一种全雄乌斑杂交鳢的规模化培育方法与流程

本发明涉及水产养殖，特别涉及一种全雄乌斑杂交鳢的规模化培育方法。

背景技术：

1、包括乌鳢(channa argus)、斑鳢(channa maculata)及其两个种之间杂交培育的杂交鳢是我国池塘养殖重要的品种，因肉质品质高，兼有补脾益胃、利水消肿及促进伤口愈合的功效，历来受消费者所青睐。由斑鳢和乌鳢正反杂交培育的杂交鳢，不仅杂种双亲优势明显，而且在养殖上实现了向高效、环保配合饲料的巨大跨越，饲料报酬高，并减少了养殖污染，养殖单产是双亲传统养殖模式的3-5倍，极大地促进了鳢属鱼类的产业化。

2、由于斑鳢和乌鳢都是典型的两性生长异形鱼类，雄性生长速度显著快于雌性，除杂交产生的优势外，还可通过性别控制技术加持性别生长优势。研究表明，两性生长异形鱼类通过性别控制培育的单性鱼类，在提高生长速度、增加养殖产量、控制过度繁殖、减少饲料消耗、提高鱼品质量及缩短养殖周期等方面都有较大的优势。目前培育成功的全雄黄颡鱼和杂交鳢“雄鳢1号”都是该技术的典型杰作；研究表明，“雄鳢1号”雄性率达93.0％，生长提高了26.2％，饲料系数降低0.1-0.2，对鳢属鱼类的提质增效有显著的促进作用。因此，研究开发全新的斑鳢性别控制技术并应用于全雄生鱼的规模化养殖，具有重大的经济意义和极佳的应用前景。

3、目前，将xy和yy基因型的遗传雄鱼诱导成具有正常生殖能力的生理雌鱼(又称伪雌鱼)及筛选可靠的性别分子标记用于鱼类的性别筛选是创制全雄生鱼的关键。研究表明，斑鳢使用雌激素诱导性逆转时，低剂量诱导的成功率较低，而高剂量诱导除成活率低外，还会造成卵巢发育畸形及输卵管缺失而丧失自然产卵能力，只能以杀雌取卵的方式进行人工授精。然而，受到受卵巢成熟度、催产剂量和温度等影响，很难精确判断效应时间并同步获取具有最佳受精能力的成熟卵子，导致人工授精的受孕率低而严重影响超雄鱼的创制效率，极大限制了全雄鱼的量产能力。同时，通过性别分子标记鉴定的超雄鱼由于不能排除个体遗传差异受环境或遗传因子对雄性率的影响，尤其是常染色体性修饰基因的影响，导致一些超雄鱼个体繁殖后裔的雄性率不足90％，这可能是“雄鳢1号”雄性率只有93％的重要原因。因此，要规模化高效生产全雄杂交鳢，这些技术关键都需解决或加以改善。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种全雄乌斑杂交鳢的规模化培育方法，通过雄激素受体拮抗剂诱导性逆转，之后以分子标记引物筛选出所需基因型斑鳢，结合超雄全同胞家系选育，能够实现规模化生产全雄乌斑杂交鳢，雄性率可达100％，繁殖收益和养殖成本优势明显，应用前景良好。

2、本发明具体通过以下技术方案实现：

3、本发明的第一方面提供了一种全雄乌斑杂交鳢的规模化培育方法，包括以下步骤：

4、s1、采用添加有雄激素受体拮抗剂或协同添加有雌激素的配合饲料投喂开口摄食的斑鳢鱼苗，进行性逆转；

5、s2、通过seq id no.1-2所示的第一对引物和seq id no.3-4所示的第二对引物对性逆转鱼苗进行遗传性别鉴定，选择生理表型为雌性、遗传性别鉴定为xy基因型的斑鳢伪雌鱼进行培育，直至性成熟；

6、s3、将性成熟的斑鳢伪雌鱼与正常斑鳢雄鱼配对繁殖，获得超雄鱼候选群体，通过seq id no.1-2所示的第一对引物和seq id no.3-4所示的第二对引物对超雄鱼候选群体进行遗传性别鉴定，选择yy基因型的斑鳢超雄鱼进行培育，直至性成熟；

7、s4、将性成熟的斑鳢超雄鱼作为父本、正常雌性乌鳢作为母本，进行杂交繁殖，获得全雄乌斑杂交鳢。

8、进一步地，步骤s1中，雄激素受体拮抗剂为氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、恩杂鲁胺、阿帕鲁胺或达洛鲁胺，所述雌激素为β-雌二醇。

9、进一步地，步骤s1中，单独添加雄激素受体拮抗剂时，雄激素受体拮抗剂的添加浓度为200-2000mg/kg；协同添加雄激素受体拮抗剂和β-雌二醇时，雄激素受体拮抗剂的添加浓度为100-1000mg/kg，β-雌二醇的添加浓度为10-60mg/kg。

10、更进一步地，雄激素受体拮抗剂的添加浓度为250-750mg/kg，β-雌二醇的添加浓度为12.5-50mg/kg。

11、进一步地，步骤s1中，性逆转包括以下步骤：在斑鳢初孵仔鱼开口10-15日龄，混合投喂枝角类和含有雄激素受体拮抗剂或协同添加有雌激素的配合饲料，第16日龄起完全投喂含有雄激素受体拮抗剂或协同添加雌激素的配合饲料，投喂30-75d，日投喂频率2-3次，投喂量占全部仔鱼总重的3-5％。

12、进一步地，步骤s2和步骤s3中，遗传性别鉴定包括以下步骤：取性逆转斑鳢鱼苗的鳍条提取基因组dna，采用seq id no.1-2所示的第一对引物和seq id no.3-4所示的第二对引物进行pcr扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断鱼苗基因型；其中，采用第一对引物不能扩增出288bp大小的目的条带、且第二对引物能扩增出214bp大小的目的条带的鱼苗基因型为xx，采用第一对引物能扩增出288bp大小的目的条带、且第二对引物能扩增出214bp大小的目的条带的鱼苗个体基因型为xy，采用第一对引物能扩增出288bp大小的目的条带、且第二对引物不能扩增出214bp大小的目的条带的鱼苗个体基因型为yy。

13、进一步地，pcr扩增体系包括：基因组dna 1μl、2×taq mastermix(dye)10μl、上游引物和下游引物各0.8μl以及ddh2o 7.4μl；pcr反应程序包括：94℃预变性2min，35个循环(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s)，72℃终延伸5min。

14、进一步地，步骤s3中，还包括以下步骤：将yy基因型的超雄鱼进行性逆转，获得生理表型为雌性、遗传性别鉴定为yy基因型的超雌鱼，之后将超雌鱼和超雄鱼配对繁殖，每对鱼的后裔分别作为一个超雄全同胞家系，独立饲养至性成熟后，将每个家系的斑鳢超雄鱼作为父本、正常雌性乌鳢作为母本，进行测交繁殖，选留测交后代雄性率100％的家系。

15、进一步地，步骤s4中，斑鳢超雄鱼采用1-2μg/mg促黄体素释放激素a2和100-200iu/kg绒毛膜促性腺激素进行人工催情。

16、本发明的第二方面提供了如上所述的全雄乌斑杂交鳢的规模化培育方法在鳢鱼养殖中的应用。

17、本发明的优点及积极效果为：

18、1、本发明通过单独使用雄激素受体(ar)拮抗剂或协同使用雌激素诱导雌性化性逆转，性逆转率高达98％以上，而且可获得具有正常生殖能力的伪雌鱼，为鱼类性别逆转开辟了新途径。

19、2、本发明在诱导性逆转之后，采用新开发的分子标记引物进行遗传性别筛选和鉴定，能快速鉴定斑鳢的遗传性别，具有精确、便捷和不受环境干扰的优点，有利于快速、准确获得目标性状的伪雌鱼参与后续生产。

20、3、本发明通过雄激素受体(ar)拮抗剂诱导性逆转，之后以分子标记引物筛选出所需基因型斑鳢，结合超雄全同胞家系选育，有利于提高超雄鱼的生产效率，降低环境和包括性修饰基因等遗传因子对雄性率的影响，由此获得的超雄鱼作为亲本与雌性乌鳢交配，能够实现全雄乌斑杂交鳢的高效、规模化育种，确保雄性率可达100％，繁殖收益和养殖成本优势明显，应用前景良好。