以芸香提取物及卵转铁蛋白为基础的天然抗微生物组合物及其应用的制作方法

本发明涉及以芸香提取物及卵转铁蛋白为基础的组合物在制备缓解微生物感染疾病的药物中的用途，属药物领域。

背景技术：

1、只要临床上怀疑有感染的病症，则必须尽快给予抗微生物制剂治疗。微生物抗药性种类情形随时都在改进演化，滥用抗感染药物、感染控制不足、高突变性微生物，以及对养殖动物施用抗感染药物的结果，都造成越来越多微生物具有抗药性。由于需要针对微生物不同的特性来选择抗感染药物，因此抗药性的分布通常会因时间、地域而有所不同，例如：很多专家很早即推断革蓝氏阳性细菌对乙型单环酰胺及大环内脂产生抗药性的情形会持续扩大(peche`re,2001)。美国疾病预防管制中心(cdc)表示，光在2020年covid-19疫情爆发的第一年，与前一年相比，美国境内具有抗药性的院内感染及死亡比率，皆至少成长了15％。类似的情况也发生在近期以瑞德西韦(remdesivir)治疗新型冠状病毒(sars-cov-2)感染也在短时间内出现了耐抗药性(gandhi等人,2022)。

2、1928年因为盘尼西林(青霉素；penicillin)的发现，人类在与微生物中细菌的战争，似乎是以抗生素为武器赢得了第一回合。就研发投资而言，临床上以抗生素治疗患者疗程很少超过一周；相对于高血压、高血脂、高血糖的三高类或自体免疫及癌症等慢性病，病患必须长期用药、无法中断；因而研发能量自然会偏向后者。再加上半个多世纪以来，因为抗生素的滥用与误用，造成严重的抗药性问题。现在，变种细菌似乎蓄势待发，全球多起致命性的医院内感染案例；医疗界再度陷入寻找有效抗菌新药的窘境，更是医疗上的燃眉之急。如常见对盘尼西林产生抗药性的葡萄球菌(表2)产生抗药性的原因在于菌株所产生的β-内酰胺酶(β-lactamases)将盘尼西林当中的β-内酰胺环状结构水解后所导致，而其也会以相同模式影响氨苄青霉素(ampicillin)、爱默士霉素(amoxicillin)、替卡西林(ticarcillin)及美洛西林(meziocillin)等青霉素结构衍生的抗生素的效果，进一步产生对这些药物的抗药性。

3、1959年，一种名为甲氧西林(methicillin)的半合成盘尼西林正式启用，因其对于β-内酰胺酶所造成的水解作用较有抵抗性，开始普及使用，但同样不幸的是，对methicillin产生抗药性的菌株亦很快出现，并且加以命名为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus；mrsa)，mrsa对于其他β-内酰胺类的抗生素几乎皆产生抗药性，而其抗药性产生的原因在于其能合成一特殊的盘尼西林结合蛋白(penicillin-binding protein,pbp)，而且此一特殊蛋白质使mrsa对于所有的β-内酰胺类抗生素的亲合力降低，甚至在院内感染的mrsa菌株对于其它种类的抗生素，例如：喹诺酮(quinolones)、胺基糖苷类(aminoglycosides)、红霉素(erythromycin)、克林达霉素(clindamycin)及美坐磺胺曲美普林(trimethoprim-sulfamethoxazole)也多产生抗药性，故mrsa有时也称为「超级细菌」。如本发明所使用的实际自临床分离的金黄色葡萄球菌菌株(表2)，其不但对盘尼西林有抗药性，且对常用来治疗金黄色葡萄球菌的感染的半合成盘尼西林类抗生素(如methicillin,oxacillin等)、甚至第一(cefazolin)、四(cefepime)代头孢菌素以及人工合成、具有广谱抗菌性的氧氟沙星(ofloxacin)皆出现抗药性。似乎只有采用注射或静脉内的万古霉素(vancomycin)或利奈唑胺(linezolid)予以治疗了，但根据对万古霉素产生抗药性的金黄色葡萄球菌25年前即相继在日本及美国被分离出来的事实予以推断，在不久的将来，以万古霉素治疗的策略终将面临失败的一天(hiramatsu等人,1997；mcguinness等人,2017)。要减轻抗感染药物的抗药性问题，需要从患者管理以及药物开发两策略同时着手。患者管理方式包括：对医师开立某些特定抗感染药物设限，以及进行倡导，加强大众正确使用抗感染药物的观念。而药物开发方面，则需针对微生物对传统抗感染药物产生耐药性的机制来发展新的抗感染药物。

4、芸香(ruta graveolens l.)属于无患子目(sapindale)的多年生草本植物，由于其种子中含有被称为骆驼蓬碱(harmine)等的β-咔啉生物碱，其中还鉴别出人类第三基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-3,mmp-3)的专一抑制剂(chin等人,2021)。本案更进一步对含骆驼蓬碱(harmine)与相关生物碱的芸香提取物可以抑制包括病毒的多种微生物感染(nenaah,2010；moloudizargari等人,2013)的能力进行验证；尤其对另一天然抑菌蛋白―卵转铁蛋白(ovotransferrin)的加成作用进行探讨应用。卵转铁蛋白为一醣蛋白，主要存在于禽类血清及蛋白中，约占总蛋白组成的12-13％，具有两个铁离子结合位，除了可以运送铁离子供细胞生理作用外，因其具有移除了增殖所需的铁离子的特性，也被发现可以抑制微生物生长(8-10)；另有学者指出，卵转铁蛋白或其胜肽片段，可以抑制禽类马立克氏病毒，并且其抑制能力与铁质饱和度(iron saturation)无直接相关(giansanti等人,2002)。虽然β-咔啉类生物碱具有良好的抗微生物生长的能力，但也有报导指出，过高的浓度也会对真核生物造成细胞毒性(reza与abbas,2007；moura等人,2007)，故本发明将利用芸香提取物搭配卵转铁蛋白作为协同加成剂，测试其复方的抗微生物活性。

5、本发明除收集临床耐抗药菌株(表2)外，为测试芸香提取物与卵转铁蛋白抗微生物的广效暨普遍性，还采用会对鸡只造成重大危害的传染性支气管炎病毒及人类流感病毒为目标。传染性支气管炎病毒是最早被发现的冠状病毒，其在分类上是属于网巢病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、丙型冠状病毒属(gammacoronavirus)(ramakrishnan与kappala,2019)，遗传物质为正链单股的rna基因组，其基因长度约为27.6kb不分段的核酸序列并在细胞质中进行复制(casais等人,2003；quinteros等人,2015)。另外，由于丙型冠状病毒属的感染对象皆为禽类，故传染性支气管炎病毒也可以被称作禽类冠状病毒。由于传染性支气管炎病毒不仅会在上呼吸道及下呼吸道的上皮细胞中有复制的现象，也会出现在肠胃道、生殖系统及肾脏内(cavanagh,2007)，如此会导致受感染鸡只的气管和肾脏病变。传染性支气管炎病毒感染各个成长阶段的家禽类会受到不同程度的影响，成年的禽类可能在感染后导致呼吸道疾病、体重下降、输卵管受损、产蛋异常甚至死亡的情况发生(ramakrishnan与kappala,2019)，而对于感染的雏鸡而言，大多数会导致永久性的呼吸道损伤，少数会发生生殖系统失常，受传染性支气管炎病毒感染的胚蛋在外观上也会有明显的差异，例如：蛋壳含水量增加所造成的软化、外观粗糙且瘦长、或是色泽苍白等异常的现象发生(sevoian与levine,1957)，所以在传染性支气管炎病毒感染过后不论是成年或是刚出生的禽类，造成的情况都使得世界各国饲养家禽的业者受到剧烈的经济影响造成不小的损失，然而目前所知降低感染传染性支气管炎方式为接种疫苗，为了有更好的防范和治疗方式各界也开始寻找具有潜在疗效或是抑制效果的天然物来对抗传染性支气管炎病毒。而近几年虽有许多拮抗人类流感病毒上的神经酰胺酶(neuraminidase)抑制剂的上市，包括奥司他韦(oseltamivir)、帕拉米韦(peramivir)、扎那米韦(zanamivir)等，以及最近核准的核酸内切酶抑制剂巴洛沙韦酯(baloxavir)可能用于治疗，但奥司他韦要连续吃五天共十个剂量、扎那米韦要使用复杂的吸入方式，对小孩或是重症的病患依顺性都不佳，虽然巴洛沙韦酯只要服用一次，有效地增加病患的依顺性，但上述药品因成本因素，对广大的动物感染无法实际应用。在现实状态下，一方面感染的禽、畜、水产其衍生产品有对人类散布传染疾病的虞(beato等人,2009)；另一方面，不论细菌或是病毒变异都相当地快，所以在既有药物对大部分微生物还有些许作用时，就要开始去研究新药物新疗程，特别是同时可以抑制多种耐药及突变性高的微生物感染，未来方能改善多种抗药性微生物所衍生的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种医药组合物，包含：0.8至0.99重量份的一芸香提取物；以及0.01至0.2重量份的一卵转铁蛋白。优选地，所述医药组合物包含：0.85至0.97重量份的所述芸香提取物；以及0.03至0.15重量份的所述卵转铁蛋白。更优选地，所述医药组合物包含：0.90至0.95重量份的所述芸香提取物；以及0.05至0.10重量份的所述卵转铁蛋白。

2、本发明还提供一种医药组合物用于制备治疗微生物感染疾病的药物的用途，其中，所述医药组合物包含：0.8至0.99重量份的一芸香提取物；以及0.01至0.2重量份的一卵转铁蛋白。优选地，所述医药组合物包含：0.85至0.97重量份的所述芸香提取物；以及0.03至0.15重量份的所述卵转铁蛋白。更优选地，所述医药组合物包含：0.90至0.95重量份的所述芸香提取物；以及0.05至0.10重量份的所述卵转铁蛋白。

3、在本发明一实施例中，所述微生物为一具有抗药性的微生物。

4、在本发明一实施例中，所述微生物为细菌、病毒、或其组合。

5、在本发明另一实施例中，所述微生物为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、或其组合。

6、在本发明再一实施例中，所述微生物为绿脓杆菌、大肠杆菌、鲍氏不动杆菌、克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌、或其组合。

7、在本发明一实施例中，所述微生物为h1n1人类流感病毒。

8、在本发另一实施例中，所述微生物为冠状病毒(coronavirus,cov)。

9、在本发再一实施例中，所述冠状病毒包含传染性支气管炎病毒(infectiousbronchitis virus,ibv)。

10、在本发明一实施例中，所述的芸香提取物来源于芸香科(rutaceae)芸香属(ruta)植物的成熟种子提取的生物碱。

11、在本发明一实施例中，所述芸香提取物由以下方法所制得：取种子粉；碎成粗粉；加入2～4倍重量的10～50％醋酸溶液；以超音波振荡5～20分钟；在室温静置36～60小时后，进行挤压过滤；过滤后的残留物再以1～3倍重量的10～50％醋酸溶液进行超音波振荡5～20分钟；重复过滤步骤一次；将澄清液加入ph 8至ph 10的碳酸钠中，同时搅拌直至溶液变浑浊；在1～10℃静置12～36小时后，去除上清液并收集沉淀物；将所收集的沉淀物溶在50～70℃的醋酸水溶液中，其中醋酸水溶液中的水与醋酸体积比介于1:1至1:5之间；以碳酸钠冲洗，析出所述芸香提取物。

12、其中，所收集的芸香提取物含有80～99wt％的骆驼蓬碱与1～20wt％的双氢骆驼蓬碱(dihydroharmine)。优选地，所收集的芸香提取物含有90wt％及以上的骆驼蓬碱。

13、在本发明一实施例中，所述芸香提取物由以下方法所制得：取种子粉；碎成粗粉；加入3倍重量30％醋酸溶液；以超音波振荡15分钟；在室温静置48小时后，进行挤压过滤；过滤后的残留物再以2倍重量的30％醋酸溶液进行超音波振荡15分钟；重复过滤步骤一次；将澄清液加入ph 8的碳酸钠中，同时搅拌直至溶液变浑浊；在4℃静置24小时后，去除上清液并收集沉淀物；将所收集的沉淀物溶在60℃的醋酸水溶液中，其中醋酸水溶液中的水与醋酸体积比为1：3；以碳酸钠冲洗，析出所述芸香提取物。

14、其中，所收集的芸香提取物含有95wt％的骆驼蓬碱与5wt％的双氢骆驼蓬碱(dihydroharmine)。

15、在本发明一实施例中，所述的医药组合物还包含药学上可接受的辅料、佐剂或辅助性成分。

16、在本发明一实施例中，所述的医药组合物是外用制剂、口服制剂或注射制剂。

17、本发明原料芸香在欧洲中世纪改编自11世纪阿拉伯文的「保持健康」手册的著作「健康全书(拉丁语：tacuinum sanitatis)」中即记载芸香有明眼去胀气的功能，天主教神父甚至以芸香枝为施洒圣水之用，加强去邪功能，为使用上千年的民俗药效保健植物。

18、卵转铁蛋白来自鸡蛋清，为历代主要食品蛋白质来源，不仅具有自身具有抗微生物活性，还具有资源广、安全无毒和不易产生耐药性等优点，在抗微生物感染性疾病新药研发中具有广泛的开发与应用前景。

19、本发明的医药组合物不仅对耐药性革兰氏阳性菌和阴性菌具有抗菌活性，对动物及人类病毒也有较强的抑制作用，并且在体内同样具有良好的抗微生物活性，能有效治疗临床上午各类微生物所致的感染性疾病。此类同时对多种微生物，尤其是耐药菌及好突变性病毒疾病的治疗，没有相关文献报道。

20、本发明首次将二种常见天然物进行组合，通过二者协同效应干扰微生物生理代谢的作用来增强抗微生物活性，为应对日益严重的微生物耐药性与突变问题提供了一条崭新的途径。本发明提供的抗微生物组合物已在体内外抗感染研究中显示出良好的抗微生物活性。

21、显然对本领域技术人员而言，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

22、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。