表达H9N2亚型禽流感病毒NA重组蛋白、其制备方法和应用

本发明涉及免疫检测，特别是涉及表达h9n2亚型禽流感病毒na重组蛋白、其制备方法和应用。

背景技术：

1、禽流感病毒(avian influenza virus，aiv)是正粘病毒科a型流感病毒属的一员，由编码10个核心蛋白，和数量可变的辅助蛋白的8个单股负链rna片段包装而成。aiv可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza，hpaiv)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza，lpaiv)。h9n2亚型aiv最早分离于1966年美国威斯康星州。h9n2亚型lpaiv感染不会在禽类中引起明显的临床症状或死亡，但会增加禽类对其他病原微生物的继发感染，而这些病原微生物可能延迟禽类生长和降低产蛋量，增加其死亡率，所以h9n2亚型lpaiv的流行常常导致重大的经济损失。在亚洲，h9n2亚型aiv在家禽中的流行促进了各种新型禽流感病毒的出现和h9亚型禽流感病毒的进化。不仅如此，h9n2亚型aiv可以将内部基因提供给其他亚型aiv，如h5n1、h5n6、h7n9和h10n8，增强它们在哺乳动物中的跨种传播能力和致病性。此外，h9n2亚型流感病毒可以直接感染人。因此，防控h9n2亚型aiv至关重要。

2、h9n2亚型aiv与其他病原体的混合感染往往会增加禽类的发病率和死亡率。因此需要有效的快速的诊断方法去防控h9n2亚型aiv。目前常用于临床诊断aiv的技术主要包括分子生物学及血清学两方面。其中血清学检测可广泛检测aiv抗体，血凝抑制试验是流感病毒常用的血清学检测方法，但其针对的靶蛋白是血凝素(hemagglutinin，ha)，而酶联免疫吸附试验(elisa)操作简易且成本低，是目前常用的血清学检测方法。接种疫苗是预防aiv感染和相关疾病潜在并发症的最佳方法。

3、禽流感病毒是一个高度变异的病原体，不同亚型之间存在巨大的变异性，这增加了针对其制备抗体和临床诊断的难度。分子诊断学通常操作复杂。常用的血清学检测方法酶联免疫吸附试验，特异、简便、可同时测定大量标本，但受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性。因此制备特异性强的抗体最为重要。而现有抗体可能由于不同亚型、突变、重组株之间存在巨大的变异性，出现缺乏足够的特异性和亲和性，从而可能影响其在试验或临床应用中的效果。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种表达h9n2亚型禽流感病毒na重组蛋白，该na重组蛋白经纯化后，其sds-page和westernblotting鉴定结果中除重组na蛋白外，没有明显的杂蛋白，免疫原性好，以此为基础制备得到的抗na蛋白多克隆抗体的特异性良好，为单克隆抗体的制备提供抗原，为疫苗研发和为建立h9n2亚型aiv na蛋白血清学鉴定方法提供帮助。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种表达h9n2亚型禽流感病毒na重组蛋白，该na重组蛋白由na重组质粒诱导表达得到，所述na重组质粒包括编码na的核苷酸序列和表达载体。

3、前期研究表明，神经氨酸酶(neuraminidase,na)作为aiv的第二糖蛋白，占表面糖蛋白的20％，其唾液酸酶活性能促进病毒粒子从感染细胞中释放。此外，na在aiv的感染过程中发挥重要作用，可促进病毒进入上皮细胞，并防止病毒聚集在宿主细胞表面。虽然na会发生抗原漂移，但其抗原漂移的频率要低于ha。因此，在禽流感的防控中，监控aiv的na蛋白具有重要性，现有的流感疫苗的na含量各不相同，有些疫苗的na含量几乎检测不到。因此，本发明人提出利用原核表达系统使目的蛋白——na重组蛋白高效表达，以此na重组蛋白为基础制备得到的抗na蛋白多克隆抗体具有良好的特异性，为单克隆抗体的制备提供了充足、优质的抗原基础，为疫苗研发和为建立h9n2亚型aiv na蛋白血清学鉴定方法提供帮助。

4、可以理解的，上述编码na的核苷酸序列本领域技术人员可由现存的h9n2亚型禽流感病毒毒株提取rna后反转录得到。

5、在其中一个实施例中，所述诱导表达的诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷；

6、所述诱导表达的温度为37℃，所述诱导表达的诱导剂的工作浓度为1.2mmol/l，所述诱导表达的诱导时间为6h。

7、本发明人通过在不同温度、诱导时间和iptg浓度条件下进行表达诱导，摸索重组na蛋白的最佳诱导表达条件。结果显示，浓度在0.2-1.2mmol/l的范围内，不同iptg浓度对诱导表达的影响没有十分显著，但存在轻微的梯度，在浓度为1.2mmol/l时，表达量稍升高且表达量稳定。诱导时间在6h后，延迟诱导表达的时间对蛋白的表达量无明显影响，优化出可高效表达目的蛋白的诱导条件。根据可溶性分析结果，诱导表达得到的重组na蛋白主要是包涵体形式。诱导表达的重组na蛋白经纯化后，其sds-page和westernblotting鉴定结果中除重组na蛋白外，没有明显的杂蛋白，说明在最优诱导表达条件下表达的目的蛋白，经镍柱纯化后，可高效制备出较纯的目的na蛋白。

8、在其中一个实施例中，所述原核表达载体为pet-32a。

9、本发明还提供了所述na重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：将含有所述na重组质粒的菌液接种至培养基，扩增培养，进行诱导表达。

10、在其中一个实施例中，所述诱导表达的诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷；所述诱导表达的温度为35-39℃，所述诱导表达的诱导剂的工作浓度为1.1-1.3mmol/l，所述诱导表达的诱导时间为5.5-6.5h。

11、所述工作浓度为上述诱导剂在使用时能够达到预期效果的浓度，可以理解的，本领域技术人员在配制含有上述诱导剂的产品时，可以配制浓度更高的母液或者储备液，待使用时再稀释，所述母液或者储备液及其浓度均在本发明的保护范围之内。

12、在其中一个实施例中，所述诱导表达的温度为37℃，所述诱导表达的诱导剂的工作浓度为1.2mmol/l，所述诱导表达的诱导时间为6h。

13、在其中一个实施例中，所述制备方法还包括诱导表达后的纯化、复性、浓缩。

14、因诱导表达得到的重组na蛋白主要是包涵体形式，故纯化后的蛋白需要经过复性步骤，恢复蛋白正确的生物学活性。

15、在其中一个实施例中，所述纯化包括：将诱导表达后的菌液进行破碎，收集沉淀，加入裂解液，重悬，进行蛋白纯化，得到纯化重组na蛋白；

16、所述复性包括：将所述纯化重组na蛋白以含尿素的缓冲液进行复性。

17、在其中一个实施例中，所述蛋白纯化采用镍柱进行。

18、在其中一个实施例中，所述镍柱为his标签蛋白纯化介质。

19、在其中一个实施例中，所述复性包括：将所述纯化重组na蛋白以含有梯度浓度尿素的缓冲液进行复性。

20、在其中一个实施例中，所述尿素的浓度分别为6mol/l、4mol/l、2mol/l、1mol/l、0mol/l。

21、本发明还提供了一种禽流感病毒抗体，该禽流感病毒抗体的制备方法包括以下步骤：将所述的na重组蛋白乳化，免疫动物，得到na蛋白多克隆抗体。

22、本发明人通过使用高效表达并纯化的na蛋白，制备得到的抗na蛋白多克隆抗体经western blotting和ifa的验证说明，该多克隆抗体能和h9n2亚型aiv结合，特异性好。间接elisa测得兔抗na蛋白多克隆抗体的效价达到了1∶409600。因此本发明表达的na蛋白，制备的兔抗na蛋白多克隆抗体具有良好的特异性，效价高，为na蛋白的elisa检测方法的建立和疫苗研制提供参考。

23、在其中一个实施例中，所述乳化的乳化剂包括完全弗氏佐剂和/或不完全弗氏佐剂。

24、本发明还提供了一种禽流感病毒试剂盒，包括所述禽流感病毒抗体。

25、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

26、本发明的表达h9n2亚型禽流感病毒na重组蛋白、其制备方法和应用，该制备方法利用原核表达系统，优化诱导表达条件，使目的蛋白高效表达，制备得到的重组na蛋白经纯化后，其sds-page和westernblotting鉴定结果中除重组na蛋白外，没有明显的杂蛋白，说明镍柱纯化na蛋白的效果好。以该重组na蛋白为基础制备得到的抗na蛋白多克隆抗体经westernblotting与ifa验证，可特异性结合h9n2亚型aiv。经间接elisa试验测得抗体效价高达1∶409600。这表明本发明制备得到的na重组蛋白的免疫原性好，制备的抗na蛋白多克隆抗体的特异性良好，为单克隆抗体的制备提供抗原，为疫苗研发和为建立h9n2亚型aivna蛋白血清学鉴定方法提供帮助。