一种用于植入前胚胎单基因缺陷或染色体结构变异检测的单体型构建方法与流程

本发明属于胚胎植入前遗传检测，具体涉及一种用于植入前胚胎单基因缺陷或染色体结构变异检测的单体型构建方法。

背景技术：

1、单基因遗传病是指单个或单对等位基因突变导致身体结构发育或生理功能异常的疾病，一般遵循孟德尔遗传规律，对于常染色体显性遗传疾病的携带者，其子代携带即患病概率为50％；如果夫妻携带同一隐性遗传疾病的变异，则夫妻双方均无疾病表现、但子代有25％的发病风险。目前明确的单基因疾病种类已经超过1万种，由于单基因疾病种类众多，人群总体发病率约为1％，且治疗非常困难，给数千万家庭和患者带来巨大的经济及精神负担。随着分子生物学技术的快速发展以及扩展型携带者筛查技术的应用，越来越多有生育单基因病患儿风险的家庭需要通过辅助生殖技术进行胚胎期的诊断，即pgt-m技术来选择不患病的胚胎进行移植，从而预防缺陷患儿的出生。

2、根据《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》，现有胚胎检测的主要方法是同时进行突变位点的直接分析(sanger测序)和遗传多态位点连锁分析。因此，临床上对于携带单基因疾病的夫妻进行pgt-m通常有两种方法：一是若该家系存在其他的携带者，可以利用携带者的dna样本构建单体型，通过连锁分析的方法进行胚胎阻断，该方法可以避免单独使用sanger测序方法检测胚胎造成的脱扣和假阴性结果；二是若该家系无其他先证者/携带者，如夫妻一方为新发变异且尚未生育、或先证者死亡且未保留样本等情况，可以通过sanger测序找到携带型胚胎作为先证者、再建立单体型进一步明确其他胚胎的携带情况。

3、染色体结构变异是指染色体或染色单体经过断裂-重换或互换机理产生的染色体畸变，基因组平衡的结构变异主要包括染色体罗氏易位、平衡易位和倒位，基因组不平衡的重排还可能导致片段拷贝数增加或减少、即染色体拷贝数变异。染色体结构变异是导致不孕不育和复发性流产的重要原因，也可能导致严重的出生缺陷。例如，染色体平衡易位的人群发病率约为0.27％，在反复自然流产人群中发病率则高达3.81％，不经干预早期流产率可达90％以上；常见的致病性染色体拷贝数变异的人群发病率约为1/600，可能导致早期流产、智力障碍、孤独症和多种先天综合征。对于携带染色体结构变异的夫妻，女性患者可能经历反复的流产和清宫手术，使感染、宫腔粘连等并发症增加，严重影响育龄妇女的生殖健康；若患儿存活、出生，则可能导致严重的出生缺陷，给家庭和社会带来巨大的痛苦和负担。

4、针对染色体结构变异的患者，目前辅助生殖临床上主要通过胚胎植入前遗传学检测pgt-sr技术，筛选患者的染色体整倍体胚胎进行移植以改善妊娠结局，降低由染色体拷贝数异常引起的不良妊娠和出生缺陷问题。对于平衡的染色体结构变异携带者，可以利用携带相同染色体结构变异的父母或不平衡子代(当患者父母染色体均为正常、患者为新发染色体异常时)通过单体型分析技术(haplotype analysis)进行连锁分析明确结构变异染色体的单体型和结构正常染色体的单体型，从而在胚胎中区分出染色体结构正常的胚胎移植，从而避免子代再次经历染色体结构变异带来的生育风险。对于致病性拷贝数变异携带者，且变异属于一代或者二代可检测范围比如小indel及dup、大片段缺失重复，当片段大小>5mb时可以通过胚胎全基因组拷贝数分析检出；但对于片段大小<5mb时，需要利用携带相同染色体结构变异的先证者(父母或患儿、流产物等)通过单体型分析技术结合全基因组拷贝数变异检测在胚胎中准确区分风险染色体并诊断出染色体结构正常的胚胎。

5、根据who的出生缺陷预防策略，出生后的新生儿筛查属于三级预防，虽然可以早期发现出生缺陷，但仍然会给社会和家庭带来沉重负担和痛苦；在孕期通过产检发现出生缺陷是二级预防；而如果在怀孕前预防出生缺陷的发生，是出生缺陷的一级预防。由于单基因病和染色体结构变异在人群中均有较高的发病率，随着分子生物学技术的进步和植入前胚胎遗传学检测的临床应用推广，目前这类家庭在胚胎植入前进行精准诊断的需求逐渐上升，同时也面临更多疑难病例。例如，随着女性生育年龄推迟、现代家庭规模缩小以及携带者筛查技术广泛应用，越来越多的单基因病家系缺乏先证者且可检测胚胎数量少，增加了在胚胎中找到先证者的难度。在这种情况下，由于无法进行连锁分析，单纯采用sanger测序在胚胎中检测单基因疾病可能存在等位基因脱扣风险、降低pgt-m的检测准确性。此外，如果患者合并性腺嵌合、或性染色体连锁单基因病合并性染色体异常(如47，xxx或47，xxy)等情况，将会进一步增加检测风险染色体的难度。对于新发染色体结构变异的患者，如果患者仅获得1枚囊胚、并且经检测为平衡型胚胎时，由于缺少作为参照的不平衡胚胎单体型，则无法确定该胚胎是否为染色体结构正常或平衡携带型，移植该胚胎后生育的新生儿中理论上有50％概率仍为染色体结构变异的携带者，其成年后婚育时仍有与其父母相同的不孕不育、复发性流产等危害生殖健康的风险。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述不足，本发明的目的是提供一种用于植入前胚胎单基因缺陷或染色体结构变异检测的单体型构建方法，解决现有的植入前胚胎遗传学检测技术中无法排除风险染色体或区分结构变异染色体的问题，在不需要额外活检或再次促排卵的基础上，利用预留配子(精子或mi卵子)或停育胚胎(拟行pgt但未能发育到囊胚的胚胎)，通过全基因组snp检测获得与该基因变异或染色体结构变异连锁的单倍体型，建立家系单体型进行胚胎的变异携带情况或结构变异染色体携带情况分析，同时进行全基因组拷贝数变异分析，从而提高植入前胚胎分析的准确性和把握性。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种用于植入前胚胎单基因缺陷或染色体结构变异检测的单体型构建方法，包括以下步骤：

4、步骤一、筛选满足如下条件之一的家系作为对象：

5、(1a)夫妻一方为基因变异携带者且缺乏先证者，需要进行pgt-m且在胚胎中寻找变异携带型胚胎作为胚胎先证者进行连锁分析的家系；

6、(1b)夫妻一方为染色体结构变异携带者，且其为新发结构变异或家系中缺乏相同结构变异的亲代作为参照，需要进行pgt-sr并在胚胎中找到不平衡胚胎为参照进行连锁分析、区分风险染色体，从而区分正常核型和染色体结构变异携带型胚胎的家系；

7、步骤二、采集废弃配子和/或停育胚胎作为样本，包括：对于男方致病基因携带或染色体结构变异携带者，采集单精子；对于女方致病基因携带或染色体结构变异携带者，采集mⅰ卵子；还包括囊胚培养过程中未发育到囊胚的停育胚胎；

8、步骤三、囊胚pgt检测，包括：对囊胚滋养层活检3-5个细胞，活检细胞全基因组扩增；针对基因变异携带者，所得扩增产物进行pcr及一代测序(sanger测序)结合单体型连锁进行pgt-m检测；针对染色体结构变异携带者，所得扩增产物结合单体型连锁pgt-sr-pgh检测；snp基因型检测获得全部snps信息后，构建胚胎分子核型和家系单体型区分风险染色体；

9、步骤四、废弃配子和/或停育胚胎样本pgt检测，包括：对于基因变异携带者，针对步骤三没有在sanger测序中找到先证者胚胎的情况，提取废弃配子和/或停育胚胎样本的dna，选取人类基因组中与患者突变位点相邻的区域作为目标区域构建引物并进行pcr扩增，对扩增产物进行sanger测序，找到变异携带型的精子、不成熟卵子或停育胚胎，再按照步骤三所述构建单体型；对于染色体结构变异携带者，针对步骤三中没有找到不平衡胚胎的情况，提取废弃配子和/或停育胚胎样本的dna，再按照步骤三所述构建单体型。

10、优选地，步骤二中，单个mⅰ卵子或单个停育胚胎转移至含4ul pbs缓冲液的pcr管中短暂离心处理。

11、优选地，步骤二中，采集单精子的方法包括：对男方新鲜射出的精液进行密度梯度离心后，取沉淀物用g-ivf-plus重悬并稀释，取少量活动精子加入10ul gmops-plus的矿物油液滴中，在倒置显微镜观察下使用icsi注射针吸取单个精子，置于5ul聚乙烯吡咯烷酮(pvp)液滴中并通过机械法制动单个精子，利用icsi注射针将制动的单精子样本转移至另一个gmops-plus液滴中，用油泡做好标记，在体式显微镜下将单精子转移至含4ul pbs缓冲液的pcr管中短暂离心，根据理论上找到配子先证者的概率计算所得最低需检测配子数，预留大于该数目的单精子。

12、作为优选，步骤三中，所得扩增产物直接pcr联合一代测序结合单体型连锁pgt-m检测的方法包括：收集新发突变患者及家属(夫妻双方)的外周血或唾液拭子样本(以外周血为最佳)，提取dna进行质量检测，选取人类基因组中与患者突变位点相邻的区域作为目标区域构建产物并对pcr扩增产物进行sanger测序；对测序数据进行比对和变异检测，筛选与目标位点相关的遗传变异，对目标位点进行连锁分析确定突变位点来源的风险染色体和遗传状态，snp基因型检测获得全部snps信息后，构建胚胎分子核型和家系单体型，分别用于鉴定胚胎全基因组拷贝数变异状况和风险染色体鉴别胚胎基因变异携带状态。

13、作为更优选，步骤三中，针对基因变异携带者构建胚胎分子核型和家系单体型的方法包括：

14、(1)样本基因分型：将患者夫妇双方、携带变异的胚胎样本(先证者胚胎)、和囊胚进行snp基因分型；

15、(2)确定信息snps位点：选择基因变异携带者中为杂合型、其配偶中为纯合型且阳性胚胎参照样本中有效snp位点作为信息snps；对于亲本一方为杂合型(ab)，另一方为纯合型(aa)的snp位点为杂合亲本的有效snp位点，a为纯合有效碱基，b杂合有效碱基，根据胚胎参照样本中的snp位点作为信息snps，构建女方和男方的单体型；进一步分析待测胚胎中是否遗传已知单基因病家系特定基因突变位点的风险染色体或已知染色体特定结构变异的风险染色体，选择覆盖基因变异点区域上的信息snps，染色体每mb范围内至少选择1个信息snp；在覆盖基因变异区域，信息snps常规从变异点上下游2mb范围内选择，如果有效位点少则进一步扩大范围；

16、(3)构建家系单体型：集合步骤(2)确定的信息snps位点，通过家系连锁分析得到覆盖基因变异区域整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合即为家系单体型。

17、作为优选，步骤三中，所得扩增产物结合单体型连锁pgt-sr-pgh检测的方法包括：收集新发染色体结构变异携带患者及配偶的外周血样本，提取dna进行质量检测，通过对胚胎、配子或者废胚进行全基因组拷贝数变异检测，检出不平衡易位或cnv携带的样本，从中确定相关的两个断点位置，对全基因组snp芯片或者二代测序数据进行比对，对目标断点进行连锁分析确定断点区域的来源和遗传状态，snp基因型检测获得全部snps信息后，构建胚胎分子核型和家系单体型，分别用于鉴定胚胎染色体拷贝数状况、区分风险染色体从而鉴别胚胎染色体结构变异携带状态。

18、作为优选，步骤三中，针对染色体结构变异携带者构建胚胎分子核型和家系单体型的方法包括：

19、(a)样本基因分型：将患者夫妇双方、不平衡易位、cnv携带胚胎或囊胚进行snp基因分型；

20、(b)确定信息snps位点：选择结构变异携带者中为杂合型、其配偶中为纯合型且参照样本中为有效snp位点作为信息snps；选择覆盖染色体断裂点、不平衡染色体和与其对应的正常同源染色体上的信息snps，染色体每mb范围内至少选择1个信息snp；在覆盖断裂点区域，信息snps从断裂点上下游2mb范围内选择，如果有效位点少则进一步扩大范围；

21、(c)构建家系单体型：集合步骤(b)确定的信息snps位点通过家系连锁分析得到覆盖两处断裂区域、发生结构变异染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合即为家系单体型。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

23、本发明在预期获得胚胎数少、或存在性腺嵌合、性染色体异常等疑难的无先证者pgt-m/pgt-sr家系中，利用预留配子(精子或第二极体、mi卵子)或停育胚胎(拟行pgt但未能发育到囊胚的胚胎)构建单体型，在不需要额外进行促排卵或二次取精子的基础上，在原本无法进行单体型分析的pgt-m/pgt-sr家系中提高建立单体型的可能性，提高胚胎分析的准确性和把握性，进一步降低出生缺陷或子代生育风险的发生。