一种敲低USP2基因抑制果蝇巨噬细胞吞噬功能的方法

本发明涉及细胞生物，具体涉及一种敲低usp2基因抑制果蝇巨噬细胞吞噬功能的方法。

背景技术：

1、果绳作为经典的模式生物己经应用到生命科学的各个领域，如在免疫学、遗传学、发育生物学及神经生物学等学科的研究工作多次获得诺贝尔奖。以果蝇为模式生物开展生物科学及医学的研究具有很大优势及意义。果蝇缺乏类似哺乳动物的获得性免疫系统，因此抵抗外来病原微生物的入侵主要依靠天然免疫系统(先天免疫系统)。前人的研究表明果蝇体内的细胞免疫主要依赖于果蝇的3种细胞：浆细胞(plasmatocytes)、晶细胞(crystalcells)和薄层细胞(lamellocytes)。多个课题组的研究发现浆细胞占果蝇幼虫血细胞数目的95％以上。

2、巨噬细胞是哺乳动物体内一种特别重要的细胞，近年来随着研究的深入，巨噬细胞在肿瘤、神经退行性疾病、糖尿病等重大人类疾病中都有着非常重要的生理功能。因此，开展系统性的遗传学分析来研究巨噬细胞的生长调控，对于上述疾病的发生、发展以及治疗有着非常重要的科学与现实意义。前人的研究证明果蝇浆细胞的吞噬作用是清除入侵病原微生物及凋亡细胞所必须的。重要的是，国内外同行都认为果蝇的浆细胞，是由果蝇造血细胞分化而来的吞噬细胞，负责识别并吞噬入侵的病原微生物和发育过程中产生的凋亡细胞。因此，运用果蝇浆细胞(果蝇巨噬细胞)为模型，借助果蝇强大的遗传学操作优势，在研究调控巨噬细胞的生长、分化的关键基因并且阐释其生理功能对于后续研究哺乳动物的巨噬细胞生长、分化以及在疾病的生理意义有着非常重要的参考意义。

3、随着果蝇巨噬细胞在免疫学研究中的广泛应用，虽然已有通过显微注射细菌的方式检测巨噬细胞的吞噬能力，但目前的检测方法较为复杂且需要昂贵的设备和成熟的技术支撑，且细菌的使用对于果蝇安全存在一定的风险。因此亟需建立一种既简单又经济实用的检测方法用于果蝇巨噬细胞吞噬功能的检测。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种敲低usp2基因抑制果蝇巨噬细胞吞噬功能的方法；本发明的目的之二在于提供一段用于敲低果蝇usp2基因的核苷酸序列；本发明的目的之三在于提供所述的核苷酸序列在抑制果蝇巨噬细胞吞噬功能中的应用。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、一种敲低usp2基因抑制果蝇巨噬细胞吞噬功能的方法，包含如下步骤：

4、a)基于果蝇usp2基因，设计合成一对寡核苷酸序列：

5、usp2rnai-f:ctagcagtgctatgattcacctacgtacatagttatattcaagcatatgtacgtaggtgaatcatagcgcg(seq id no.1)；

6、usp2rnai-r:aattcgcgctatgattcacctacgtacatatgcttgaatataactatgtacgtaggtgaatcatagcactg(seq id no.2)；

7、b)将寡核苷酸序列经过退火后与puast-attb质粒载体连接，构建转基因质粒puast-attb-usp2rnai；

8、c)将转基因质粒puast-attb-usp2rnai注入果蝇的受精卵的尾部，并放在25℃的湿盒中培养；所得的受精卵孵化的幼虫待其羽化成成虫后与野生型果蝇杂交，挑取子代眼色为红色的果蝇即为带有puast-attb-usp2rnai的转基因果蝇；

9、d)将步骤c得到的转基因果蝇与双平衡子果蝇sp/cyo；tm3/tm6b杂交一代后自交，筛选得到可稳定遗传的uas-usp2rnai果蝇；

10、e)将uas-usp2rnai果蝇与基因型为hml-gal4,uas-gfp果蝇杂交，即可得到果蝇巨噬细胞中usp2基因敲低的果蝇hml-gal4,uas-gfp/uas-usp2rnai。

11、具体的，步骤a中，所述果蝇usp2基因的ncbi gene id为33132。

12、具体的，步骤c中，将转基因质粒puast-attb-usp2rnai注入y,v；attp2果蝇的受精卵的尾部。

13、具体的，步骤f中，1、所述表征果蝇巨噬细胞吞噬功能的方法，包含如下制备步骤：

14、(1)果蝇幼虫的收集

15、取产卵后110-120小时的三龄果蝇幼虫，用ringer solution缓冲液清洗，去除虫体表皮上的食物残渣后，用滤纸吸干虫体表皮的缓冲液；

16、(2)巨噬细胞的提取和培养

17、将步骤(1)收集的果蝇幼虫转移到盛有schneider培养基的解剖皿中，在体式显微镜观察下，用镊子从虫体后背侧小心撕开表皮，使巨噬细胞释放至schneider培养基中，避免损伤肠道和脂肪体，每组重复5只幼虫；将巨噬细胞转移至细胞爬片上，并在玻片培养室25℃下培养30分钟；

18、(3)巨噬细胞吞噬功能检测

19、1)取dsred标记的乳胶珠按体积比1∶10加入胎牛血清中，在25℃条件下孵育1小时，得到乳胶珠血清混合液；

20、2)取步骤a中的乳胶珠血清混合液加入schneider培养基中按体积比1∶1000进行稀释；

21、3)小心吸弃步骤(2)培养室中的原始培养基，向每个培养室中加入300μl步骤b稀释好的含乳胶珠和胎牛血清的schneider培养基，25℃条件下培养2小时；

22、4)用ringer solution缓冲液清洗；

23、5)用4％pfa固定巨噬细胞30分钟，并用ringer solution缓冲液清洗；

24、6)用dapi染料室温孵育20分钟，使用ringer solution缓冲液清洗；

25、7)封片，用显微镜观察计数所述果蝇巨噬细胞吞噬乳胶珠的情况。

26、进一步的，所述ringer solution缓冲液的配置方法如下：称取氯化钠80g，磷酸氢二钠32.3g，氯化钾2g，磷酸二氢钠2.7g加入试剂瓶中，用双蒸水定容至1l，按体积比1∶10稀释后使用。

27、进一步的，所述乳胶珠的直径大小为1μm。

28、进一步的，步骤4)、5)和6)中，所述ringer solution缓冲液清洗为使用ringersolution缓冲液清洗6次，每次5分钟。

29、2、用于敲低果蝇usp2基因的核苷酸序列，其核苷酸序列为seq id no.1和seq idno.2所示的序列退火形成的双链dna序列。

30、3、所述的核苷酸序列在抑制果蝇巨噬细胞吞噬功能中的应用。

31、本发明的有益效果在于：本发明公开了一种敲低usp2基因抑制果蝇巨噬细胞吞噬功能的方法，属于细胞生物技术领域，本发明通过筛选得到一种影响果蝇巨噬细胞吞噬功能的usp2基因，在果蝇在降低usp2基因的表达量，可以抑制果蝇巨噬细胞的吞噬作用，usp2基因可用于转基因果蝇巨噬细胞功能的研究，对于进一步认识免疫细胞的功能和疾病的发生机制提供新的思路，本发明还提供了一种研究果蝇巨噬细胞吞噬功能的简单、可行的检测方法，使得在研究过程中对巨噬细胞功能的检测更为方便有助于提高对免疫相关疾病的诊断和治疗。