一种培养基及利用其培养大鼠阴道类器官的方法

本发明属于组织细胞培养，涉及一种培养基及利用其培养大鼠阴道类器官的方法。

背景技术：

1、健康的阴道上皮对女性生殖健康及预防性传播疾病至关重要。由于缺乏容易获得的、生理相关的阴道体外模型，阴道相关疾病研究受到限制。因此，需要更好的临床前阴道体外模型，以探索性传播疾病感染机制及评估应用于阴道的新疗法的安全性和有效性等。目前常用的临床前研究模型，包括动物模型和细胞系等。由于人体组织和原代人阴道细胞获取伦理受限且难以培养，动物培养周期长且费用较高等问题，因此，亟需开发一种生理上相关、低成本、符合伦理的阴道体外模型。

2、类器官是三维(3d)培养的具有干性潜能的细胞，所形成的具有一定空间结构的组织类似物。由于其来源于组织，类器官从形态结构和表观遗传学方面都能很好地体现来源组织的特点，从而能更仿真地了解人体内各种器官的生理、病理机制。

3、大鼠由于易于获取，生殖周期与人类相似，以及比人体组织更少的伦理问题等，成为常见的阴道相关研究模型动物。特别是整个月经周期内，大鼠阴道上皮的变化与每个阶段激素波动密切相关，因此许多研究也使用大鼠研究雌激素与阴道组织的关系。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是提供一种用于大鼠阴道类器官培养的培养基，以能够高密度、可多次传代、易于冻存和复苏的进行大鼠阴道类器官的培养。

2、为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种用于大鼠阴道类器官培养的培养基，所述的培养基包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括b27、n2、noggin、r-spondin-1、wnt-3a、fgf-10、egf、a83-01、y-27632。

3、本发明的用于大鼠阴道类器官培养的培养基以dmem/f-12为基础培养基，添加b27、n2、noggin、r-spondin-1、wnt-3a、fgf-10、egf、a83-01、y-27632等促进细胞增殖、维持细胞干性和抑制细胞凋亡的成分，可有效地维持大鼠阴道类器官增殖活性和长期生存能力。

4、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种用于大鼠阴道类器官培养的培养基，其中所述的基础培养基为dmem/f-12。

5、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种用于大鼠阴道类器官培养的培养基，其中所述的培养基中b27、n2、noggin、r-spondin-1、wnt-3a、fgf-10、egf、a83-01、y-27632的浓度分别为1×、1×、20-200ng/ml、20-500ng/ml、20-200ng/ml、20-200ng/ml、20-200ng/ml、0.1-1μmol/l、1-20μmol/l。

6、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种用于大鼠阴道类器官培养的培养基，其中所述的添加成分还包括青霉素链霉素混合液，其浓度为1×。

7、本发明的第二个目的是提供一种利用如上所述的培养基进行大鼠阴道类器官培养的方法，以能够高密度、可多次传代、易于冻存和复苏的进行大鼠阴道类器官的培养。

8、为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的培养基进行大鼠阴道类器官培养的方法，所述的方法依次包括如下步骤：

9、(1)将大鼠阴道上皮细胞悬液与基质胶液体混匀后加入培养板各孔，待基质胶液体凝固；

10、(2)在培养板各孔中加入如上所述的培养基进行培养。

11、本发明的方法针对大鼠阴道类器官，采用基质胶包埋，培养基浸润培养的方法进行培养。其中大鼠阴道类器官传代方法包括利用细胞回收液去除基质胶，tryple消化分散成单个细胞后，按照1:3-5进行传代；大鼠阴道类器官冻存方法以含10％dmso的大鼠阴道类器官冻存液进行程序降温冻存；大鼠阴道类器官复苏方法是从液氮取出冻存的大鼠阴道类器官后，37℃速融进行复苏。

12、本发明还涉及大鼠阴道类器官he染色和免疫荧光鉴定方法，所述鉴定方法包括采用阴道上皮标志物krt5/8、krt15、阴道基底层标志物tp63和增殖标志物ki67进行免疫荧光染色，以确认大鼠阴道类器官与原始组织的特异性。

13、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的培养基进行大鼠阴道类器官培养的方法，其中步骤(1)中，所述的大鼠阴道上皮细胞悬液与所述的基质胶液体的体积比为1:1-3；混匀后大鼠阴道上皮细胞的含量为200-600个细胞/μl。

14、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的培养基进行大鼠阴道类器官培养的方法，其中步骤(1)中，所述的基质胶为matrigel，其浓度为8-12mg/ml。

15、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的培养基进行大鼠阴道类器官培养的方法，其中步骤(1)中，所述的大鼠阴道上皮细胞分离并收集自大鼠，或者来自前次大鼠阴道类器官培养得到。

16、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的培养基进行大鼠阴道类器官培养的方法，其中步骤(2)中，培养的温度为35-38℃，培养的时间为8-10天。

17、在一种优选的实施方案中，本发明提供一种利用如上所述的培养基进行大鼠阴道类器官培养的方法，其中所述的方法还包括如下步骤：

18、(3)将培养得到的大鼠阴道类器官与细胞冻存液混合后进行冻存；

19、(4)将冻存的大鼠阴道类器官融化后与含胎牛血清的基础培养基混合进行重悬，以进行大鼠阴道类器官的复苏。

20、本发明的有益效果在于，利用本发明的培养基及培养方法，能够高密度、可多次传代、易于冻存和复苏的进行大鼠阴道类器官的培养。

21、本发明实现了大鼠阴道类器官传代、复苏冻存等，不仅解决了原代阴道上皮细胞无法继代的问题，也解决了肿瘤转化细胞系存在异质性等问题。该方法可复制性强，能够进行扩大化培养。

22、本发明从大鼠阴道组织分离单细胞，对培养基进行优化后培养，构建出与原始阴道组织具有相同的上皮特异性的大鼠阴道类器官。利用该培养基培养获得的大鼠阴道类器官，将对人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒等性传播病原体传播、感染机制研究；阴道微生物群与阴道上皮的相互作用及菌群异常引起的各种类型阴道炎的致病机制研究；阴道癌致病机制等研究；以及阴道用冲洗液、益生菌制剂、药物等阴道用制剂或药物的安全性和有效性评估等具有重要意义。

23、本发明的有益效果具体体现在：

24、(1)本发明的培养基配方可安全、高效地实现大鼠阴道类器官培养。本发明以dmem/f-12为基础培养基，添加促进细胞增殖、维持细胞干性和抑制细胞凋亡的成分，可有效地维持大鼠阴道类器官增殖活性和长期生存能力。

25、(2)本发明的大鼠阴道类器官培养方法可简单高效地实现大鼠阴道类器官的传代、冻存、复苏，培养方法流程简单，可复制性强，不仅解决了原代阴道上皮细胞不能继代培养的问题，也轻松实现了大鼠阴道类器官的扩大化培养。

26、(3)本发明培养的大鼠阴道类器官与大鼠阴道组织生物学特性高度相似。本发明培养的大鼠阴道类器官中阴道上皮标志角蛋白krt5/8和krt15、干细胞维持标志物tp63和增殖标志物ki67的表达模式与体内阴道组织一致，解决了肿瘤转化细胞系存在异质性的问题。