一种细菌来源的蔗糖合酶突变体

本发明涉及一种细菌来源的蔗糖合酶突变体，属于酶工程。

背景技术：

1、蔗糖合酶(ec 2.4.1.13，sucrose synthase，susy)能催化蔗糖和核苷二磷酸(nucleoside diphosphate，ndp)生成ndp-葡萄糖和果糖，该反应为可逆反应，在ph 5.5-7.5条件下反应向着蔗糖裂解方向进行，在ph 7.5-9.5条件下反应向合成蔗糖方向进行。蔗糖合酶可以催化尿苷磷酸化酶(udp)生成尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)。udpg是一种糖供体，可以在糖基转移酶的催化下生成淀粉、糖原和糖甙等大分子物质，udpg可以经过1-2步简单的生物催化生成其他的尿苷二磷酸-糖，如尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸和尿苷二磷酸-半乳糖等核苷糖。这些核苷糖都是生物中常见的糖供体，对生物的生长发育过程有重要影响，如参与蛋白质的糖基化修饰等。其中利用udpg作为糖供体通过udp-糖基转移酶(udp-glucosyltransferase，ugt)催化合成多种昂贵的糖苷化合物，如人参皂苷rh2、天麻素、莱鲍迪苷d(rebaudioside d，rd)等物质。

2、植物来源的susy催化该反应时，对udp的亲和力远高于其他核苷二磷酸，但其热稳定性较差，在细菌中异源表达困难。细菌来源susy热稳定性较好，在大肠杆菌中异源表达较植物来源的susy更容易，但其对udp的亲和力较低，以udp为底物时，细菌来源的susy比酶活较低，仅为0.11-11u/mg，这制约了细菌来源的susy在工业中高效生产udpg。提高蔗糖合酶对udp的催化活性，可以在更短的时间内合成更多的udpg；提高其稳定性可以增加蛋白的工作时间，实现udpg的低成本生成，进而为活性糖类物质，如莱鲍迪苷d等的合成提供廉价易得的底物原料。

3、2015年diricks等人将嗜乙酰脱硝弧菌来源的蔗糖合酶基因susy克隆到pcxp34h载体上，并在escherichia coli bl21(de3)中实现了成功表达，所述蔗糖合酶susy对adp的亲和力远高于udp，在以adp为底物时比酶活高达125u/mg，但是以udp为底物时比酶活较低，限制了其工业应用。亟需提高以udp为底物时，蔗糖合酶susy的比酶活和其他酶学性能。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种细菌来源的蔗糖合酶突变体，所述突变体为以下任一：

2、(a)将seq id no.1所示的氨基酸序列第633位的赖氨酸替换为精氨酸；

3、(b)将seq id no.1所示的氨基酸序列第632位的甘氨酸替换为天冬氨酸，第633位的赖氨酸替换为精氨酸。

4、本发明的第二个目的是提供编码所述蔗糖合酶突变体的基因。

5、本发明的第三个目的是提供表达所述突变体或携带所述基因的表达载体，以pet28a为载体。

6、本发明的第四个目的是提供携带所述基因或所述表达载体的重组微生物细胞。

7、在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以细菌或真菌为宿主。

8、本发明的第五个目的是提供表达所述蔗糖合酶突变体的重组大肠杆菌，以pet28a(+)为载体，以e.coli bl21为宿主。

9、本发明的第六个目的是提供一种生产所述蔗糖合酶突变体的方法，将表达所述蔗糖合酶突变体的微生物细胞接种于2×yt培养基中，35～37℃培养至od600为0.6～0.8时，加入诱导剂iptg于20℃诱导16～20h。

10、在一种实施方式中，所述方法是将所述重组大肠杆菌接种于含卡那霉素的2×yt表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至od600为0.6-0.8时，加入诱导剂iptg至0.1mm，20℃诱导16～20h，表达蔗糖合酶突变体酶。

11、在一种实施方式中，收集将诱导表达后的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清液使用0.22μm水系滤膜过滤后，用his trap hp柱分离得到蔗糖合酶突变体。

12、本发明的第七个目的是提供所述突变体，或所述基因，或所述表达载体，或所述重组微生物细胞在食品、医药或化工领域生产udpg以及以udpg为底物的活性糖中的应用。

13、有益效果：

14、本发明构建了蔗糖合酶突变体，突变体k633r酶活为76.51u/ml，较野生型提高5.1倍；比酶活为39.92±0.49u/mg，较野生型提高5.2倍；突变体g632d/k633r酶活为72.35u/ml，较野生型提高4.8倍；比酶活为55.41±0.75u/mg，较野生型提高7.28倍。突变体g632d/k633r在55℃处理30分钟后仍有42％以上的残留酶活性，相同处理条件下野生型只剩余12％。相比野生型酶，该突变体酶g632d/k633r的比酶活和热稳定性都有很明显的提高，有利于降低udpg工业生产的成本。

技术特征：

1.一种蔗糖合酶突变体，其特征在于，所述突变体为以下任一：

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.表达权利要求1所述突变体或携带权利要求2所述基因的表达载体。

4.携带权利要求2所述基因或权利要求3所述表达载体的重组微生物细胞。

5.如权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，以细菌或真菌为宿主。

6.表达权利要求1所述蔗糖合酶突变体的重组大肠杆菌，其特征在于，以pet28a(+)为载体，以e.coli bl21为宿主。

7.生产权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，将权利要求6所述重组大肠杆菌于培养基中发酵。

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，发酵液中od600至0.6-0.8时，加入iptg进行诱导表达。

9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述培养基的成分包括蛋白胨、酵母提取物和nacl。

10.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体，或权利要求4或5所述重组微生物细胞在食品、医药或化工领域生产udpg或以udpg为底物的产品中的应用。

技术总结本发明公开了一种细菌来源的蔗糖合酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明的野生型纯酶的比酶活为7.61±0.84U/mg，突变体G632D/K633R的比酶活达55.41±0.75U/mg，相对野生型比酶活提高7.28倍。突变体G632D/K633R在55℃处理30分钟后仍有42％以上的残留酶活性，相同处理条件下野生型只剩余12％。相比野生型酶，该突变体酶G632D/K633R的比酶活和热稳定性都有很明显的提高，有利于实现UDPG的低成本生成，进而为活性糖类物质，如莱鲍迪苷D等的生物合成提供廉价易得的底物原料。技术研发人员：周哲敏,刘中美,李佶珊,雍晨雨,韩来闯,崔文璟,程中一,周丽,郭军玲受保护的技术使用者：江南大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18