一种光驱合成蔗糖和肉桂酸的聚球藻7942工程菌的构建方法

本发明涉及工业微生物，具体为一种光驱合成蔗糖和肉桂酸的聚球藻7942工程菌的构建方法。

背景技术：

1、反式肉桂酸（trans-cinnamic acid, tca）是植物中的一种主要酚类化合物，是多种多酚（例如二苯乙烯和类黄酮）的前体，分子式为c9h8o2。许多研究报道反式肉桂酸具有广泛的生物活性，包括抗氧化和抗菌活性，并且在食品和化妆品应用中也具有很高的潜力。反式肉桂酸可以从植物中分离，然而由于环境和地理条件难以优化，该方法尚未克服产量低的问题。反式肉桂酸还可以通过有机化学合成方法合成：乙酸酐和苯甲醛在乙酸钠存在下进行缩合反应。尽管迄今为止化学合成法占反式肉桂酸生产的最大部分，但它是一个能源密集型且非绿色的过程，因为它需要高温条件和化石资源。生物合成是一种非常有前途的替代传统从天然来源提取或化学合成的方法，其中蓝细菌作为一个绿色生产平台，已经被使用从co2生产反式肉桂酸。

2、蔗糖是一种二糖，是由葡萄糖和果糖亚基组成。它是在植物中天然产生的，分子式为c12h22o11，蔗糖通常是从甘蔗或甜菜中提取和精制，是食品工业和生物乙醇生产的重要原料。近年来，全球食品中的糖价上涨且波动较大，部分原因是生物燃料生产需求有所增加。而在异养菌生产生物燃料的工业过程中，提供碳和能源的糖类碳水化合物就占成本的一大部分（≤60%）。蓝细菌作为支持工业发酵过程的碳水化合物的替代供应而引起了许多关注。相对于倾向于以脂质或淀粉形式储存过量碳的微藻，蓝细菌通常在高盐环境或其他环境下以多糖和蔗糖作为相容性溶质（渗透剂）积累碳储备。对各种蓝细菌菌株的研究表明，超过60种蓝细菌菌株在能在高盐条件下积累蔗糖。

3、蓝细菌作为一种光合原核生物，已被提议作为生产生物燃料类化合物或工业原料的替代来源。到目前为止，蓝细菌已经被改造来生物合成各类不同的产品，包括乙醇、丁醇、乳酸、乙烯、异丙醇、酶和糖类等。蓝细菌只需要光能，水，和少量营养物质就可以直接将co2转化为增值产品，而无需像异养菌一样额外添加昂贵的碳水化合物，实现了可持续的绿色合成。与植物相比，蓝细菌可以耐受许多不适合农业的水源，减少了它们与粮食作物对有限的耕地和水源的竞争，且光合效率比植物高出一个数量级。而目前对于蓝细菌生物合成化学品的研究中，仅局限于生产单一化合物，还没有出现同时生产蔗糖与反式肉桂酸的研究。

4、因此，提供一种光驱合成蔗糖和肉桂酸的聚球藻7942工程菌的构建方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有的缺陷而提供的一种光驱合成蔗糖和肉桂酸的聚球藻7942工程菌的构建方法，能够仅依靠光照和co2，就能实现蔗糖和反式肉桂酸的同时生物合成。

2、实现上述目的的技术方案是：

3、一种光驱合成蔗糖和肉桂酸的聚球藻7942工程菌的构建方法，包括：

4、步骤s1，以质粒puc-tho为模板扩增得到茶碱诱导型启动子ptho；

5、步骤s2，以集胞藻6803基因组为模板扩增得到强启动子pcpc560；

6、步骤s3，以质粒puc-pal为模板扩增得到拟南芥苯丙氨酸裂解酶基因pal；

7、步骤s4，以质粒puc-cscb为模板扩增得到大肠杆菌w蔗糖转运蛋白基因cscb；

8、步骤s5，以整合型质粒pcp3031为模板扩增得到终止子trbcl；

9、步骤s6，将强启动子pcpc560、拟南芥苯丙氨酸裂解酶基因pal、终止子trbcl进行融合，并与表达载体psi-spe进行连接，将形成的重组表达载体1转入聚球藻7942中，得到可生产反式肉桂酸的菌株7942-pal；

10、步骤s7，将茶碱诱导型启动子ptho、大肠杆菌w蔗糖转运蛋白基因cscb、终止子trbcl进行融合，并与表达载体psⅱ-cm进行连接，形成的重组表达载体2转入可生产反式肉桂酸的菌株7942-pal中，即可得到光驱合成蔗糖和反式肉桂酸的菌株7942-cp。

11、优选的，所述步骤s1中，质粒puc-tho是由茶碱诱导型启动子ptho核苷酸序列进行合成的；

12、所述步骤s3中，质粒puc-pal是由拟南芥苯丙氨酸裂解酶基因pal核苷酸序列进行合成的；

13、所述步骤s4中，质粒puc-cscb是由大肠杆菌w蔗糖转运蛋白基因cscb进行合成的；

14、所述步骤s6中，表达载体psi-spe是用于聚球藻7942的整合型质粒，整合位点为中性位点nsi；

15、所述步骤s7中，表达载体psⅱ-cm是用于聚球藻7942的整合型质粒，整合位点为中性位点nsⅱ。

16、优选的，所述步骤s6包括：

17、步骤s61，将强启动子pcpc560片段、拟南芥苯丙氨酸裂解酶基因pal片段、终止子trbcl片段进行融合pcr得到融合片段1；

18、步骤s62，以表达载体psi-spe为模板，进行反向pcr，得到骨架片段1；

19、步骤s63，将融合片段1与骨架片段1进行平末端连接，得到重组表达载体1；

20、步骤s64，将重组表达载体1转入聚球藻7942中，进而获得可生产反式肉桂酸的菌株7942-pal。

21、优选的，所述步骤s64包括：

22、步骤s641，首先将聚球藻7942接种于bg-11液体培养基中，在37℃光照恒温摇床中，以160rpm转速，光强100μmol photons m-2 s-1培养至od750约为0.5；

23、步骤s642，将带有prl443和prl623的大肠杆菌hb101以及带有重组表达载体1的大肠杆菌在37℃恒温摇床中培养至od630约为0.4；

24、步骤s643，使用lb培养基洗涤带有prl443和prl623的大肠杆菌hb101以及带有重组表达载体1的大肠杆菌，以至洗去抗生素；

25、步骤s644，用100 µl lb培养基重悬，并将带有prl443和prl623的大肠杆菌hb101以及带有重组表达载体1的大肠杆菌两者混合，在37℃静置孵育30 min；

26、步骤s645，取5 ml培养好的聚球藻7942以6000 rpm离心去上清，并用200 µl bg-11液体培养基重悬菌体，与孵育好的大肠杆菌混合物混合，在37℃光照下静置孵育30 min；

27、步骤s646，将混合菌液平铺于覆盖有0.45μm纤维素滤膜的含有5%lb液体培养基的bg-11固体培养基上；

28、步骤s647，在37℃光照下静置培养24 h后，将纤维膜转移到具有相应抗性的bg-11固体培养基上，继续在37℃光照下静置培养，一周左右出现单菌落，筛选阳性转化子，获得可生产反式肉桂酸的菌株7942-pal。

29、优选的，所述步骤s645中，bg-11液体培养基是由1.5g的nano3，0.04g的k2hpo4·3h2o，0.075g的mgso4·7h2o，0.001g的edta，0.02g的na2co3，2.86g的h3bo3，1.81g的mncl2·4h2o，0.222g的znso4·7h2o，0.390g的namoo4·5h2o，0.079g的cuso4·5h2o，0.0494g的co(no3)2·6h2o，0.036g的cacl2·2h2o，0.006g的柠檬酸铁铵，加水至1l制成。

30、优选的，所述步骤s647中，bg-11固体培养基是由1.5g的nano3，0.04g的k2hpo4·3h2o，0.075g的mgso4·7h2o，0.001g的edta，0.02g的na2co3，2.86g的h3bo3，1.81g的mncl2·4h2o，0.222g的znso4·7h2o，0.390g的namoo4·5h2o，0.079g的cuso4·5h2o，0.0494g的co(no3)2·6h2o，0.036g的cacl2·2h2o，0.006g的柠檬酸铁铵，15g的琼脂，2.29g的tes，3g的na2s2o3，加水至1l制成。

31、优选的，所述步骤s7包括：

32、步骤s71，将茶碱诱导型启动子ptho片段、大肠杆菌w蔗糖转运蛋白基因cscb片段、终止子trbcl片段进行融合pcr得到融合片段2；

33、步骤s72，以表达载体psⅱ-cm为模板，进行反向pcr，得到骨架片段2；

34、步骤s73，将融合片段2与骨架片段2进行平末端连接，得到重组表达载体2；

35、步骤s74，将重组表达载体2转入获得的可生产反式肉桂酸的菌株7942-pal中，筛选阳性转化子获得光驱生产蔗糖和反式肉桂酸的菌株7942-cp。

36、本发明的有益效果是：本发明通过能够在获得的光照条件下，仅利用co2就能通过将强启动子pcpc560、拟南芥苯丙氨酸裂解酶基因pal、终止子trbcl进行融合，并与表达载体psi-spe进行连接，将形成的重组表达载体1转入聚球藻7942中，得到可生产反式肉桂酸的菌株7942-pal；将茶碱诱导型启动子ptho、大肠杆菌w蔗糖转运蛋白基因cscb、终止子trbcl进行融合，并与表达载体psⅱ-cm进行连接，形成的重组表达载体2转入可生产反式肉桂酸的菌株7942-pal中，即可得到光驱合成蔗糖和反式肉桂酸的菌株7942-cp；本发明菌株7942-cp基因工程菌能够仅依靠光照和co2，就能实现蔗糖和反式肉桂酸的同时生物合成。