Paucimannose特异性抗体的制备以及检测试剂盒的制作方法

本发明属于免疫学领域，具体涉及具体涉及到paucimannose特异性抗体的制备以及检测试剂盒。

背景技术：

1、蛋白质n-糖基化是将寡糖链共价连接到新生肽链的特定天冬酰胺位点。根据添加寡糖链的不同，n-糖基化可以分为高甘露糖型，复合型，杂合型以及paucimannose型，前三种是典型的n-糖基化结构，而paucimannose型是一种研究较少的n-糖基化类型，近年来受到越来越多的关注。与典型的n-糖基化修饰不同，paucimannose修饰形成了一类独特的n-糖链，由两个n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)，1-3个甘露糖(man)，0-1个岩藻糖(fuc)以特定连接方式结合形成的少甘露糖型n-糖基化结构，该类糖链修饰的糖蛋白称为pmp(paucimannosidic protein)。各项研究汇总表明，m2f糖型在人类paucimannose中占主导地位。

2、paucimannose在人类先天免疫系统、感染过程，细胞发育以及人类癌症等生理过程中都发挥重要作用。有研究发现paucimannose糖基化对正常中性粒细胞的成熟和发挥功能很重要，而paucimannose糖基化失调会导致先天免疫系统受损，并因此导致个体对炎症和感染的抵抗力降低。此外，其他免疫细胞也有表达pmp的潜力，例如，人巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和其他血细胞。paucimannose与不同疾病的炎症和感染有关。最近一项描述与结核病相关的分子糖基化特征的研究显示，在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞和细胞膜衍生微粒中，pmp表现出高表达，尤其是携带m2f的糖蛋白。另外据robajac等人在2016的报道，他们在子痫前期患者的胎盘中也发现了pmp的高表达，这些患者伴有内皮功能障碍和炎症。此外，病原体感染的人痰液(富含中性粒细胞的体液)的n-糖蛋白也发现了中性粒细胞来源的18种富含m2和m2f型paucimannose的pmp。paucimannose也与人类非癌症细胞的细胞发育、增殖和干细胞分化有关。例如satomaa和zipser分别在胚胎干细胞和人类神经干细胞发现富含pmp，此外，parker等人使用先进的质谱法检测了大鼠和小鼠脑部完整的n-糖基化，发现paucimannose是大鼠脑和小鼠突触体的一个关键特征，这表明哺乳动物中枢神经系统中也有pmp存在并且可能发挥重要功能。随着糖组学和糖蛋白质组学技术的快速发展，paucimannose也被发现与各种人类癌症相关。morten等人通过高分辨率的质谱对不同癌症类型和亚型的病变组织进行检测，将获得的n-糖组学lc-ms/ms数据以及pgc-lc-ms/ms数据进行统计学分析，发现包括结直肠癌、乳房癌、前列腺癌、肝癌、淋巴细胞性白血病等癌症组织中都测到了paucimannose，而在健康人体的这些组织中，没有或只微量检测到了paucimannose。此外，对同一种癌症的不同发展阶段进行组织检测，发现paucimannose的含量也有差异性，以上证据表明，paucimannose是人类癌症的重要特征。

3、paucimannose与人体的免疫系统、感染过程，细胞发育甚至肿瘤的形成都有一定的关系，被认为是上述生理与病理发生的生物标志物。目前pmp还没有良好的临床检测手段，虽然通过糖组学的手段可以检测出paucimannose糖链的含量，但该方法存在着检测周期长、成本高、操作复杂、无特异性等缺点。研究报道的一种特异性识别两种paucimannose生物标记物的抗体在制备体外诊断paucimannose相关疾病提供了一个新的突破口。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种paucimannose特异性抗体，其特征在于：所述抗体，包括m2f-asn-fmoc和m3f-asn-fmoc两种paucimannose生物标记物与载体蛋白klh连接形成糖缀合物进行免疫学试验产生。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种paucimannose特异性抗体的制备方法：所述抗体的免疫学刺激产生方法，包括，

5、s1、将m2f-asn-fmoc和m3f-asn-fmoc溶于dmf溶液中，制得混合物；

6、s2、将混合物溶于磷酸盐缓冲液/dmf混合溶剂中，加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯dsg，得到m2f-asn-dsg和m3f-asn-dsg；

7、s3、向反应容器内加入0.1m ph 8.0磷酸盐缓冲液溶解混合物，紧接着加入载体蛋白klh，得到糖缀合物m2f-asn-dsg-klh和m3f-asn-dsg-klh；

8、s4、将s3反应混合物经过葡聚糖凝胶柱脱盐纯化得到paucimannose生物标记物与载体蛋白连接形成的糖缀合物m2f-asn-dsg-klh和m3f-asn-dsg-klh，免疫试验产生特异性识别生物标记物的抗体。

9、作为本发明所述抗体的一种优选方案，包括：所述s1中制得混合物，dmf溶液含有10％的哌啶，在室温条件下，反应1h，脱掉fmoc基团。

10、作为本发明所述抗体的一种优选方案，包括：所述s2中通过减压旋蒸除掉反应混合物的溶剂，将混合物溶于0.1m ph8.0磷酸盐缓冲液/dmf(1：4，v/v)混合溶剂中，加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯dsg，其与糖链的摩尔比为15：1，在室温下反应3～6h得到m2f-asn-dsg和m3f-asn-dsg。

11、作为本发明所述抗体的一种优选方案，包括：所述s3中通过减压旋蒸除去s2的反应混合物溶剂，向反应容器内加入0.1m ph 8.0磷酸盐缓冲液溶解混合物，紧接着加入与糖链摩尔比为1：30的载体蛋白klh，在室温条件下缓慢搅拌反应2.5～3d得到糖缀合物m2f-asn-dsg-klh和m3f-asn-dsg-klh。

12、作为本发明所述抗体的一种优选方案，包括：所述脱盐纯化通过sephadex g-50、sephadex g-25分子排阻层析分离和deae sephadexa-25阴离子交换柱分离。

13、作为本发明所述抗体的一种优选方案，其中：所述抗体可以特异性识别并结合paucimannose生物标记物。

14、本发明的第二个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种检测paucimannose在样品中是否存在的检测方法和试剂盒。

15、作为本发明所述试剂盒的一种优选方案，其中：所述抗体带有可检测的标记。

16、作为本发明所述试剂盒的一种优选方案，其中：所述试剂盒包含第二抗体，其特异性识别本发明的抗体。

17、作为本发明所述试剂盒的一种优选方案，其中：所述第二抗体带有可检测的标记。

18、作为本发明所述试剂盒的一种优选方案，其中：所述可检测标记可以是可通过荧光、光学、免疫学、光谱、化学等手段检测的任何物质。特别优选的此类标记物能够适用于免疫学检测(例如，荧光免疫法测定、酶联免疫法测定、化学发光免疫法测定法等)。这类标记物是本领域熟知的，包括但不限于，荧光染料(例如，荧光素、藻红蛋白(pe)、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、罗丹明)、发光物质(例如化学发光物质吖啶脂类化合物)、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，荧光标记物可以用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物，通过检测酶与底物反应得到的产物来检测。在某些实施方案中，可通过不同长度的连接物，将上述可检测的标记连接到本发明的抗体，以降低其潜在的空间位阻。

19、另一方面，本发明提供了检测样本中paucimannose生物标记物的方法，其包括本发明抗体的使用步骤。在一个优选实验方案中，本发明的抗体带有可以检测的标记物。在另一个优选的方案中，使用带有可以检测标记的试剂检测本发明的抗体。所述检测方法可用于诊断的目的，或者非诊断的目的(例如，某些细胞或蛋白样品，而非患者)。

20、本发明的第三个目的是，克服现有技术中的不足，提供所述抗体在制备体外诊断paucimannose相关疾病试剂盒中的应用。

21、本发明的有益效果：

22、本发明的抗体，能够特异性识别并结合paucimannose生物标记物，本发明的抗体具有重大的临床应用价值。