一种工程化的翘鳞环锈伞凝集素突变体及其应用

本发明涉及一种具有增强的核心岩藻糖亲和力的工程化翘鳞环锈伞凝集素突变体及其在蛋白核心岩藻糖修饰检测中的应用，属于基因工程。

背景技术：

1、糖类是构成有机体的重要组成之一，在生命活动中发挥着重要的角色。糖基分子可通过氨基酸上的氮（n）原子或氧（o）原子与蛋白质共价结合并延伸形成聚糖，称为蛋白糖基化修饰，根据连接方式的不同可分为o-糖基化修饰和n-糖基化修饰。核心岩藻糖修饰是岩藻糖基以α-1,6键的形式连接在n-糖基化修饰最内侧的n-乙酰葡萄糖胺（glcnac）上的修饰形式。研究表明哺乳动物体内只有岩藻糖基转移酶8（fut8）这一种糖基转移酶可以催化形成核心岩藻糖修饰。

2、核心岩藻糖修饰水平在肿瘤组织中较正常组织呈现显著升高趋势，许多核心岩藻糖修饰的蛋白可作为肿瘤的生物标志物。例如，核心岩藻糖修饰型afp（即甲胎蛋白异质体，afp-l3）作为更可靠的肝细胞癌生物标志物，在2005年被美国食品与药品监督管理局（fda）批准为肝细胞癌的肿瘤标志物。2022年版的原发性肝癌诊疗指南中推荐afp-l3可以作为肝癌早期诊断标志物，特别是对于血清 afp 阴性人群。另有研究报道发现，核心岩藻糖修饰的前列腺特异性抗原（psa）可作为前列腺癌的肿瘤标志物，核心岩藻糖修饰的触珠蛋白(haptoglobin)是胰腺癌潜在的肿瘤标志物。

3、核心岩藻糖修饰对机体免疫系统的调节发挥重要作用。抗体fc段介导的抗体依赖的细胞毒（adcc）效应受到其上n-糖基化修饰的调控，其调控机制是核心岩藻糖修饰可以破坏免疫球蛋白（igg）与fcγiii受体的结合，因而去除抗体的核心岩藻糖修饰可以显著地提高抗体类药物的药效，其在生物医药领域受到广泛重视和应用。在有些情况下，抗体的核心岩藻糖修饰可作为一种保护机制，例如在新生儿同种免疫性血小板减小症（nait）患者血样中发现，其抗体核心岩藻糖修饰仅占抗体总量的10%。另外登革热患者中抗体核心岩藻糖修饰水平低与患严重的溶血性疾病有关。

4、由于构成糖链的糖单体种类多、糖苷键连接方式多样、链的长短不一以及支链结构复杂都增加了聚糖研究的挑战性。大部分糖分子的免疫原性低，针对特定糖链的特异性抗体很难制备，并且存在亲和力低的不足。化学酶标记法可以针对特定糖链进行标记，但操作过程复杂，难以进行临床检测应用的转化。凝集素法是最为常用的糖链检测手段，具有操作简便，适用于不同应用场景的优势。然而天然凝集素与糖链的亲和力弱且具有交叉反应，限制了其在特定糖链检测中的应用。翘鳞环锈伞凝集素（pholiota squarrosa lectin,phosl）是一种迷你型凝集素，全长仅由40个氨基酸组成，糖芯片研究发现phosl凝集素对核心岩藻糖修饰具有更高的选择性，提示其潜在的应用价值。

5、基于聚糖结合蛋白与糖链结合部位的三维结构数据和点突变生化研究以及生物信息学分析显示聚糖结合蛋白的富含电子的芳香族氨基酸侧链和糖链的c-h质子的正电荷之间具有ch-π相互作用，并且该作用是控制据糖蛋白识别中的关键作用。通过非天然氨基酸插入的方法将芳香族氨基酸替换为强给电子的芳香族氨基酸类似物，可提高蛋白与靶分子间的π效应，进而提高其亲和力。此法可用于改善凝集素亲和力低的缺陷。

技术实现思路

1、基于此背景，本发明提供了一种具有增强的核心岩藻糖亲和力的工程化翘鳞环锈伞凝集素突变体，所述翘鳞环锈伞凝集素突变体为野生型凝集素第28位色氨酸（w28）替换为甲氧基侧链基团取代的强给电子的色氨酸类似物的凝集素变体，所述野生型翘鳞环锈伞凝集素的氨基酸序列为：apvpvtklvcdgdtykctayldfgdgrwvaqwdtnvfhtg，如seq id no.1所示。

2、基于聚糖结合蛋白与糖链结合部位的三维结构数据和生物信息学分析发现，phosl第28位色氨酸（w28）的侧链芳香环与糖链的ch基团形成稳定的ch-π相互作用，点突变生化研究显示w28位点在phosl与核心岩藻糖修饰底物的结合中起到关键作用。

3、通过将翘鳞环锈伞凝集素第28位色氨酸侧链芳香环通过非天然氨基酸插入的方法进行强给电子的甲氧基侧链基团取代，有效提高了第28位色氨酸（类似物）的侧链芳香环与糖链ch基团的ch-π相互作用，提高了翘鳞环锈伞凝集素对蛋白核心岩藻糖的亲和力。

4、具体的，所述翘鳞环锈伞凝集素突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、具体的，所述强给电子的色氨酸类似物选自5-甲基-色氨酸、5-甲氧基-色氨酸、6-甲基-色氨酸、6-甲氧基-色氨酸、7-甲基-色氨酸、7-甲氧基-色氨酸或6，7-甲氧基-色氨酸中的一种。

6、优选的，所述强给电子的色氨酸类似物选自5-甲氧基-色氨酸（a1）、6-甲氧基-色氨酸（a2）、7-甲氧基-色氨酸（a3）或6，7-甲氧基-色氨酸（a4）中的一种，以上色氨酸类似物a1-a4结构式为：

7、

8、。

9、本发明还提供了一种所述翘鳞环锈伞凝集素突变体的制备方法，包括如下步骤：

10、（1）构建表达载体：根据seq id no.1所示的氨基酸序列设计野生型phosl密码子序列，合成双链dna，将其克隆至质粒载体，构建野生型phosl表达质粒；以所述野生型翘鳞环锈伞凝集素表达质粒为模板，利用定点突变的方法将编码w28的密码子突变成琥珀密码子（tag），构建突变型翘鳞环锈伞凝集素表达质粒；将突变型翘鳞环锈伞凝集素表达质粒与对应的苯丙酰氨-trna合成酶质粒共同转化至dh10b感受态细胞中，使用50 µg/ml卡那霉素和100 µg/ml氨苄青霉素双抗性lb平板筛选双阳性克隆，得到重组菌；挑取单克隆培养过夜，培养基中添加50 µg/ml卡那霉素和100 µg/ml氨苄青霉素。

11、（2）蛋白表达和纯化，将过夜培养的菌液接种到培养基中，在37℃下培养，向培养液中加入非天然色氨酸，阿拉伯糖和氯化锌以诱导蛋白表达;

12、所述非天然色氨酸为5-甲基-色氨酸、5-甲氧基-色氨酸、6-甲基-色氨酸、6-甲氧基-色氨酸、7-甲基-色氨酸、7-甲氧基-色氨酸或6，7-甲氧基-色氨酸中的一种。

13、通过离心方法收集表达的蛋白质，对细胞进行裂解和破碎，取上清液与纯化琼脂糖珠在4℃条件下孵育，随后转移到层析柱进行亲和层析，洗脱目的蛋白，然后进行超滤浓缩，得到纯化的翘鳞环锈伞凝集素突变体。

14、优选的，所述蛋白表达步骤中向培养液中添加的非天然色氨酸选自5-甲氧基-色氨酸（a1）、6-甲氧基-色氨酸（a2）、7-甲氧基-色氨酸（a3）或6，7-甲氧基-色氨酸（a4）中的一种，以上色氨酸类似物a1-a4结构式为：

15、

16、。

17、本发明还提供了一种所述翘鳞环锈伞凝集素突变体的应用，用于包括但不限于细胞裂解液、活细胞表面、组织和血清样本中核心岩藻糖修饰的检测，该检测方法基于所述凝集素变体与包括但不限于与生物素、链霉亲和素、辣根过氧化物酶或与荧光基团偶联，在目标样本中可检测蛋白核心岩藻糖修饰，并生成可靠的标记信号。

18、作为本发明的一种优选应用，用于样本细胞或裂解液中的蛋白核心岩藻糖修饰检测，包含如下步骤：将所述的翘鳞环锈伞凝集素突变体与标记物生物素在室温下进行偶联，得到生物素标记的凝集素突变体；将样本细胞或裂解液在缓冲液中与生物素标记的凝集素突变体在4℃下进行孵育，再与偶联了链霉亲和素的辣根过氧化物酶在室温下进行孵育；用缓冲液清洗后，使用ecl发光底物检测偶联了标记物的蛋白核心岩藻糖修饰的标记信号。

19、具体的，将所述翘鳞环锈伞凝集素突变体用于细胞裂解液中核心岩藻糖修饰蛋白的标记和检测方法，包括如下步骤：培养样本细胞，加入裂解液裂解细胞，收集裂解后的细胞到离心管中，并将其超声破碎，离心，取上清至新的离心管；将蛋白浓度调整到4 mg/ml，加入上样缓冲液，震荡混匀，100℃煮5-10分钟，分离蛋白样品，转至pvdf膜上；用5%脱脂牛奶室温封闭1小时；在4℃条件下，与生物素偶联的突变型凝集素（用3% bsa稀释至终浓度200 ng/ml）孵育过夜；用缓冲液清洗pvdf膜后，将膜置于5%脱脂牛奶稀释的辣根过氧化物hrp偶联的链霉亲和素中室温孵育1小时；用缓冲液清洗pvdf膜后，使用ecl发光底物检测标记信号。

20、作为本发明的一种优选应用，本发明还提供了所述翘鳞环锈伞凝集素突变体在活细胞表面核心岩藻糖修饰的标记和检测方面的应用，所述活细胞表面核心岩藻糖修饰的标记和检测的方法，包括如下步骤：

21、将所述的翘鳞环锈伞凝集素突变体与异硫氰酸荧光素在37℃下进行偶联，得到异硫氰酸荧光素标记的翘鳞环锈伞凝集素突变体；将样本细胞铺在细胞爬片上，在37℃培养箱中培养，在缓冲液中与异硫氰酸荧光素偶联的翘鳞环锈伞凝集素突变体于37℃下孵育，用pbs清洗，室温条件下染细胞核，用pbs清洗，将爬片取出，倒置在载玻片上封片，使用激光共聚焦显微镜检测标记了荧光素的蛋白核心岩藻糖修饰的荧光信号。

22、本发明的有益效果为：

23、（1）工程化翘鳞环锈伞凝集素突变体相比野生型翘鳞环锈伞凝集素对核心岩藻糖修饰底物的亲和力显著增强，通过将翘鳞环锈伞凝集素第28位色氨酸侧链芳香环进行强给电子的甲氧基侧链基团取代，有效提高了第28位色氨酸（类似物）的侧链芳香环与糖链的ch基团的ch-π相互作用，提高了翘鳞环锈伞凝集素对蛋白核心岩藻糖的亲和力，体现在①ch-π相互作用的值较野生型的显著增强，从野生型的1.6上升到1.9；②解离常数kd值较野生型的显著降低，从野生型的1.52±0.21 µm降低到0.60±0.14 µm。

24、（2）应用方面，工程化翘鳞环锈伞凝集素突变体相比野生型翘鳞环锈伞凝集素在核心岩藻糖修饰蛋白的检测上灵敏度更高，体现在①细胞裂解液中核心岩藻糖修饰蛋白检测信号比野生型增强2倍；②活细胞表面核心岩藻糖修饰糖链的检测信号比野生型增强2.5倍。