一种腈水解酶突变体及其在提高2-氯烟酸产量中的应用

(一)本发明涉及酶工程，具体涉及一种来源于赤霉菌的腈水解酶突变体及其在提高2-氯烟酸产量中的应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、2-氯烟酸是精细化工领域的重要中间体，在医药、农药等合成领域应用广泛。在农药合成领域，2-氯烟酸是重要除草剂烟嘧磺隆的合成前体，此外也可用于酰胺类除草剂吡氟草胺、酰胺类杀菌剂啶酰菌胺的合成；在医药领域，2-氯烟酸的应用包括抗抑郁药物米氮平、抗艾滋病药物奈韦拉平、消炎药普拉洛芬以及尼氟灭酸和烟甲灭酸等镇痛药物的合成。

2、目前，2-氯烟酸的主流合成途径为化学法合成，如烟腈氧化-氯化-水解法、烟酸氮氧化-氯化-水解法、烯基醚与氰乙酸乙酯成环法以及3-甲基吡啶氯化-氧化法等。在工业上，2-氯烟酸主要采用以3-氰基吡啶为原料，经氮氧化、氯化、水解来合成。然而，该方法存在酰胺副产物含量高、强酸强碱用量大、设备要求高、反应条件苛刻等缺陷。与传统的化学合成法相比，生物催化具有反应条件温和、催化效率高、环境友好等特点，已成为化学品合成领域的重要途径。因此，开发绿色高效的2-氯烟酸生物合成工艺具有重要意义。

3、腈水解酶(nitrilase,ec 3.5.5.1)属于水解c-n键超家族的成员之一，是一类重要的工业酶，能够催化腈化合物水解生成相应的羧酸。利用腈水解酶催化2-氯烟腈水解是工业合成2-氯烟酸的理想途径，但仍存在产物浓度低等问题。因此，构建一种可高效合成2-氯烟酸的腈水解酶，对于提高其在酶法合成2-氯烟酸的应用具有重要意义。

技术实现思路

0、(三)技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种腈水解酶突变体及其在提高2-氯烟酸产量中的应用，通过运用蛋白质工程的技术来改造来源于赤霉菌(gibberella intermedia)的腈水解酶，以此来提升它的催化效率，从而有利于该腈水解酶在2-氯烟酸工业制备中的应用，解决现有方法中腈水解酶催化2-氯烟腈水解合成2-氯烟酸存在活力低、产物浓度低等问题。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种腈水解酶突变体，所述腈水解酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列第189位、第193位进行单突变或多突变获得的。

4、优选的，所述腈水解酶突变体将seq id no.2所示氨基酸突变为下列之一:(1)第189位的异亮氨酸(i)突变为蛋氨酸(m)，氨基酸序列如seq id no.4所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；(2)第189位的异亮氨酸(i)突变为蛋氨酸(m)，同时第193位的天冬氨酸(n)突变为脯氨酸(p)，氨基酸序列如seq id no.6所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。

5、本发明还涉及所述腈水解酶突变体的编码基因，含所述编码基因的重组载体，所述重组载体构建的重组基因工程菌，所述优选重组载体为pet28a，优选宿主菌e.coli bl21(de3)。

6、本发明还涉及所述腈水解酶突变体在提高2-氯烟酸产量中的应用，所述的应用以含所述腈水解酶突变体编码基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体为生物催化剂，以2-氯烟腈为底物，以ph值6.8-8.0(优选7.2)的缓冲溶液为反应介质构成转化体系，在30-45℃、100-1000rpm(优选30℃，600rpm)条件下进行转化反应，反应完成之后，收集并分离纯化反应产物，得到2-氯烟酸。

7、优选的，所述转化体系中，底物的加入浓度为50-1500mm(优选1200mm)；所述催化剂用量以菌体细胞干重计为1～5g/l(优选2.3g/l)。

8、优选的，所述缓冲液为kh2 po4-k2hpo4缓冲液(pb缓冲液，100mm，ph 7.2)。

9、优选的，所述底物分批加入，所述底物的初始加入浓度为50～300mm(优选300mm)，每隔0.5～2h(优选1.5h)补料50～300mm(优选300mm)，至总加入量为50～1500mm。所述反应时间为5～20h(优选15h)。

10、优选的，所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因的工程菌加入含终浓度50mg/l卡那霉素的lb培养基中，37℃、180r/min培养12h，将培养液以体积浓度2％的接种量转接入含终浓度50mg/l卡那霉素的lb培养基，37℃、180r/min培养至菌体浓度od600为0.4～0.6，加入终浓度为0.1～1mm的iptg(优选0.1mm)，28℃、180r/min诱导培养12h，取培养物4℃，8000rpm，离心10min，去除上清，沉淀即为湿菌体。

11、本发明所述的腈水解酶突变体可被用作完整的工程菌全细胞、未经过提纯的粗酶或是经过一定程度提纯甚至全部提纯的酶蛋白使用。若必要，也可采用此领域的常规固定化方法将其作为固定化酶或者固定化细胞的形式来应用。

12、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

13、本发明提供的腈水解酶突变体出发菌株的腈水解酶具有更高的活性，即使是在利用该酶的粗提液或者工程菌全细胞作为催化剂，酶活依然维持在一个高水平。相对于出发菌株的腈水解酶，本发明腈水解酶突变体的活力提升了1.82倍，产量增加了1.68倍，为工业化酶法合成2-氯烟酸奠定基础。

技术特征：

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体是将seq id no.2所示氨基酸序列第189位、第193位进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述的腈水解酶突变体，其特征在于，所述腈水解酶突变体将seq idno.2所示氨基酸突变为下列之一:(1)第189位的异亮氨酸突变为蛋氨酸；(2)第189位的异亮氨酸突变为蛋氨酸，同时第193位的天冬氨酸突变为脯氨酸。

3.一种含权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在提高2-氯烟酸产量中的应用，其特征在于，所述的应用以含所述腈水解酶突变体编码基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体为生物催化剂，以2-氯烟腈为底物，以ph值6.8-8.0的缓冲溶液为反应介质构成转化体系，在30-45℃、100-1000rpm条件下进行转化反应，反应完成之后，收集并分离纯化反应产物，得到2-氯烟酸。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述转化体系中，底物的加入浓度为50-1500mm；所述催化剂用量以菌体细胞干重计为1～5g/l。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为100mm，ph 7.2的kh2po4-k2hpo4缓冲液。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述底物分批加入，所述底物的初始加入浓度为50～300mm，每隔0.5～2h补料50～300mm，至总加入量为50～1500mm。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因的工程菌加入含终浓度50mg/l卡那霉素的lb培养基中，37℃、180r/min培养12h，将培养液以体积浓度2％的接种量转接入含终浓度50mg/l卡那霉素的lb培养基，37℃、180r/min培养至菌体浓度od600为0.4～0.6，加入终浓度为0.1～1mm的iptg，28℃、180r/min诱导培养12h，取培养物4℃，8000rpm，离心10min，去除上清，沉淀即为湿菌体。

技术总结本发明公开了一种腈水解酶突变体及其在提高2‑氯烟酸产量中的应用，所述腈水解酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第189位、第193位进行单突变或多突变获得的。本发明提供的腈水解酶突变体出发菌株的腈水解酶具有更高的活性，即使是在利用该酶的粗提液或者工程菌全细胞作为催化剂，酶活依然维持在一个高水平。相对于出发菌株的腈水解酶，本发明腈水解酶突变体的活力提升了1.82倍，产量增加了1.68倍，为工业化酶法合成2‑氯烟酸奠定基础。技术研发人员：郑仁朝,章倩云,吴哲明,郑裕国受保护的技术使用者：浙江工业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18