一种能够在酿酒酵母体内生物合成1,4-二羟基-2-萘甲酸的构建方法

本发明属于基因工程和生物代谢，更具体的说是设计同源片段并导入酿酒酵母 saccharomyces cerevisiae by4742以改造酿酒酵母的代谢通路，使其能够生物合成1,4-二羟基-4-萘甲酸（dhna）。

背景技术：

1、基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和dna重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，使外源基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

2、在众多模式微生物中，酿酒酵母（ saccharomyces cerevisiae）因其强大的遗传工具以及菌株的gras（generally regarded as safe）状态适合大规模的操作而被广泛用于生物技术行业。与原核生物不同，酿酒酵母作为模式真核生物具有多个细胞器，可以为生物合成提供不同的环境和区室，而且可以表达原核生物不能表达的酶，如细胞色素p450酶等。此外，酿酒酵母对苛刻的工业条件也表现出很高的耐受性。因此，酿酒酵母已被开发为用于代谢工程改造生产来自细菌、真菌和植物物种的天然产物的平台微生物。

3、目前，以酿酒酵母作为宿主进行代谢工程改造的技术已经在生产特定燃料，化学物质和药物，如游离脂肪酸、脂肪酸乙酯、脂肪醇和烷烃等脂肪酸和其衍生物；具有重要商业应用价值的萜类化合物，包括被广泛用作香水成分、食品香料、药剂和杀虫剂的单萜类化合物（如：香叶醇、芳樟醇、薄荷醇、熏衣草花醇等）；倍半萜类化合物（如用作香料的橙花叔醇、法尼醇、广藿香醇、抗疟疾的药物青蒿素、抗真菌剂辣椒素、作为生物燃料的法呢烯和红没药烯等）；二萜类化合物（如用于化妆品行业中的香紫苏醇、鼠尾草酸以及抗癌症药物紫杉酚等）；三萜类化合物，（如角鲨烯、氢化可的松等）；四萜类化合物（如β胡萝卜素、番茄红素等）；丁醇异构体和药物蛋白等方面取得了很大的进展。

4、维生素k统称为一组脂溶性化合物，含有2-甲基-1，4-萘醌部分，但在3位的类异戊二烯侧链结构不同。维生素k天然以两种形式存在，叶醌和一系列甲萘醌（包括mk-4,mk-7等），这两种物质都在止血中起重要作用。1,4-二羟基-4-萘甲酸是mk-7的前体，利用酿酒酵母生物合成，为未来在酿酒酵母中生物合成mk-7提供重要影响。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的问题，本发明提出如下技术方案：

2、一种生物合成1,4-二羟基-2-萘甲酸酿酒酵母菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：在基础质粒puc19（seq id no.1）上构建同源臂片段，通过无缝克隆的方式将编码生物合成dhna的目的基因连接到puc19（seq id no.1）上，获得质粒p1，p2，p3，p4，p6，p7，通过聚合酶链式反应获得片段f1，f2，f3，f4，f6，f7，利用常规的酵母转化方法将6个片段转入酿酒酵母 saccharomyces cerevisiae by4742中，获得一株能够生物合成1,4-二羟基-2-萘甲酸（dhna）的工程菌株。所述重组工程菌株构建方法。

3、所述重组工程菌株构建方法p1质粒含有来源于酿酒酵母 saccharomyces  cerevisiae by4742的delta位点上游基因片段delta-up（seq id no.9），启动子ptdh1（seqid no.13），终止子ttef1（seq id no.14）和启动子ptef1部分片段（200 bp）；含有来源于大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr. mg1655的编码异分支酸合酶基因entc（seqid no.2）。

4、所述重组工程菌株构建方法p2质粒含有来源于酿酒酵母 saccharomyces  cerevisiae by4742的启动子ptef1（seq id no.15），终止子tpgk1（seq id no.16），终止子ttef1部分片段（202 bp）和启动子ppgk1部分片段（200bp）；含有来源于大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr. mg1655的编码2-丁酰基-5-烯醇丙酮酸-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸合酶mend（seq id no.3）。

5、所述重组工程菌株构建方法p3质粒含有来源于酿酒酵母 saccharomyces  cerevisiae by4742的启动子ppgk1（seq id no.17），终止子tcyc1（seq id no.18），终止子tpgk1部分片段（199 bp）和终止子ttef（seq id no.22）；含有来源于 saccharomyces  cerevisiae s288c的编码亮氨酸的leu2（seq id no.21）基因；含有来源于大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr. mg1655的编码2-丁酰基-6-羟基2,4-环己二烯-1-羧酸合酶menh（seq id no.4）。

6、所述重组工程菌株构建方法p4质粒含有来源于酿酒酵母 saccharomyces  cerevisiae by4742的delta位点下游基因片段delta-down（seq id no.10），启动子ptef1（seq id no.15），终止子ttpi1（seq id no.19）；含有来源于 saccharomyces cerevisiaes288c的编码亮氨酸的lue2（seq id no.21）部分基因（200bp），启动子pleu2（seq idno.20）；含有来源于大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr. mg1655的编码邻琥珀酰苯甲酸合成酶menc（seq id no.5）。

7、所述重组工程菌株构建方法：p6质粒含有来源于酿酒酵母 saccharomyces  cerevisiae by4742的rdna位点下游基因片段rdna-down（seq id no.12），启动子ppgk1（seq id no.17），终止子tcyc1（seq id no.18），终止子ttpi1（seq id no.19）；含有来源于prs413质粒的编码组氨酸的his3基因；含有来源于大肠杆菌 escherichia coli str. k-12  substr. mg1655的编码邻琥珀酰苯甲酸辅酶a连接酶基因mene（seq id no.8）。

8、所述重组工程菌株构建方法p7质粒含有来源于酿酒酵母 saccharomyces  cerevisiae by4742的rdna位点上游基因片段rdna-up（seq id no.11），启动子ptdh1（seqid no.13），终止子ttef1（seq id no.14），启动子ptef1（seq id no.15），终止子tpgk1（seqid no.16）；含有来源于prs413（seq id no.23）质粒的编码组氨酸的his3部分基因（200bp），启动子phis3；含有来源于蓝细菌 synechocystis sp. pcc 6803编码1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶a合酶基因sll1127（seq id no.6）,编码1,4-二羟基-2-萘基辅酶a水解酶基因slr0204（seq id no.7）。

9、所述重组工程菌株构建方法通过对p1，p2，p3，p4质粒进行聚合酶链式反应获取片段f1，f2，f3，f4，导入野生型酿酒酵母 saccharomyces cerevisiae by4742，形成1株酿酒酵母工程菌bd-0。

10、所述重组工程菌株构建方法通过对p6，p7质粒进行聚合酶链式反应获取片段f6，f7，导入酿酒酵母工程菌bd-0，形成1株酿酒酵母工程菌bd-2。

11、所述重组工程菌株构建方法利用摇床摇瓶培养，分光光度计测量od600，高效液相色谱仪(hplc)测量dhna的产量。

12、本发明为了能够在酿酒酵母内生物合成1,4-二羟基-2-萘甲酸（dhna），通过异源表达技术，结合基因工程等手段，将dhna代谢路径关键基因引入酿酒酵母 saccharomyces  cerevisiae by4742构建工程菌，获得的工程菌bd-2。

13、本发明构建6种质粒，以酿酒酵母 saccharomyces cerevisiae by4742为底盘宿主菌，将从6种质粒上通过聚合酶链式反应获得片段转入宿主菌，构建dhna的代谢通路，使得酿酒酵母能够合成dhna，为未来在酿酒酵母中生物合成mk-7提供前体。

14、以puc19（seq id no.1）为基础质粒构建6种重组质粒，通过无缝克隆方式依次将目的基因连接，分别包括：

15、质粒p1：puc19-delta-up-ptdh1-entc-ttef1-ptef1（部分）

16、质粒p2：puc19-ttef1（部分）-ptef1-mend-tpgk1-ppgk1（部分）

17、质粒p3：puc19-tpgk1（部分）-ppgk1-menh-tcyc1-ttef-leu2

18、质粒p4：puc19-leu2（部分）-pleu2-ttpi1-menc-ptef1-delta-down

19、质粒p6：puc19-his3-ttpi1-tcyc1-mene-ppgk1-rdna-down

20、质粒p7：puc19-rdna-up-ptdh1-sll1127-ttef1-ptef1-slr0204-tpgk1-phis3-his3（部分）

21、通过聚合酶链式反应获得片段，分别包括：

22、片段f1：delta-up-ptdh1-entc-ttef1-ptef1（部分）

23、片段f2：ttef1（部分）-ptef1-mend-tpgk1-ppgk1（部分）

24、片段f3：tpgk1（部分）-ppgk1-menh-tcyc1-ttef-leu2

25、片段f4：leu2（部分）-pleu2-ttpi1-menc-ptef1-delta-down

26、片段f6：his3-ttpi1-tcyc1-mene-ppgk1-rdna-down

27、片段f7：rdna-up-ptdh1-sll1127-ttef1-ptef1-slr0204-tpgk1-phis3-his3（部分）

28、dhna生物合成途径关键基因：

29、entc（seq id no.2）：来自大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr.mg1655的异分支酸合酶基因

30、mend（seq id no.3）：来自大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr.mg1655的2-丁酰基-5-烯醇丙酮酸-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸合酶基因

31、menh（seq id no.4）：来自大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr.mg1655的2-丁酰基-6-羟基2,4-环己二烯-1-羧酸合酶基因

32、menc（seq id no.5）：来自大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr.mg1655的邻琥珀酰苯甲酸合成酶基因

33、sll1127（seq id no.6）：来自蓝细菌 synechocystis sp. pcc 6803的1,4-二羟基-2-萘酰基-辅酶a合酶基因

34、slr0204（seq id no.7）：来自蓝细菌 synechocystis sp. pcc 6803的1,4-二羟基-2-萘基辅酶a水解酶基因

35、mene（seq id no.8）：来自大肠杆菌 escherichia coli str. k-12 substr.mg1655的邻琥珀酰苯甲酸辅酶a连接酶基因