10天在包含血清或血清替代物的培养基中培养。70.根据权利要求67-69中任一项所述的方法，其中所述血清或血清替代物占所述培养基的约5％(v/v)。71.根据权利要求67-70中任一项所述的方法，其中所述血清或血清替代物占所述培养基的约2％(v/v)。72.根据权利要求67-71中任一项所述的方法，其中所述培养基从约第0天至约第1天包含约5％的血清或血清替代物(v/v)，从从约第2天至约第10天包含约2％的血清替代物(v/v)。73.根据权利要求67-72中任一项所述的方法，其中所述培养基包含血清替代物。74.根据权利要求67-73中任一项所述的方法，其中所述血清替代物不含胎牛血清(fbs)。75.根据权利要求67-74中任一项所述的方法，其中所述血清替代物是knockout
tm
血清替代物。76.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述细胞在所述培养持续期间在不存在血清的情况下培养。77.根据权利要求1-76中任一项所述的方法，其中所述细胞在第0天、第7天、第16天和/或第20天暴露于rho相关蛋白激酶(rock)信号传导抑制剂。78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述细胞在第0天、第7天、第16天和第20天暴露于rho相关激酶蛋白(rock)信号传导抑制剂。79.根据权利要求77或权利要求78所述的方法，其中所述rock抑制剂是y-27632。80.根据权利要求77-79中任一项所述的方法，其中所述细胞暴露于浓度为约1μm至约20μm、约5μm至约15μm或约8μm至约12μm，任选地约10μm的所述rock抑制剂。81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法，其中每天或每隔一天或每三天更换所述培养基的至少约50％。82.根据权利要求23-81中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解离。83.根据权利要求23-82中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解离，所述酶促解离包括使用选自由以下项组成的组的酶：accutase、分散酶、胶原酶以及它们的组合。84.根据权利要求23-83中任一项所述的方法，其中所述球体通过酶促解离而解离，所述酶促解离包括使用accutase。
85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述底物涂覆的培养器皿中转移约0.1
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.1
×
106个细胞/cm2至约0.2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.2
×
106个细胞/cm2至约0.4
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.6
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2、约0.6
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2、约0.8
×
106个细胞/cm2至约1
×
106个细胞/cm2或约1.0
×
106个细胞/cm2至约2
×
106个细胞/cm2。86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述底物涂覆的培养器皿中转移约0.4
×
106个细胞/cm2至约0.8
×
106个细胞/cm2。87.根据权利要求85或权利要求86所述的方法，其中所述转移发生在约第7天。88.根据权利要求15-87中任一项所述的方法，所述方法还包括用低温保护剂配制所收获的细胞。89.根据权利要求88所述的方法，其中所述低温保护剂选自由以下项组成的组：甘油、丙二醇和二甲亚砜(dmso)。90.根据权利要求88或权利要求89所述的方法，所述方法还包括低温保存所收获的细胞，并且任选地在使用前解冻所述细胞。91.根据权利要求1-90中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干(es)细胞、诱导多能干细胞(ipsc)或它们的组合。92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干(es)细胞，任选地是小鼠或人胚胎干细胞。93.根据权利要求1-92中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人胚胎干细胞。94.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞，任选地是小鼠或人诱导多能干细胞。95.根据权利要求1-91和94中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人诱导多能干细胞。96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞对于待用所述神经分化细胞治疗的受试者是自体的。97.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞对于待用所述神经分化细胞治疗的受试者是同种异体的。98.根据权利要求1-97中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是低免疫原性的。99.根据权利要求98所述的方法，其中所述多能干细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因，任选地提供到aavs1安全港基因座中。
100.一种通过根据权利要求1-99中任一项所述的方法产生的治疗组合物。101.根据权利要求100所述的治疗组合物，其中所述组合物的细胞表达en1和corin，并且所述组合物中总细胞少于10％表达th。102.一种治疗组合物，所述治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中所述组合物中的细胞表达en1和corin，并且所述组合物中所述总细胞少于10％表达th。103.一种治疗组合物，所述治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中所述治疗组合物表现出小于约2.5
×
10-2
的每百万计数(cpm)th与cpm gapdh的比率。104.一种治疗组合物，所述治疗组合物包含源自多能干细胞的定向多巴胺神经元祖细胞(ddpc)，其中所述治疗组合物表现出以下中的一项或多项：(a)大于约2
×
10-5
的每百万计数(cpm)neurog1与cpm gapdh的比率；(b)大于约5
×
10-4
的cpm edn3与cpm gapdh的比率；(c)大于约4
×
10-3
的cpm hes1与cpm gapdh的比率；(d)大于约8
×
10-3
的cpm psrc1与cpm gapdh的比率；(e)大于约2
×
10-3
的cpm nek6与cpm gapdh的比率；(f)大于约1
×
10-2
的cpm iqgap3与cpm gapdh的比率；(g)大于约8
×
10-4
的cpm usp44与cpm gapdh的比率；(h)大于约3
×
10-3
的cpm cep55与cpm gapdh的比率；(i)大于约2
×
10-2
的cpm kif20a与cpm gapdh的比率；(j)大于约2
×
10-2
的cpm aurka与cpm gapdh的比率；(k)小于约1
×
10-3
的cpm calca与cpm gapdh的比率；(l)小于约1
×
10-3
的cpm glra2与cpm gapdh的比率；(m)小于约1
×
10-1
的cpm mapt与cpm gapdh的比率；(n)小于约5
×
10-2
的cpm camk2b与cpm gapdh的比率；(o)小于约1
×
10-2
的cpm syt13与cpm gapdh的比率；(p)小于约1
×
10-3
的cpm lhfpl4与cpm gapdh的比率；(q)小于约5
×
10-3
的cpm ret与cpm gapdh的比率；(r)小于约1
×
10-2
的cpm kcnd3与cpm gapdh的比率；(s)小于约5
×
10-2
的cpm nsg2与cpm gapdh的比率；以及(t)小于约2
×
10-2
的cpm snap25与cpm gapdh的比率。105.根据权利要求104所述的治疗组合物，其中：(a)cpm neurog1与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-5
至约5
×
10-3
之间；(b)cpm edn3与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(c)cpm hes1与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(d)cpm psrc1与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-2
至约5
×
10-2
之间；(e)cpm nek6与cpm gapdh的比率介于约2
×
10-2
至约5
×
10-1
之间；(f)cpm iqgap3与cpm gapdh的比率介于约1.5
×
10-2
至约1
×
10-1
之间；(g)cpm usp44与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；
(h)cpm cep55与cpm gapdh的比率介于约4
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(i)cpm kif20a与cpm gapdh的比率介于约2.5
×
10-2
至约2
×
10-1
之间；(j)cpm aurka与cpm gapdh的比率介于约2.6
×
10-2
至约2
×
10-1
之间；(k)cpm calca与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-5
至约1
×
10-3
之间；(l)cpm glra2与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-6
至约1
×
10-3
之间；(m)cpm mapt与cpm gapdh的比率介于约5
×
10-3
至约1
×
10-1
之间；(n)cpm camk2b与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约5
×
10-2
之间；(o)cpm syt13与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间；(p)cpm lhfpl4与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-4
至约1
×
10-3
之间；(q)cpm ret与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-4
至约4
×
10-3
之间；(r)cpm kcnd3与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间；(s)cpm nsg2与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约2.4
×
10-2
之间；和/或(t)cpm snap25与cpm gapdh的比率介于约1
×
10-3
至约1
×
10-2
之间。106.根据权利要求104或权利要求105所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物表现出(a)-(t)中的2项至20项。107.根据权利要求100和103-106中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物中的细胞表达en1和corin。108.根据权利要求100-107中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物表现出：(a)大于约1
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10-4
的每百万计数(cpm)en1与cpm gapdh的比率；和/或(b)大于约2
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10-2
的cpm corin与cpm gapdh的比率。109.根据权利要求100-108中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物的所述细胞表现出：介于约1.5
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10-3
至1
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10-2
之间的每百万计数(cpm)en1与cpmgapdh的比率；和/或介于约5
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10-2
至5
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10-1
之间的cpm corin与cpm gapdh的比率。110.根据权利要求100和104-109中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中的细胞表达th。111.根据权利要求100和103-110中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中所述总细胞少于10％表达th。112.根据权利要求100-111中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物表现出小于约3
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10-2
的每百万计数(cpm)th与cpm gapdh的比率。113.根据权利要求100-112中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中所述总细胞的约2％至约10％、约2％至约8％、约2％至约6％、约2％至约4％、约4％至约10％、约4％至约8％、约4％至约6％、约6％至约10％、约6％至约8％或约8％至10％表达th。114.根据权利要求100-113中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中所述总细胞少于5％表达th。115.根据权利要求100-114中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物中所述总细胞的约1％至约5％或约2％至约4％表达th。116.根据权利要求100-115中任一项所述的治疗组合物，其中所述定向细胞能够在体内移植并且使其它细胞受神经支配。
117.根据权利要求100-116中任一项所述的治疗组合物，其中所述定向细胞能够产生多巴胺，任选地其中所述定向细胞不产生或不大量产生去甲肾上腺素。118.根据权利要求100-117中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少500万总细胞、至少1000万总细胞、至少1500万总细胞、至少2000万总细胞、至少3000万总细胞、至少4000万总细胞、至少5000万总细胞、至少1亿总细胞、至少1.5亿总细胞或至少2亿总细胞。119.根据权利要求100-118中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含刚好或约500万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约1.5亿总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约1亿总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约5000万总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约2500万总细胞、刚好或约500万总细胞至刚好或约1000万总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约1.5亿总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约1亿总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约5000万总细胞、刚好或约1000万总细胞至刚好或约2500万总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约1.5亿总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约1亿总细胞、刚好或约2500万总细胞至刚好或约5000万总细胞、刚好或约5000万总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约5000万总细胞至刚好或约1.5亿总细胞、刚好或约5000万总细胞至刚好或约1亿总细胞、刚好或约1亿总细胞至刚好或约2亿总细胞、刚好或约1亿总细胞至刚好或约1.5亿总细胞或刚好或约1.5亿总细胞至刚好或约2亿总细胞。120.根据权利要求100-119中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少1千万总细胞。121.根据权利要求100-120中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少2千万总细胞。122.根据权利要求100-121中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少3千万总细胞。123.根据权利要求100-122中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含至少4千万总细胞。124.根据权利要求100-123中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物中所述总细胞的至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％是活的。125.根据权利要求100-124中任一项所述的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含低温保护剂。126.根据权利要求125所述的治疗组合物，其中所述低温保护剂选自由以下项组成的组：甘油、丙二醇和二甲亚砜(dmso)。127.根据权利要求100-126中任一项所述的治疗组合物，其中所述组合物用于治疗受试者的神经退行性疾病或病状。128.根据权利要求100-127中任一项所述的治疗组合物，其中所述神经退行性疾病或病状包括任选地在sn中，任选地在snc中的多巴胺能神经元的损失。129.根据权利要求128所述的治疗组合物，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森病。
130.根据权利要求128所述的治疗组合物，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森综合征。131.一种治疗方法，所述治疗方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求100-130中任一项所述的治疗组合物。132.根据权利要求131所述的方法，其中向所述受试者施用的细胞的数目为约0.25
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106个细胞至约20
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106个细胞、约0.25
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106个细胞至约15
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106个细胞、约0.25
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106个细胞至约10
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106个细胞、约0.25
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106个细胞至约5
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106个细胞、约0.25
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106个细胞至约1
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106个细胞、约0.25
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106个细胞至约0.75
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106个细胞、约0.25
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106个细胞至约0.5
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106个细胞、约0.5
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106个细胞至约20
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106个细胞、约0.5
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106个细胞至约15
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106个细胞、约0.5
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106个细胞至约5
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106个细胞、约0.5
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106个细胞至约1
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106个细胞、约0.5
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106个细胞至约0.75
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106个细胞、约0.75
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106个细胞至约5
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106个细胞、约0.75
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106个细胞至约1
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106个细胞、约1
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106个细胞至约20
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106个细胞、约1
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106个细胞至约15
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106个细胞、约1
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106个细胞至约10
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106个细胞、约1
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106个细胞至约5
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106个细胞、约5
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106个细胞至约20
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106个细胞、约5
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106个细胞至约15
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106个细胞、约5
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106个细胞至约10
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106个细胞、约10
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106个细胞至约20
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106个细胞、约10
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106个细胞至约15
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106个细胞或约15
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106个细胞至约20
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106个细胞。133.根据权利要求131或权利要求132所述的方法，其中所述受试者患有神经退行性疾病或病状。134.根据权利要求131-133中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病状包括多巴胺能神经元的损失。135.根据权利要求131-134中任一项所述的方法，其中所述受试者已损失任选地在所述黑质(sn)，任选地在所述sn致密部(snc)中的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的多巴胺能神经元。136.根据131-135中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森综合征。137.根据权利要求131-135中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森病，任选地为特发性帕金森病。138.根据权利要求131-137中任一项所述的方法，其中所述施用包括通过立体定向注射递送组合物的细胞。139.根据权利要求131-138中任一项所述的方法，其中所述施用包括通过导管递送组合物的细胞。140.根据权利要求138或权利要求139所述的方法，其中将所述细胞递送到所述受试者的纹状体。141.根据权利要求131-140中任一项所述的方法，其中所述治疗组合物的所述细胞对于所述受试者是自体的。142.根据权利要求131-141中任一项所述的方法，其中所述治疗组合物的所述细胞对于所述受试者是同种异体的。143.根据权利要求131-142中任一项所述的方法，其中所述治疗组合物的所述细胞是
低免疫原性的。144.根据权利要求143所述的方法，其中所述治疗组合物的所述细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因，任选地提供到aavs1安全港基因座中。145.根据权利要求100-130中任一项所述的组合物用于配制用于治疗患有神经退行性疾病或病状的受试者的药物的用途。146.根据权利要求100-115中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有神经退行性疾病或病状的受试者。147.根据权利要求145所述的用途或根据权利要求146所述使用的药物组合物，其中所述神经退行性疾病或病状包括多巴胺能神经元的损失。148.根据权利要求145-147中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述受试者已损失任选地在所述黑质(sn)，任选地在所述sn致密部(snc)中的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的多巴胺能神经元。149.根据权利要求145-148中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森综合征。150.根据权利要求145-148中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述神经退行性疾病或病状为帕金森病，任选地为特发性帕金森病。151.根据权利要求145-150中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述组合物的所述细胞对于所述受试者是自体的。152.根据权利要求145-150中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述组合物的所述细胞对于所述受试者是同种异体的。153.根据权利要求145-152中任一项所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述治疗组合物的所述细胞是低免疫原性的。154.根据权利要求153所述的用途或用于用途的药物组合物，其中所述治疗组合物的所述细胞经工程改造以(a)去除编码多态性hla-a/-b/-c和hla ii类分子中的一种或多种的基因；并且(b)提供编码pd-l1、hla-g和cd47中的一种或多种的基因，任选地提供到aavs1安全港基因座中。

技术总结
本公开提供了使多能干细胞，包括诱导多能干细胞，谱系特异性分化成中脑底板祖细胞、定向多巴胺(DA)神经元祖细胞和/或DA神经元的方法。还提供了其组合物用途，诸如用于治疗神经退行性疾病和病状，包括帕金森病的组合物用途。途。途。


技术研发人员：A
受保护的技术使用者：艾斯本神经科学公司
技术研发日：2021.01.13
技术公布日：2022/11/11