一种基于pH敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法、类黑精及其应用与流程

本发明属于类黑精分离纯化，具体涉及到一种基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法、类黑精及其应用。

背景技术：

1、类黑精(melanoidins)是碳水化合物与带有自由氨基的含氮化合物反应产生的一类结构复杂、聚合度不等高分子量美拉德反应产物。其普遍存在于食品加工和储存过程中，如啤酒、面包、咖啡、醋等食品，有助于食品风味和颜色的形成，并具有如金属离子螯合特性、抗氧化、抗菌、抗高血压和抗肿瘤等多种功能活性，其中类黑精的螯合特性在与金属的结合中发挥重要作用。

2、金属螯合亲和纯化是一种利用过渡金属离子和目标产物上的电子供体基团之间的亲和作用分离纯化目标产物的方法。金属亲和纯化体系一般有介质(或载体)、金属离子螯合剂和金属离子三个组成要素，目前广泛应用于各种蛋白质的分离纯化。

3、智能型高分子是一类能够感知和接受外部环境的信息并做出敏感性响应的聚合物，这些转变背后的环境触发因素可以是温度、ph值、电场、磁场、离子强度增加、某些代谢化学物质的存在以及聚阳离子-聚阴离子复合物的形成，根据环境变化自动改变自身形状、溶解度和表面性质等，发生相应的可逆变化。其中ph敏感型高分子是一类在水溶液中的溶解度随着ph值而变化，并具有可逆的沉淀-溶解特性的智能高分子，被应用于药物控制释放、物料分离、免疫分析等领域，近年来受到越来越多的关注。

4、在日常生活中经常以富含胆碱的食物为食，如：红肉(猪肉、牛肉、鱼肉)，就会增加动脉粥样硬化风险的发生。有文献报道抑制体内胆碱代谢途径，可以预防动脉粥样硬化的发生。因此开发一种可以抑制胆碱代途径的活性物质十分重要。目前关于类黑精对动脉粥样硬化预防机制也有相关研究，例如：verzelonie等人研究发现香醋类黑精可以与血红素结合阻止其吸收，血红素可以作为氧化损伤的催化剂，并引发多种癌症和心血管疾病的发生。这些突出的活性使类黑精成为预防动脉硬化疾病的功能性配料成为了可能。

5、但类黑精的提取纯化一直是一个技术难题，传统的类黑精提取的方法包括有机溶剂提取法、尺寸排阻色谱法、水浸提法、沉淀法、大孔树脂吸附法、酶解法等。然而这些传统的提取方法在提取过程中都存在反应时间长、提取不充分、产品得率并不理想的问题，不利于工业化大规模生产。大孔树脂吸附法虽具有吸附容量大、吸附速度快、时间短、物理化学稳定性好等优点，但其也有一定的局限性，例如树脂经过反复使用后，树脂的表面及内部会残留许多非吸附性成分或者是杂质使柱的颜色变深，柱效也会降低，而且经多次使用有时柱床挤压过紧还会导致树脂颗粒破碎，使用寿命较短。

6、因此，如何提供一种有效的类黑精分离纯化方法，对于后续研究纯化类黑精的结构以及预防动脉粥样硬化疾病的功能活性等具有重要意义。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，

5、以葡萄糖和甘氨酸为原料通过美拉德反应制备粗类黑精；

6、向ph敏感高分子溶液中加入活化剂进行活化后加入金属螯合剂溶液，偶联反应得到ph敏感沉淀剂溶液；

7、fecl3溶液加入到ph敏感沉淀剂溶液中，螯合得到ph敏感金属螯合沉淀剂；

8、粗类黑精与ph敏感金属螯合沉淀剂混合，调节ph为4.8～5.2并离心，除去上清液中未结合的类黑精，沉淀为ph敏感金属螯合沉淀剂与类黑精的复合物；

9、复合物加入到naoh溶液中，沉淀复溶，继续加入乙二胺四乙酸二钠溶液进行水浴搅拌反应，反应后待冷却至室温，再次调节溶液ph为4.8～5.2并离心，取上清液进行透析、冻干、进一步后处理，即得到纯化类黑精。

10、作为本发明所述基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法的一种优选方案，其中：所述ph敏感高分子溶液由ph敏感高分子eudragit s-100溶于naoh溶液配置得到，浓度为1％，调节ph至6.5～7.5。

11、作为本发明所述基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法的一种优选方案，其中：所述金属螯合剂溶液为4-(咪唑-1-基)苯胺溶液，浓度为10mmol/l，其中，每1gph敏感高分子加入11ml金属螯合剂溶液。

12、其中，当金属螯合剂溶液添加量偏低则螯合不完全，纯化类黑精产率下降，金属螯合剂溶液添加量偏高，溶液中含有多余的未被螯合的试剂，影响后续实验。

13、作为本发明所述基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法的一种优选方案，其中：所述活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺，添加的摩尔质量为70～90％的ph敏感高分子。

14、作为本发明所述基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法的一种优选方案，其中：所述fecl3溶液的浓度为60mmol/l，添加量为1.25ml。

15、其中，当fecl3溶液添加量偏低则螯合不完全，纯化类黑精产率下降，当金属螯合剂溶液添加量偏高，溶液中含有多余的未被螯合的试剂，影响后续实验。

16、作为本发明所述基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法的一种优选方案，其中：所述粗类黑精与ph敏感金属螯合沉淀剂混合，其中，以所述ph敏感金属螯合沉淀剂中的eudragit s-100计，每加入1geudragit s-100加入0.56mg粗类黑精，转速为为100r/min，震荡时间为60～80min。

17、其中，当粗类黑精添加量偏低则螯合不完全，纯化类黑精产率下降，当粗类黑精添加量偏高，溶液中含有多余的未被螯合的试剂，影响后续实验。

18、作为本发明所述基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法的一种优选方案，其中：所述乙二胺四乙酸二钠的添加量为fecl3溶液中fe3+摩尔量的1.5～4倍。

19、作为本发明所述基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化类黑精的方法的一种优选方案，其中：所述复合物加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中水浴搅拌的温度为50℃、搅拌时间为3～4h。

20、本发明的再一目的是，提供一种基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化得到的类黑精。

21、本发明的再一目的是，提供一种基于ph敏感金属螯合沉淀剂分离纯化得到的类黑精在作为改善或预防动脉粥样硬化的功能性配料中的应用。

22、本发明有益效果：

23、(1)本发明以葡萄糖和甘氨酸为原料进行美拉德反应生成粗类黑精，以分离纯化粗类黑精为目标，利用类黑精的金属螯合能力和ph敏感高分子的ph敏感性，通过制备ph敏感金属螯合剂，与粗类黑精进行螯合，再通过简单调节ph就可实现类黑精的分离纯化.

24、(2)本发明选用单一氨基酸及还原糖制备的模型类黑精，其形成类黑精结构相对简单，性质较为稳定，有利于后续研究类黑精结构，且分离纯化得到的纯化类黑精与粗类黑精相比，分子量较低，为6000da，在微观结构上，粗类黑精中大块不规则多边形块状和少量颗粒状结构也转化为更多小块片状、块状结构。

25、(3)本发明类黑精产品通过长期服用可以显著改善血脂水平以及血浆中tma和tmao的水平，同时还可以激活ampk途径抑制tma裂解酶活性，并改善肠道酸性环境，从而抑制肠道中有害细菌的增殖，二者共同调节起到预防动脉粥样硬化疾病的作用。因此，本发明通过ph敏感金属螯合沉淀剂纯化的类黑精作为一种功能成分来抑制胆碱代谢减缓动脉硬化疾病发生的风险，为预防动脉硬化疾病提供了新的策略。