一种用于林麝香腺原代细胞的培养基及其应用的制作方法

本技术涉及细胞培养，尤其是涉及一种用于林麝香腺原代细胞的培养基及其应用。

背景技术：

1、林麝是一种生活在亚洲的小型哺乳动物，属于麝科，通常栖息在森林或山地地区，以草、叶、果实和昆虫为食。研究发现，雄性林麝体内的香腺上皮细胞能够分泌香腺素-麝香。麝香具有开窍醒神、活血通络、消肿止痛等功效，用于治疗热病神昏、中风痰厥、痛肿瘰疬、跌扑伤痛等常见病、多发病和疑难病症，已有2000多年悠久的药用历史，对中华民族医疗保健发挥了长期、巨大的作用。然而，天然麝香的产量极低，每头雄性林麝每年只能产15克左右，因此麝香极其珍贵。

2、为了满足市场对麝香的需求，研究人员正在积极寻求通过细胞培养技术体外培养获取麝香的方法。细胞培养技术是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法，在培养的过程中，培养物是单个细胞或细胞群。通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢等分子机制。

3、然而林麝香腺原代细胞珍贵且难以采集，对细胞培养基的要求较高，故利用细胞培养技术对林麝的研究相对较少。但目前常用的细胞培养技术并不适于林麝香腺细胞的长期生长和繁殖，严重阻碍了对于林麝的研究。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本技术提供了一种用于培养林麝香腺原代细胞的培养基，采用该培养基对林麝香腺原代细胞进行培养时，能使林麝香腺原代细胞的生长、增殖速度快，细胞活力高，且在传代过程中能够很好地保持干细胞特性。

2、为此，本技术第一方面提供了一种用于林麝香腺原代细胞的培养基，所述培养基以dmem和f12的混合培养基为基础培养基，且包含如下组分：0.1～1.0mg/ml的酪蛋白、1.0～2.0μg/ml的转铁蛋白、0.1～0.5mmol/l的维生素a、15～35μmol/l的抗氧化剂、0.1～1.0mmol/ml的谷氨酰胺、30～70ng/ml的生长因子、80～120ng/ml的氢化可的松、5～15v/v％的胎牛血清、1～15μg/ml的胰岛素和1.5～2.0mmol/ml的氯化钙。

3、本技术中的基础培养基采用dmem和f12的混合培养基，dmem和f12混合的体积比可以为1:1，通过在基础培养基中添加特定浓度的上述各功能性添加物，进而制得能使林麝香腺原代细胞的生长、增殖速度快，细胞活力高，且在传代过程中能够很好地保持干细胞特性的培养基。

4、具体地，酪蛋白能够为细胞生长提供必需的氨基酸和能量等，且在细胞培养过程中，酪蛋白可以支持细胞的黏附和增殖，促进细胞的生长和分化，同时酪蛋白还有助于维持培养基的酸碱平衡，保证细胞的正常生长和代谢；转铁蛋白能够结合并转运铁离子，将其有效地传递给细胞，满足细胞对铁元素的需求，同时转铁蛋白还具有一定的抗氧化作用，能够培养基中的抗氧化剂共同作用，进而有效清除细胞内的自由基，保护细胞免受氧化应激损害，提高细胞对各种环境压力的抵抗力；维生素a可以促进细胞的生长和分化，促进细胞膜的合成和细胞器的发育，从而维持细胞的正常生理功能，提高细胞的生长速度和存活率；谷氨酰胺可以提供细胞生长所需的氮源和碳源，同时参与细胞代谢过程，维持细胞内外渗透压平衡，促进细胞生长和增殖；生长因子是一类多肽物质，通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，促进细胞生长和增殖，诱导细胞分化和维持细胞存活；氢化可的松是一种常用的细胞培养基添加剂，它可以模拟体内激素环境，提供细胞生长所需的激素支持，并促进细胞代谢和蛋白质合成，有利于细胞的生长和分裂；胎牛血清可以提供细胞生长所需的营养物质、生长因子和激素等，促进细胞增殖和分化；氯化钙可以促进细胞黏附和生长，它能够与培养基中的其他成分协同作用，提供细胞所需的离子环境和渗透压，从而支持细胞的正常生理活动和增殖；胰岛素能够促进哺乳动物细胞的生长和分化、延缓细胞衰老、促进糖原、脂肪和蛋白质的合成。

5、本技术中添加的胰岛素可以为牛胰岛素，牛与林麝属于同科，添加牛胰岛素更利于林麝香腺原代细胞的生长。

6、在一些具体的实施例中，所述培养基中胰岛素的含量例如可以为1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml或15μg/ml等。

7、在一些优选的实施方式中，所述培养基中胰岛素的含量为3～8μg/ml。

8、在一些更优选的实施方式中，所述培养基中胰岛素的含量为5μg/ml。

9、本技术的发明人通过研究发现，培养基的胰岛素的含量会对林麝香腺原代细胞增殖、细胞活力和干细胞特性均有影响。本技术的发明人通过优化和调整培养基的胰岛素的含量，能使培养的林麝香腺原代细胞增殖速度更快、细胞活力更好，同时保持良好的干细胞特性。

10、在一些实施方式中，所述抗氧化剂选自2-巯基乙醇、谷胱甘肽和维生素e中的至少一种。

11、本技术中，抗氧化剂2-巯基乙醇、谷胱甘肽和维生素e均能够有效清除培养基中的过氧化物和其他潜在的有害氧化剂，这些氧化剂可能对细胞生长和细胞功能产生负面影响。通过清除这些氧化剂，2-巯基乙醇有助于维持细胞培养环境的稳定性，保护细胞免受氧化应激损害，从而支持细胞的正常生长和增殖。

12、在一些实施方式中，所述抗氧化剂为2-巯基乙醇、谷胱甘肽和维生素e的混合物，且混合物中2-巯基乙醇、谷胱甘肽和维生素e的质量比为(2～5):(1～3):1。

13、在一些优选的实施方式中，所述抗氧化剂为2-巯基乙醇、谷胱甘肽和维生素e的混合物，且混合物中2-巯基乙醇、谷胱甘肽和维生素e的质量比为4:2:1。

14、本技术的发明人通过研究发现，选用2-巯基乙醇、谷胱甘肽和维生素e的混合物作为抗氧化剂，三者之间能够发挥协同促进作用，能使抗氧化剂的抗氧化能力更优。

15、在一些实施方式中，所述生长因子选自hegf、igf、fgf和pdgf中的至少一种。

16、人表皮生长因子(hegf)和血小板源性生长因子(pdgf)能够刺激细胞增殖和迁移，成纤维细胞生长因子(fgf)有助于促进血管生成和细胞分化，胰岛素样生长因子(igf)能促进细胞的生长和分化。本技术通过在培养基中添加上述生长因子，能使林麝香腺原代细胞高效生长，且保持较好的干细胞特性。

17、在一些实施方式中，所述生长因子为hegf、igf和pdgf的混合物，且混合物中egf、igf和pdgf的质量比为(3～6):(1～2):(0.5～1)。

18、在一些优选的实施方式中，所述生长因子为hegf、igf和pdgf的混合物，且混合物中egf、igf和pdgf的质量比为5:1:0.5。

19、本技术的发明人通过研究发现，选用hegf、igf和pdgf的混合物作为生长因子，三者之间能够发挥协同促进作用，能使生长因子的促生长能力更优。

20、在一些实施方式中，所述培养基中还包含0.001～0.02μg/ml的硫酸锌、0.001～0.01μg/ml的硫酸铜和0.001～0.01μg/ml的硒酸钠。

21、本技术中所添加的硫酸锌、硫酸铜和硒酸钠均属于微量元素；锌是许多酶的组成部分，对细胞分裂和dna合成至关重要，可以增强细胞的代谢活性；硒具有抗氧化作用，可以保护细胞免受氧化应激损害，从而维持细胞的正常功能；铜对细胞活力也能产生积极影响，参与能量代谢和抗氧化过程。本技术通过在细胞培养基中进一步添加上述微量元素能够进一步提升培养基对林麝香腺原代细胞的培养效果。

22、本技术第二方面提供了一种如本技术第一方面所述的培养基在培养林麝香腺原代细胞中的应用。

23、本技术所提供的培养基通过在基础培养基中添加特定浓度的各功能性添加物，能使林麝香腺原代细胞的生长、增殖速度快，细胞活力高，且在传代过程中能够很好地保持干细胞特性，因此能较好地应用在林麝香腺原代细胞的培养中。

24、在一些实施方式中，所述培养的方法包括：将所述林麝香腺原代细胞接种于所述培养基中，然后在36～38℃、4.5～5.5％ co2的饱和湿度条件下培养所述林麝香腺原代细胞。

25、在一些具体实施方式中，培养条件可以为在37℃、5％ co2的饱和湿度条件下进行培养，培养过程中，可以每隔48h更换一次新鲜培养基。

26、在一些实施方式中，所述林麝香腺原代细胞在培养基中的接种密度为(2～8)×105个/ml。

27、在一些具体实施方式中，所述林麝香腺原代细胞在培养基中的接种密度为5×105个/ml。本技术通过将细胞的接种密度控制在上述范围内，更利于细胞的生长。

28、本技术的有益技术效果为：本技术所提供的用于培养林麝香腺原代细胞的培养基添加有特定浓度的功能性添加物，如维生素a、抗氧化剂、生长因子、氯化钙和胰岛素等，通过各功能添加剂的相互配合，使得采用该培养基对林麝香腺原代细胞进行培养时，能使林麝香腺原代细胞的生长、增殖速度快，细胞活力高，且在传代过程中能够很好地保持干细胞特性。同时，通过培养基中进一步引入微量元素硫酸锌、硫酸铜和硒酸钠，进一步提升了该培养基对林麝香腺原代细胞的培养效果，能较好地应用在林麝香腺原代细胞的培养中，应用前景良好。