一种实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒及快速检测方法与流程

本发明涉及实验动物检测，本发明特别涉及一种实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒及快速检测方法。

背景技术：

1、实验动物是生命科学、医学等众多领域研究的基础条件，其关系到相关研究的准确性、可靠性，同时也涉及到实验操作人员的安全。因此实验动物质量控制至关重要，其中尤为关键的就是实验动物病原微生物的检测。

2、现行的实验动物微生物质量检测方法gb/t14926-2001中针对细菌的检测方法其推荐的是分离培养、生化检测。但是这些方法存在需要进一步改善的空间：耗时长，效率低，操作繁琐，需要有经验的实验操作人员，结检测果易受主观判断影响，可能产生检测批间差。

3、随着实验动物需求量的日益增加，相关机构的生产养殖规模也逐渐扩大，这就更加需要进一步改善。

4、因此为适应实验动物产业的发展，开发一种准确，高效，适合大规模检测的方法是十分必要的。

5、多重pcr是一种理性的方法，其可以在一个体系中对多种病原微生物进行检测，具有高效、快速、简便的优点，近些年有不少关于多重pcr研究及相关应用的文献及专利报道，如cn111518931a公开了一种牛奶中3种致病菌多重pcr诊断试剂盒》，实现了同时检测牛奶种的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌；za202108519b公开了一种用于检测不同念珠菌类型的引物探针组合、试剂盒、检测方法和应用，可同时检测出念珠球菌的不同类型，《兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重 pcr 检测方法的建立》（《实验动物科学》，2023年第4期，10-16页，张贺等）报道了一种同时检测三种病菌的多重pcr方法。

6、上述现有技术检测的细菌种类相对较少，且没有专门针对实验动物检测的研究。

7、上述背景技术是为了便于理解本发明，并非是申请本发明之前已向普通公众公开的公知技术。

技术实现思路

1、针对上述缺陷，本发明提供一种实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒，可以同时检测4种病原菌的的多重pcr方法，检测效率高、耗时短、特异性好，成本低。

2、针对实验动物国家标准要求的微生物检测项目，本发明开发了一种可同时检测四种病原菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌）的多重pcr方法，检测项目多、针对性强、耗时短且成本低，是一种有效的实验动物病原菌检测方法。

3、技术方案是：一种实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒，用于并行检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌，该实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒包括：

4、针对金黄色葡萄球菌的引物对，序列为seq id no15：及seq id no：16；

5、针对沙门氏菌的引物对，序列为seq id no：43及seq id no：44；

6、针对肺炎克雷伯菌的引物对，序列为seq id no：55及seq id no：56；

7、针对绿脓杆菌的引物对，序列为seq id no：83及seq id no：84。

8、进一步地，所述实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒还包括多重pcr酶mix和h2o。

9、进一步地，所述seq id no：15与seq id no：16各自均为0.5-1μl，seq id no：43与seq id no：44各自均为0.1-0.6μl，seq id no：55与seq id no：56各自均为0.1-0.6μl，seqid no：83与seq id no：84各自均为0 .1-0.5μl，多重pcr酶mix为12.5μl。

10、进一步地，所述实验动物为啮齿动物。

11、进一步地，所述啮齿动物为实验小鼠。

12、本发明还提供一种实验动物微生物多重pcr快速检测方法。

13、技术方案是：一种实验动物微生物多重pcr快速检测方法，并行检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌，其特征在于，包括以下步骤：

14、（1）采集并培养处理样本；

15、（2）提取dna；

16、（3）扩增，加入（2）提取的dna液，针对金黄色葡萄球菌的引物对，序列为seq idno：15及seqid no：16；针对沙门氏菌的引物对，序列为seq id no：43及seqid no：44；针对肺炎克雷伯菌的引物对，序列为seq id no：55及seqid no：56；针对绿脓杆菌的引物对，序列为seq id no：83及seqid no：84；

17、（4）电泳；

18、（5）得电泳图。

19、进一步地，所述扩增的条件为：

20、多重pcr酶mix及h2o；

21、反应程序为：

22、a.预变性：94-98℃，3-5min；

23、b.循环延伸：94-98℃，30-45s

24、c.退火温度：55-60℃，30-45s

25、d.循环延伸：70-75℃，30-60s

26、e.循环30-35次

27、f.循环外延伸：70-75℃，5-10min。

28、进一步地，所述电泳的条件为：

29、a.配制凝胶，加热融化后加入溴化乙锭；

30、b.待凝胶凝固后，放入电泳槽中，在加样孔中扩增产物，并在最后一加样孔中加marker；

31、c.电泳仪电泳；

32、d.电泳结束后使用紫外成像仪拍摄凝胶图像。

33、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

34、本发明可以同时检测4种病原菌的的多重pcr方法，其同时检测4种病原菌提高了检测效率同时降低了成本，检测时间较短共2小时，且通过干扰实验证明其检测特异性较好，具有较高的应用价值。

技术特征：

1.一种实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒，用于并行检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌，其特征在于，该实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒包括：

2.根据权利要求1所述的实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒，其特征在于，所述实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒还包括多重pcr酶mix和h2o。

3.根据权利要求2所述的实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒，其特征在于，所述seq id no：15与seq id no：16各自均为0.5-1μl，seq id no：43与seq id no：44各自均为0.1-0.6μl，seq id no：55与seq id no：56各自均为0.1-0.6μl，seq id no：83与seq idno：84各自均为0 .1-0.5μl，多重pcr酶mix为12.5μl。

4.根据权利要求1-3任一项所述的实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒，其特征在于，所述实验动物为啮齿动物。

5.根据权利要求4所述的实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒，其特征在于，所述啮齿动物为实验小鼠。

6.一种实验动物微生物多重pcr快速检测方法，采用权利要求1-5任一项所述的实验动物微生物多重pcr快速检测试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的实验动物微生物多重pcr快速检测方法，其特征在于，所述扩增的反应程序为：

8.根据权利要求6所述的实验动物微生物多重pcr快速检测方法，其特征在于，所述电泳的条件为：

技术总结本发明公开了一种实验动物微生物多重PCR快速检测试剂盒及快速检测方法，属于实验动物检测领域，包括：针对金黄色葡萄球菌的引物对，序列为SEQ ID NO15：及SEQ ID NO：16；针对沙门氏菌的引物对，序列为SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44；针对肺炎克雷伯菌的引物对，序列为SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：56；针对绿脓杆菌的引物对，序列为SEQ ID NO：83及SEQ ID NO：84。本发明可以同时检测4种病原菌的的多重PCR方法，检测效率高、耗时短、特异性好，成本低。技术研发人员：史培良,吴正中,姜颖蕤,辛闻婷,陈曦受保护的技术使用者：成都药康生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18