富集外泌体的方法及该方法所采用的缀合物与流程

本发明大体涉及生物检验，具体而言，涉及一种富集外泌体的方法及该方法所采用的缀合物。

背景技术：

1、外泌体是一类纳米级的膜性囊泡，含mrnas、mirnas、蛋白质及脂类物质等，并且膜上也有信号分子(cd63、cd9等)。目前普遍认为的外泌体所共有的蛋白包括热休克蛋白、四跨膜蛋白家族、多囊泡胞内体产生相关蛋白(alix、tsg101等)、gtp酶rab家族等，这些成分多与外泌体的形成与起源有关。外泌体在肿瘤微环境中含量尤其丰富，与肿瘤的发生发展、免疫逃逸、微环境建立密切联系；此外还在组织损伤修复、免疫抗原呈递及神经退行性疾病中起着极其重要的作用。因此，临床中常常采用分离病患特殊部位的外泌体来对特定疾病进行检测，特别是癌症、心血管疾病以及神经系统疾病。同时，外泌体作为疾病治疗药物运送载体的研究也在不断发展。

2、外泌体广泛存在于体液(血清、脑脊液等)、分泌物(唾液、乳汁、精液等)及排泄物(尿液等)中。从各种样品中分离鉴定外泌体，对于后期的实验研究是至关重要的。

3、现有的外泌体分离方法主要有差速超速离心法、沉淀法、超滤法、亲和层析法等。其中，亲和层析法能够很方便地从血清等样品中获得高纯度的外泌体和其他来自细胞培养基和体液的胞外囊泡。在过去的二十年中，几种四跨膜蛋白，尤其是cd63、cd81和cd9已被用作外泌体的标志物而应用到外泌体的亲和层析之中，因为与全细胞裂解物相比，它们在小ev中的积累，以及cd63在mvb中的稳态积累。然而，最近已经观察到它们在其他ev中的存在。通过捕获特异携带cd63或cd9或cd81的ev，然后分析它们的蛋白质组成和内体标志物的富集，研究提出仅含有cd9或cd81而不含cd63的ev可能不会在内体中形成(因此是ectosomes)，而那些携带cd63与一个或两个其他四跨膜蛋白的可能对应于内体衍生的外泌体。这一观察结果表明cd63可能是更为特异的外泌体标志物。但是，现有技术中所采用的基于cd63抗体的亲和纯化外泌体的方法仍存在亲和力不佳的问题，因而不能很好地应用于外泌体的纯化中。

技术实现思路

1、本发明涵盖如下技术方案：

2、本发明一方面涉及用于外泌体纯化的缀合物，其由cd63抗体或其抗原结合片段与基体支持物缀合所形成；

3、其中，所述cd63抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3依次为seq id no:1～3所示，所述抗体或其抗原结合片段的轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3依次为seq id no:4～6所示。

4、本发明的另一方面涉及层析分离装置，其含有如上所述的缀合物。

5、本发明的再一方面涉及试剂盒，其含有如上所述的缀合物。

6、本发明的再一方面涉及富集外泌体的方法，其包括：

7、i)将含有外泌体的组合物与如上所述的缀合物共孵育；以及

8、ii)洗去非特异性结合的杂质。

9、本发明所提供的缀合物，其采用的cd63抗体具有很高的亲和力，纯化效率高，在外泌体纯化中具有很好的应用前景。

技术特征：

1.用于外泌体纯化的缀合物，其特征在于，其由cd63抗体或其抗原结合片段与基体支持物缀合所形成；

2.根据权利要求1所述的外泌体纯化的缀合物，其特征在于，所述cd63抗体或其抗原结合片段的具有seq id no:7所示的重链可变区hcvr和seq id no:8所示的轻链可变区lcvr。

3.根据权利要求1或2所述的外泌体纯化的缀合物，其特征在于，所述基体支持物包括玻璃、琼脂、琼脂糖、琼脂糖衍生物、磁珠、二氧化硅、二氧化钛、藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、葡聚糖、淀粉、环糊精、壳聚糖、角叉菜胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、印度胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、肝硫酯和明胶、硅、陶瓷、玻璃、聚氨酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇对苯二甲酸酯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的任一种，或任意几种形成的共聚物或混合物。

4.根据权利要求3所述的外泌体纯化的缀合物，其特征在于，所述基体支持物是spe固相萃取柱、带分离膜的离心管、ep管、分离膜、微量反应板凹孔、微球、柱状体、片状物或多孔板。

5.层析分离装置，其特征在于，含有权利要求1～4任一项所述的缀合物。

6.试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～4任一项所述的缀合物。

7.富集外泌体的方法，其特征在于，包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述组合物来源于动物，优选人类。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述组合物衍生自肿瘤细胞或病原体感染的细胞；

10.根据权利要求7～9任意一项所述的方法，其特征在于，所述组合物在基本上不破坏外泌体形态学特征或功能特征或者细胞表面抗原的条件下被分离。

技术总结本发明大体涉及生物检验技术领域，具体而言，涉及一种富集外泌体的方法及该方法所采用的缀合物。缀合物，其由CD63抗体或其抗原结合片段与基体支持物缀合所形成；其中，所述CD63抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3依次为SEQ ID NO:1～3所示，所述抗体或其抗原结合片段的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3依次为SEQ ID NO:4～6所示。本发明所提供的缀合物具有很高的亲和力，纯化效率高，在外泌体纯化中具有很好的应用前景。技术研发人员：牟春琳,武嘉钊,张雅楠,张瑞,李爱爱受保护的技术使用者：华域生物科技（天津）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/7/18